采用酶消化法与密度梯度分离法从Lewis大鼠中分离与纯化胰岛组织

我们的研究致力于开发一种标准化的高通量Lewis大鼠虹膜环分离方案，以优化产量、纯度、存活率及功能持续时间。现有方法获得的虹膜环纯度不一且寿命较短。本方案通过标准化消化、纯化和 pooling 步骤，提高了实验结果的一致性和组织存活时间。

首先，将一只已处死的大鼠置于显微镜下。使用皮肤剪从耻骨联合处开始，向两侧肋骨方向做V形切口，以暴露腹腔。用平头镊子将小肠和大肠向动物左侧牵拉，以清理腹腔操作区域。

然后使用平头镊子和弯止血钳展开上段十二指肠。确保胆总管和肝门静脉位于视野范围内。现在用弯止血钳将肝脏向头侧方向牵拉。

在距肝脏一到两毫米处夹闭胆总管和肝静脉。在显微镜视野下，使用平头镊子和平头止血钳，轻柔地移动十二指肠内的内容物，以暴露奥迪括约肌。然后在奥迪括约肌两侧各约五毫米处轻柔地夹闭十二指肠，以隔离其周围区域。

确保最小程度的压缩，以保持组织完整性。将装有无菌WDM的注射器针头小心地通过十二指肠壁插入，穿过括约肌本体，并推进至主胰管，以进行灌注。

在保持恒定压力的同时，以每秒约500微升的速度向胰腺灌注7至10毫升的WDM，直至胰腺完全膨胀。现在，从十二指肠上取下两个平头止血钳。然后从脾脏、胃、大肠、十二指肠及肠系膜等周围结构开始，轻柔地分离并游离胰腺。

用平头镊子轻轻提起灌注过的胰腺，并用精细解剖剪剪断任何残留的结缔组织连接。立即将切除的胰腺转移至含有冰冻冲洗液的培养皿中，并在清洗该胰腺的同时继续采集下一个胰腺。清洗胰腺时，使用一对精细弯头镊子和精细解剖剪，小心去除灌注胰腺上可能存在的淋巴结、脂肪组织、肠系膜以及大血管。

将清洗后的胰腺转移至一个无菌的600毫升烧杯中，烧杯内含25毫升冷WDM。用无菌铝箔覆盖烧杯，以在从手术操作区转移至细胞培养操作区的过程中保持无菌状态。将烧杯放入设定为130转/分钟的轨道摇床水浴中，振荡10分钟。

在5分钟时间点，手动顺时针摇动烧杯，然后逆时针摇动，以促进组织解离。在10分钟时间点，迅速将烧杯转移并浸入冰中，以减缓酶活性。随后向烧杯中的溶液加入等体积的终止缓冲液，以停止消化反应。

使用带有14号脊椎穿刺针的50毫升注射器，轻柔地反复抽吸和排出组织悬液，以解离较大的组织碎片。将悬液转移至200毫升锥形管中。离心悬液后，小心弃去上清液，并将沉淀物重悬于100毫升洗涤培养基中。

现在将悬液通过置于无菌600毫升烧杯上的无菌500微米筛网过滤，以去除未消化的大块组织。将滤液转移至新的200毫升锥形管中，然后再次离心。进行眼状体纯化时，使用预先润湿的10毫升血清移液管，每2毫升沉淀体积加入15毫升梯度溶液重悬各组织沉淀。

轻柔混匀直至悬浮液均匀。小心地将15毫升细胞悬浮液加入每个50毫升锥形管底部，避免接触管壁，以确保形成清晰的梯度。然后使用注射泵以每分钟5毫升的速度向每个梯度管中加入10毫升溶液，同时将16号针头尖端紧贴管内壁，防止混合。

离心管后，识别位于梯度层界面处的眼状层。使用带滤芯的移液枪吸取眼状层，将收集的眼状层转移至预冷的含有5毫升洗涤液的200毫升锥形管中。用洗涤液定容至200毫升，并进行以下洗涤和离心步骤。

然后将眼状体均匀接种到未经组织培养处理的100毫米培养皿中，每处理五个胰腺使用一个培养皿。在本次分离实验中，每个胰腺可获得3,330个眼状体当量，眼状体中位直径位于50至100微米区间。自动测量共得到总计98,832个对象，其数量与第0天人工测定的眼状体当量数高度相关。

根据第1天的双硫腙染色，内分泌纯度约为98.56%。第1天的刺激指数为9.37，第3天为8.34，第7天为6.7，各时间点之间无显著差异。该方法可用于研究胰岛移植、β细胞功能、糖尿病逆转、胰岛封装以及胰岛与免疫系统或微环境之间的相互作用。

该方案适用于需要高纯度Lewis大鼠胰岛的临床前移植、糖尿病建模、包封研究以及体外功能检测。