Name: 利用酶促消化和密度梯度分离方法，从刘易斯鼠中分离胰岛 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T12:53:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 了解利用酶促消化和密度梯度离心技术从Lewis大鼠中分离高纯度胰岛的标准化方案。该方法可优化产量、存活率和功能稳定性，适用于糖尿病研究和移植实验。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01DK133610-01（A.G.，N.K.）和 NIH NIDDK R01DK132104（A.G.）、Breakthrough T1D SRA-2021-1078-S-B（A.G.）及 SRA-2022-1224-S-B（A.G.，N.K.），以及 Vivian L. Smith 基金会资助。

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A.G. 是 Continuity Biosciences, LLC 的联合创始人兼首席科学顾问。A.G.、J.P-M. 和 C.Y.X.C. 是由 Continuity Biosciences, LLC 获得许可的知识产权的发明人。其他所有作者声明无竞争利益。

本方案概述了一种从Lewis大鼠中分离和纯化胰岛的高通量方法。该方法的成功依赖于若干关键步骤，这些步骤共同维持胰岛的完整性和功能。其中主要包括胰腺的精确且完整的导管内灌注、灌注后胰腺的仔细清洗，以及准确的酶消化时间。稳定且完整的全器官灌注对于实现胰腺的均匀膨胀至关重要，并可确保胶原酶-嗜热菌蛋白酶-DNase混合物的均匀分布，这三种酶分别用于消化细胞外基质、增强酶的渗透性，以及降低DNA介导的黏度21,22。灌注不足会导致组织消化不完全，并造成大量胰岛丢失，因为未充分消化的组织会在筛网过滤时被去除。同样，在消化前未能充分去除脂肪或血管组织，可能引入非内分泌杂质，从而降低纯度。此外，消化时间过长会导致细胞外基质过度降解，引起胰岛解聚；而消化不足则会产生对脊髓针机械消化具有抗性的未消化组织。上述步骤是实验中最常见的技术难点，在培训和优化过程中应予以严密监控。
尽管该方法是专为Lewis大鼠设计的，但通过略微重新优化消化时间与酶的比例，很可能可将其适用于其他品系或物种23,24,25,26。某些实验室可根据所用酶批次或组织特性的具体情况，选择调整工作解离液（WDM）中胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I的比例，以优化收获率。为此，实验室应严格遵循生产商提供的酶与组织优化分步指南，并在所有情况下避免添加0.1 M EDTA、半胱氨酸、巯基乙醇、蛋白酶抑制剂、血清或白蛋白等成分，因为这些物质可能抑制胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I的酶活性27。尽管目前尚未发表酶混合液在解离前的确切有效作用时间，但已有数据表明，胰腺长时间低温保存会不利地影响胰岛的产量和功能28。根据经验，我们发现，在本方案中，当总冷缺血时间（定义为将第一个胰腺置于冰上清洗至转移至37 °C水浴的时间间隔）控制在1.5小时以内时， consistently 能够成功分离胰岛。该参数的进一步优化可能需根据最终应用需求而定。
尽管该方案具有较强的稳健性，但仍存在若干实际和技术上的局限性。首先，酶混合物（胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I）以及密度梯度对于实现高效的组织解离和胰岛分离至关重要，但其成本较高。我们选择该酶组合是基于胰腺细胞外基质的结构特征，并需在有效解离组织与维持胰岛完整性之间取得平衡。每种酶组分均发挥特定作用：胶原酶靶向纤维状胶原和基底膜胶原，以释放胰岛；嗜热菌蛋白酶作为一种中性蛋白酶，可切割非胶原基质蛋白和细胞间黏附分子，从而减少对胶原酶暴露的需求；DNase I则可降低因细胞裂解释放DNA所导致的黏稠度29,30,31。尽管市面上已有成本较低的消化酶制剂，但其纯度不稳定，可能影响酶活性13,23。由于胶原酶来源于细菌培养，额外的纯化步骤虽可降低内毒素污染，但会显著增加成本13,23。
对于胶原酶，我们推荐使用每瓶活性约为 2,000 至 4,000 Wünsch 单位的制剂，可在中等剂量下实现有效解离，同时避免消化时间过长。值得注意的是，该酶混合物应包含适当比例的胶原酶 I 型与 II 型，即胶原酶 II / 总胶原酶的比例约为 0.3–0.5。此比例可提供较强的胶原蛋白水解活性，同时限制对非胶原性细胞外基质的过度降解。此外，胶原酶混合物还应含有适量的中性蛋白酶活性（约 150,000–250,000 单位）以及 DNase，原因前文已述。
从质量控制的角度来看，每批酶应提供相关文件，证明其内毒素含量低（≤50 EU/mg 蛋白质）、酶纯度高（通过 HPLC 测定 ≥85%），并经过批次间活性验证，因为不同生产商的酶纯度和组分可能存在显著差异。最后，批次间组分的差异可能影响消化的一致性和胰岛得率，因此必须对每批酶进行内部特异性验证。该验证可通过遵循本方案中所述的标准消化条件，随后评估消化效率和胰岛形态来完成。酶性能不佳的指标包括组织解离不完全、胰岛边界不规则或粗糙，或需要过度机械剪切才能实现分离；在此情况下，可能需要对消化时间进行滴定优化。
密度梯度的选择也需考虑类似因素。我们选用了一种基于多聚蔗糖的梯度介质，这是一种非离子型、高度亲水的蔗糖-表氯醇共聚物，可形成最高达1.2 g/mL的稳定梯度，并在胰岛分离中具有长期应用历史32,33。碘克沙醇是一种经过充分验证的替代方案，针对人胰岛的研究表明，基于碘克沙醇的梯度可提高胰岛回收率，同时维持其活力与功能34,35,36,37。然而，在啮齿类动物中的研究结果尚不一致，部分研究报道使用碘克沙醇效果更优，而其他研究则显示基于多聚蔗糖的梯度在活力和功能方面表现更佳32,35。关键的是，建议使用商业化生产且经过质量控制的梯度溶液，以提高不同实验室之间的可重复性。基于多聚蔗糖的梯度介质已有市售产品，其密度适用于胰岛分离；而碘克沙醇梯度通常需实验室自行稀释配制，可能引入额外的变异性。第二个局限性在于，手术取材需要较高的技术水平，特别是经欧氏括约肌进行导管内灌注以及快速切除胰腺的操作。即使轻微的延迟或操作偏差也可能导致组织损伤、泄漏、灌注不均或延长的热缺血时间，从而影响胰岛的产量和活力。为减轻这一局限性，本方案包含了详细的步骤描述，并配有原创的彩色解剖标志图示，以帮助理解。建议新操作者在开展完整分离操作前，先熟练掌握灌注技术，并建议在实际活体取材前先在尸体标本上进行练习。
第三，为了实现最高效率，本方案需要协调的团队合作。在胰腺采集和酶消化过程中，通常需要三名经过培训的操作人员：一人进行无菌手术，一人在无菌条件下清理胰腺，另一人则在非无菌条件下负责动物的循环与安乐死。完成消化后，一旦操作熟练，后续的纯化步骤通常可由较少的操作人员完成。尽管这种协调工作在初期存在一定的后勤要求，但它能够在相对较短的时间内从多只动物中分离出大量胰岛，相较于协调性较差的工作流程，整体通量更高。尽管本方案在技术上要求较高且资源消耗较大，但这些局限性在所有胰岛分离方法中均普遍存在。通过强调标准化的消化条件、系统化的培训以及协调一致的操作，这种高通量方法可在训练有素的团队执行时，降低每次分离所需的时间和劳动投入，并获得稳定、可重复的结果。
与传统的啮齿类胰岛分离方案相比，该方法在通量、可重复性和一致性方面具有显著优势。传统的单器官消化方法严重依赖手工挑选，且常导致纯度不稳定13相比之下，我们的方案采用混合消化和密度梯度纯化方法，显著缩短了制备时间，降低了样本间差异，同时保持了胰岛的高存活率和功能响应性。分离得到的胰岛通过形态学（二苯硫腙染色）、存活率（活/死细胞检测）和功能（葡萄糖刺激的胰岛素分泌）进行了全面表征，验证了该方法的可靠性。总体而言，这一标准化操作流程能够制备出数量充足、纯度高且功能完整的胰岛，适用于后续多种应用，包括包封、移植和微生理系统建模38,39,40重要的是， 采用该技术分离的Lewis大鼠胰岛已在临床前模型中逆转糖尿病，凸显了这种可重复且可扩展方法的转化应用价值41.

胰岛移植是一种可行的策略，可恢复1型糖尿病（T1D）患者体内的内源性胰岛素生成1。除了T1D之外，胰岛生物学在2型糖尿病（T2D）中也日益重要；T2D的特征是β细胞功能进行性障碍和丧失，同时也适用于因慢性胰腺炎、胰腺肿瘤或外伤性损伤而接受部分或全胰腺切除术的患者。在这些情况下，获取高质量的胰岛对于推进细胞治疗、建立β细胞衰竭模型、研究胰岛-免疫及胰岛-间质相互作用，以及开发新兴的再生方法至关重要2。因此，稳定且可重复的胰岛分离流程对于支持多种胰腺内分泌疾病领域的机制研究和转化开发具有关键意义。
尽管胰岛仅占胰腺质量的不到2%，但其在葡萄糖稳态中发挥着远超其体积的重要作用。胰岛本身对缺氧、酶过度消化、氧化应激和机械剪切力具有高度敏感性，使其在分离过程中极易受到损伤3,4,5即使温度、氧合或组织处理存在细微偏差，也可能因β细胞抗氧化防御能力有限且代谢需求较高，而损害其刺激-分泌耦联功能或触发凋亡6,7因此，在临床和实验环境中，大多数常规方案均强调在收获后的24-48小时内尽快进行后续使用。8,9,10,11,12. 尽管如此 &#34;即用型&#34; 该框架虽能减少退化，但限制了实验的灵活性，阻碍了纵向研究，并增加了获取足够数量胰岛以用于大规模实验的难度 体外 检测或 体内 移植实验
在啮齿类动物模型中，由于Lewis大鼠具有近交系遗传背景、稳定的免疫特征以及可重复的生理特性，因此被广泛用于胰岛研究14。不同品系在胰岛产量、反应性及耐受性方面的差异已有充分记载。De Groot等人的研究表明，与其他品系相比，Lewis大鼠胰岛表现出更优的葡萄糖刺激性胰岛素分泌能力，突显其在功能、代谢及移植研究中的适用性15。其他研究也证实了其在免疫学及同种/异种移植研究中的可靠性14,15,16。然而，在不同实验室之间，胰岛产量、纯度和功能的变异性仍然是一个重大障碍。这种变异性很大程度上源于酶混合物、经导管灌注技术、胰腺处理、消化时间以及纯化策略的不一致17。
为解决这些局限性，我们开发了一种可重复的、分步操作的实验方案，用于从Lewis大鼠中进行胰岛的手术获取、酶消化及密度梯度纯化。该工作流程经过优化，旨在最大化胰岛产量、减少碎片化，并保持其功能活性。尤为重要的是，该方案确立了明确的评估标准，包括胰岛当量（IEQ）、随时间变化的活性、纯度以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力，使研究人员能够可靠地区分成功与不理想的胰岛分离结果18,19,20。通过提高胰岛产量和存活时间，该方案增强了实验的灵活性，并可能减少所需供体动物的数量，从而支持更符合伦理且可扩展的实验设计。
与许多传统方法不同，本方法表明，Lewis大鼠胰岛在体外培养中可维持长达7天，且保持良好的存活率和功能，从而扩展了其在长期in vitro研究中的应用价值。该方案进一步采用了一种简化的批量处理策略，单次可同时处理多达30个胰腺，实现统一消化，减少样本间差异。由于内分泌纯度可达98%，该方法无需耗时的手工挑选，同时降低了微生物污染的风险。与常产生不纯或机械完整性受损样本的单步法或整体消化法相比13，这一高通量工作流程能够稳定获得大量洁净、适合移植的胰岛，可用于in vitro检测、代谢谱分析以及in vivo移植研究。

<table><tbody><tr><td>21 G x 2 英寸 BD PrecisionGlide 针头</td><td>BD</td><td>305129</td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;micro;m 黄铜框架，304 不锈钢筛网，直径 3&quot;，深度 1&quot;（筛号 35）</td><td>McMaster-Carr</td><td>34735K525</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite 无菌注射器，鲁尔锁头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-178</td><td></td></tr><tr><td>Biogel PI UltraTouch M</td><td>M&amp;ouml;lnlycke</td><td>42665</td><td></td></tr><tr><td>邦氏剪刀；直型；尖头；刀刃长度 15 mm；总长 3 1/2&quot;</td><td>Roboz</td><td>RS-5840</td><td></td></tr><tr><td>Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERIL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9956482</td><td></td></tr><tr><td>Cell-IQ 系列 5.8 立方英尺 CO2 实验室培养箱</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm 未经组织培养处理的培养皿</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Corning 胎牛血清，500 mL，常规型，经 USDA 安全检测（热灭活）</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 胰岛分离梯度液 1.069（密度 1.069 g/cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;）</td><td>Corning</td><td>99-815-CIS</td><td>需向公司特别申请</td></tr><tr><td>Corning 胰岛分离梯度液 1.096（密度 1.096 g/cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;）</td><td>Corning</td><td>99-691-CIS</td><td>需向公司特别申请</td></tr><tr><td>Corning 胰岛分离梯度液 1.108（密度 1.108 g/cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;）</td><td>Corning</td><td>99-692-CIS</td><td>需向公司特别申请</td></tr><tr><td>Covidien Tendersorb 吸水垫</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-225-102</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，II 型</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&amp;nbsp;50 mL 高透明度锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 铝箔，标准厚度卷装</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;无纺纱布海绵</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-028-559</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 可重复使用玻璃重型低型烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101600</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜&amp;nbsp; BZ-X810</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖溶液</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Halsey 微型持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，含钙、镁，不含酚红</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>止血钳，经典 Crile 型，长度 5-1/2 英寸</td><td>McKesson</td><td>1231217</td><td></td></tr><tr><td>Hudson（Ewald）持针钳</td><td>Roboz</td><td>RS-5238</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射针头，Monoject，长度 1-1/2 英寸，16 号，普通壁，无安全装置</td><td>McKesson</td><td>43481</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Liberase T-Flex，研究级</td><td>Roche</td><td>5989132001</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒，适用于哺乳动物细胞</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;L3224</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 软件包</td><td>MathWorks</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML">https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NE-4000 双通道可编程注射泵</td><td>SyringePump</td><td>NE-4000-US</td><td></td></tr><tr><td>针头，皮下注射，一次性使用，27G×1/2&quot;（100/盒），EXLINT</td><td>McKesson</td><td>408877</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 细胞培养/培养皿</td><td>Thermo-Scientific</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CKX41 倒置相差显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41-B</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素&amp;sbquo; 链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640，无葡萄糖</td><td>Gibco</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM 储存液）</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST 16R</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>304 不锈钢注射器针头</td><td>Milipore Sigma</td><td>Z117013-1EA</td><td></td></tr><tr><td>手术单，一次性使用，36 英寸 × 100 码</td><td>Covetrus</td><td>10408</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀 - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>拇指式持物钳，4.5&quot;，带齿，精细型，尖端宽度 1.3 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 200 mL 离心管</td><td>Thermo-Scientific</td><td>14-962-17</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 离心瓶适配器和缓冲垫</td><td>Thermo-Scientific</td><td>12-565-283B</td><td></td></tr><tr><td>TSDUB15 15L Dubnoff 摇床水浴箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>300610298</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 4 × 400 mL 摆动桶转子</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003181</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S-50-HL</td><td>Tygon</td><td>AAXoooo3</td><td></td></tr><tr><td>超敏大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒</td><td>Crystal Chem</td><td>90060</td><td></td></tr></tbody></table>

采用酶消化法与密度梯度分离法从lewis大鼠中分离与纯化胰岛组织

Pancreatic Islet Isolation and Purification from Lewis Rats Using Enzymatic Digestion and Density-Gradient Separation

胰岛对于临床胰岛移植以及旨在阐明糖尿病机制和进展的临床前研究至关重要。然而，这些领域的进展常常受限于高质量胰岛的可获得性，因为新兴的治疗策略需要更大规模、更纯净且更标准化的胰岛制备物。本文介绍了一种高通量、标准化的实验方案，用于从Lewis大鼠中手术获取胰腺、酶消化及密度梯度纯化胰岛。该方法结合了导管内胰腺灌注、特定酶混合物、多个胰腺组织的合并消化以及基于密度的分离步骤，在最大化产量的同时减少胰岛碎片化，并消除了常规手工挑选的需要。胰岛产量通过两种互补方法进行定量：一种是在临床环境中常用的基于分样 aliquot 的传统计数法，另一种是半自动化的全样本成像定量法。在一次代表性实验中，从12个胰腺中分离得到的手动计数结果为每个胰腺约3,300个胰岛当量（IEQ）和2,700个绝对胰岛（总计约39,600 IEQ），其大小分布为：62%（50–100 µm）、17%（100–150 µm）、10%（150–200 µm）、5%（200–250 µm）和6%（>250 µm）。该标准化流程可提高实验可重复性，支持大规模研究，并为临床前模型提供稳定、高质量的胰岛来源。 

关键词：胰岛分离，胰岛当量，密度梯度纯化，导管内灌注，酶消化，Lewis大鼠，糖尿病，胰岛移植&#62;250 µm）。相比之下，全样本自动化分析报告的总IEQ为16,350（每胰腺1,362 IEQ），凸显了基于分样定量的固有变异性。通过二苯硫腙染色检测，样本纯度为98%，胰岛活力维持在98%。 体外 在分离后的第3天和第7天进行功能评估，通过静态葡萄糖刺激胰岛素分泌实验显示，在16.7 mM葡萄糖刺激1小时后，胰岛素释放量增加10倍。总体而言，该方案提供了一种可重复且高效的途径，用于制备高纯度、功能完整的胰岛，制备物可直接使用，无需额外纯化。胰岛在体外培养中可维持强劲功能长达七天，为大规模实验提供了操作灵活性 体外 检测以及 在体 移植研究

以下结果代表采用所述方法进行的一次典型胰岛分离实验，共并行处理了十二个Lewis大鼠的胰腺。
产量与尺寸分布
手动分装计数与IEQ转换
按照“胰岛计数”部分第6.1步所述，从混合的胰岛悬液中分别取两份独立的100 µL等分试样，并按直径范围（50–100 µm、100–150 µm、150–200 µm、200–250 µm、250–300 µm、250–300 µm）进行计数。根据标准当量表将计数结果转换为胰岛当量（IEQ；以150 µm为参考），并推算至整个悬液总体积（见图4A）。在本次测试分离实验中（n = 12），每胰腺获得3330 IEQ，中位胰岛直径位于50–100 µm范围内。重复等分试样的计数结果在各直径区间内的一致性为18.8%（变异系数），表明虽存在中等程度变异，但在采用人工计数方法时属预期范围。在此前进行的14次胰岛分离实验中，该方法平均每胰腺获得1353 IEQ（标准差607）。
全自动整板定量分析
为评估手动IEQ的基准，使用显微镜在D1采集明场图像，并进行拼接以生成全皿复合图像（4×物镜；曝光时间1/100秒）。采用Fiji软件及自定义代码进行自动尺寸测量与对象定量，设定预定义的尺寸阈值为50–600 µm。首先对图像进行预处理，以减少背景波动并增强对比度均匀性。根据胰岛结构与周围组织之间的强度差异识别胰岛，生成二值化对象掩膜。对相邻或部分接触的胰岛进行分离，以避免对象数量低估。排除指定尺寸范围以外的对象，以去除碎片和非胰岛组织。针对每个保留的对象，提取包括面积以及x轴和y轴直径在内的形态计量参数。随后按直径对胰岛进行分组，并将每组尺寸区间内的胰岛数量乘以相应的转换系数，计算IEQ。自动尺寸分析共检测到98,832个对象，其平均x轴和y轴直径分别为117 µm和116 µm，估算总IEQ为16,350，与D0时手动测量的IEQ具有高度相关性（Spearman r = 0.937，p = 0.0048；见图4A-C）。
胰岛细胞脱落
在纯化后2小时以及第1天（D1）使用“自动化全板定量”中的相同方法获取全板图像，以评估早期胰岛稳定情况（“脱落”现象）。从2小时到D1，目标物计数变化了0.9%，胰岛当量（IEQ）变化了-6.11%（见图4D）。对D0与D1胰岛直径的配对比较显示，中位数显著减少了2 µm（Wilcoxon符号秩检验，p = 0.0136，n = 2820）。然而，这一变化幅度较小，不太具有生物学或临床意义。
<img alt="胰岛大小分析；手动与自动分布的柱状图及Spearman相关性图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig4.jpg" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="图 4"> 
图 4：胰岛大小分布、相关性及早期脱落的定量评估。 通过手动和自动分析获得的胰岛测量结果的图示总结。(A) 基于标准化胰岛当量（IEQ）大小区间的手动定量结果得到的第0天（D0）胰岛大小分布。(B) 通过相同标准化IEQ大小区间的自动图像测量确定的第1天（D1）胰岛大小分布。(C) 手动D0与自动D1在IEQ大小区间内计数的相关性。(D) 同一培养板在D0与D1之间胰岛直径分布的自动测量箱线图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
纯度（内分泌与外分泌成分）
二苯硫卡腙（DTZ）染色
在第1天（D1），取一份胰岛样品（n = 451）在室温下用DTZ染色30秒，并立即使用明场显微镜成像（4×物镜；曝光时间1/20秒）。在Fiji软件中去除背景像素，使剩余的像素面积对应于胰岛的总面积。通过较深的颜色对比识别出DTZ阴性的外分泌组织区域，使用套索工具手动选择这些区域，每个感兴趣区域的面积自动以像素为单位记录。内分泌纯度计算为DTZ阳性像素占胰岛总像素的百分比，结果纯度为98.56 ± 0.38%（图5A）。
存活率与功能表现
葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）
在每个时间点（第1天、第3天、第7天），手工挑选15个大小匹配的胰岛，分别放入已准备好的四份24孔板中的各个孔内。胰岛在Krebs缓冲液中于37 °C、5% CO2条件下孵育，并采用低-高-低葡萄糖刺激方案：首先在低葡萄糖浓度（2.8 mM，60分钟）下孵育，随后在高葡萄糖浓度（16.7 mM，60分钟，见表1）下孵育。在每次孵育结束时收集流出液组分，并使用大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素浓度。刺激指数定义为高葡萄糖条件下胰岛素分泌量与低葡萄糖条件下的比值。第1天、第3天和第7天的刺激指数分别为9.37、8.34和6.7，组间差异无统计学意义（图5B）。
活/死染色
在第1天、第3天和第7天，手工挑选15个胰岛，并根据制造商说明书使用活/死细胞活力检测试剂盒进行染色。简言之，胰岛在活/死染色液中于25 °C孵育30分钟，随后在一致的显微镜设置下成像，以确保各时间点之间的可比性（4倍物镜；曝光时间1/30秒，Texas Red和GFP滤光片）。采用基于Python的脚本，利用scikit-image进行胰岛分割和荧光强度测量，以量化活力。通过合并绿色和红色荧光通道，应用Li阈值法生成二值掩膜，并使用分水岭分割法分离相互接触的胰岛。通过面积对目标进行筛选，以排除碎片和伪影。对于每个胰岛，活力定义为活细胞积分密度（绿色像素）占总积分密度（绿色加红色像素）的百分比。结果显示，第1天活力为68 ± 9%，第3天为98.2 ± 0.6%，第7天为100%。经70%乙醇处理10分钟的阳性对照样本活力为2.7 ± 7.2%（见图5C-F）。
<img alt="细胞形态学研究；显微镜图像；GSIS柱状图；D1-D7荧光分析，PS检测结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig5.jpg" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="图5"> 
图5：胰岛纯度、活力及功能反应性的评估。 随时间变化的分离胰岛特征的代表性图像与定量汇总。(A) 使用二氮杂菲（DTZ）染色的胰岛代表性10×明场图像，显示红色染色的内分泌胰岛和未染色的外分泌组织。(B) 第1、3、7天高糖/低糖（HG/LG）刺激指数的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）数值。(C-E) 第1天(C)、第3天(D)和第7天(E)胰岛的活/死荧光图像。(F) 经乙醇处理的阳性对照胰岛的活/死荧光图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(A) 洗涤培养基</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>用量 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>12.5 mL（来自1 M储备液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>5 mL（来自200 mM储备液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) 胰岛培养基</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>用量 (mL 或 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640，无葡萄糖</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>11 mL（来自1 M储备液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙酮酸钠</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5.5 mL（来自100 mM储备液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖</td>
			<td>5.5 mM</td>
			<td>2.75 mL（来自200 g/L储备液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) 青霉素-链霉素冲洗液</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>用量 (mL 或 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生理盐水溶液，0.9%</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)</td>
			<td>2%</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(D) 终止缓冲液</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>用量 (mL 或 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS </td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清</td>
			<td>20%</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E) 克雷布斯缓冲液</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>用量 (mL 或 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>975 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>115 mM</td>
			<td>6.72 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>24 mM</td>
			<td>2.02 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0.3728 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0.0952 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td>0.2775 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：溶液列表。 胰岛分离与纯化方案中所用全部溶液的组成及配制详情。每个小节列出了各溶液的组分、终浓度、配制体积和目录编号。A) 用于消化和纯化过程中冲洗和洗涤组织的洗涤液。B) 胰岛培养基，用于胰岛分离后的维持与活性保持。C) 青霉素-链霉素冲洗液，用于灭菌和冲洗收获的胰腺。D) 淬灭缓冲液，用于终止酶消化反应并维持细胞活力。E用于葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验的克雷布斯缓冲液。
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>胰腺数量</td>
			<td>胶原酶（15.38 mg/mL）</td>
			<td>嗜热菌蛋白酶（1 mg/mL）</td>
			<td>DNA酶（100 mg/mL）</td>
			<td>工作缓冲液</td>
			<td>使用的600 mL烧杯数量</td>
			<td>每烧杯体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>4.5 mL</td>
			<td>2.25 mL</td>
			<td>450 µL</td>
			<td>450 mL</td>
			<td>5</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>3.6 mL</td>
			<td>1.8 mL</td>
			<td>360 µL</td>
			<td>360 mL</td>
			<td>4</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>300 µL</td>
			<td>300 mL</td>
			<td>3</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>2.4 mL</td>
			<td>1.2 mL</td>
			<td>240 µL</td>
			<td>240 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>1.8 mL</td>
			<td>0.9 mL</td>
			<td>180 µL</td>
			<td>180 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>150 µL</td>
			<td>150 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>终浓度</td>
			<td>0.15 mg/mL</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：根据胰腺数量配制的消化酶溶液。 针对不同数量的大鼠胰腺，制备工作解离液（WDM）所需的胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I体积。每种酶的最终浓度列于表格底部。
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>胰腺数量</td>
			<td>50 mL 离心管数量</td>
			<td>每支注射器体积</td>
			<td>1.096 型注射器数量</td>
			<td>1.068 型注射器数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>10 支</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>8 支</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>6 支</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>4 支</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>4 支</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>2 支</td>
			<td>20 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：根据胰腺数量进行的梯度加载。 根据处理的胰腺数量，用于胰岛纯化的50 mL锥形管数量及相应的梯度液用量。
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>胰岛直径     范围 (µm)</td>
			<td>胰岛颗粒     数量 (AI)</td>
			<td>IEQ 转换系数</td>
			<td>每范围 IEQ 数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-100</td>
			<td>a</td>
			<td>* 0.167</td>
			<td>a * 0.167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>b</td>
			<td>* 0.648</td>
			<td>b * 0.648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-200</td>
			<td>c</td>
			<td>* 1.685</td>
			<td>c * 1.685</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>201-250</td>
			<td>d</td>
			<td>* 3.500</td>
			<td>d * 3.500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>251-300</td>
			<td>e</td>
			<td>* 6.315</td>
			<td>e * 6.315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-350</td>
			<td>f</td>
			<td>* 10.352</td>
			<td>f * 10.352</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 350</td>
			<td>g</td>
			<td>* 15.833</td>
			<td>g * 15.833</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：胰岛当量换算。 将胰岛直径范围转换为标准化的胰岛当量（IEQ）。该表格列出了观察到的胰岛直径区间、每个区间内的胰岛颗粒数量、各尺寸区间的相应IEQ换算系数，以及每个区间对应的IEQ贡献值。

本方案描述了一种标准化的方法，用于Lewis大鼠胰岛的手术获取、酶消化及密度梯度纯化，可高效获得高纯度的胰岛，直接用于移植或后续实验研究。 体外 研究。

采用酶消化法与密度梯度分离法从Lewis大鼠中分离与纯化胰岛组织

胰岛对于临床胰岛移植以及旨在阐明糖尿病等疾病机制和进展的临床前研究均至关重要。

我们的研究致力于开发一种标准化的高通量Lewis大鼠虹膜环分离方案，以优化产量、纯度、存活率及功能持续时间。现有方法获得的虹膜环纯度不一且寿命较短。本方案通过标准化消化、纯化和 pooling 步骤，提高了实验结果的一致性和组织存活时间。首先，将一只已处死的大鼠置于显微镜下。使用皮肤剪从耻骨联合处开始，向两侧肋骨方向做V形切口，以暴露腹腔。用平头镊子将小肠和大肠向动物左侧牵拉，以清理腹腔操作区域。然后使用平头镊子和弯止血钳展开上段十二指肠。确保胆总管和肝门静脉位于视野范围内。现在用弯止血钳将肝脏向头侧方向牵拉。在距肝脏一到两毫米处夹闭胆总管和肝静脉。在显微镜视野下，使用平头镊子和平头止血钳，轻柔地移动十二指肠内的内容物，以暴露奥迪括约肌。然后在奥迪括约肌两侧各约五毫米处轻柔地夹闭十二指肠，以隔离其周围区域。确保最小程度的压缩，以保持组织完整性。将装有无菌WDM的注射器针头小心地通过十二指肠壁插入，穿过括约肌本体，并推进至主胰管，以进行灌注。在保持恒定压力的同时，以每秒约500微升的速度向胰腺灌注7至10毫升的WDM，直至胰腺完全膨胀。现在，从十二指肠上取下两个平头止血钳。然后从脾脏、胃、大肠、十二指肠及肠系膜等周围结构开始，轻柔地分离并游离胰腺。用平头镊子轻轻提起灌注过的胰腺，并用精细解剖剪剪断任何残留的结缔组织连接。立即将切除的胰腺转移至含有冰冻冲洗液的培养皿中，并在清洗该胰腺的同时继续采集下一个胰腺。清洗胰腺时，使用一对精细弯头镊子和精细解剖剪，小心去除灌注胰腺上可能存在的淋巴结、脂肪组织、肠系膜以及大血管。将清洗后的胰腺转移至一个无菌的600毫升烧杯中，烧杯内含25毫升冷WDM。用无菌铝箔覆盖烧杯，以在从手术操作区转移至细胞培养操作区的过程中保持无菌状态。将烧杯放入设定为130转/分钟的轨道摇床水浴中，振荡10分钟。在5分钟时间点，手动顺时针摇动烧杯，然后逆时针摇动，以促进组织解离。在10分钟时间点，迅速将烧杯转移并浸入冰中，以减缓酶活性。随后向烧杯中的溶液加入等体积的终止缓冲液，以停止消化反应。使用带有14号脊椎穿刺针的50毫升注射器，轻柔地反复抽吸和排出组织悬液，以解离较大的组织碎片。将悬液转移至200毫升锥形管中。离心悬液后，小心弃去上清液，并将沉淀物重悬于100毫升洗涤培养基中。现在将悬液通过置于无菌600毫升烧杯上的无菌500微米筛网过滤，以去除未消化的大块组织。将滤液转移至新的200毫升锥形管中，然后再次离心。进行眼状体纯化时，使用预先润湿的10毫升血清移液管，每2毫升沉淀体积加入15毫升梯度溶液重悬各组织沉淀。轻柔混匀直至悬浮液均匀。小心地将15毫升细胞悬浮液加入每个50毫升锥形管底部，避免接触管壁，以确保形成清晰的梯度。然后使用注射泵以每分钟5毫升的速度向每个梯度管中加入10毫升溶液，同时将16号针头尖端紧贴管内壁，防止混合。离心管后，识别位于梯度层界面处的眼状层。使用带滤芯的移液枪吸取眼状层，将收集的眼状层转移至预冷的含有5毫升洗涤液的200毫升锥形管中。用洗涤液定容至200毫升，并进行以下洗涤和离心步骤。然后将眼状体均匀接种到未经组织培养处理的100毫米培养皿中，每处理五个胰腺使用一个培养皿。在本次分离实验中，每个胰腺可获得3,330个眼状体当量，眼状体中位直径位于50至100微米区间。自动测量共得到总计98,832个对象，其数量与第0天人工测定的眼状体当量数高度相关。根据第1天的双硫腙染色，内分泌纯度约为98.56%。第1天的刺激指数为9.37，第3天为8.34，第7天为6.7，各时间点之间无显著差异。该方法可用于研究胰岛移植、β细胞功能、糖尿病逆转、胰岛封装以及胰岛与免疫系统或微环境之间的相互作用。该方案适用于需要高纯度Lewis大鼠胰岛的临床前移植、糖尿病建模、包封研究以及体外功能检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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