Name: 测量房水流出设施与眼球顺应性 离体 使用注射泵系统的小鼠眼部给药 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-02T14:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 了解如何使用优化注射泵系统测量小鼠离体眼房水流出设施与眼球顺应性。该方法应用压力控制灌注系统的分析技术，为评估小梁网和施莱姆氏管的生物力学特性提供低成本可靠工具。

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感谢爱荷华大学的Harald Stauss教授开发了HemoLab软件。本研究得到了国家重点研发计划（2022YEF0132500）、青岛市关键技术及产业化项目（23-1-4-xxgg-16-nsh）、泰山学者青年专家计划（tsqn202103055）、山东省优秀青年科学基金（ZR2022YQ72）以及青岛大学眼科学联合项目的资助。

所有实验均按照《眼科与视觉研究动物使用声明》（ARVO 声明）以及青岛大学医学中心实验动物护理和使用指南（QDU-AEC-2022069）进行。
1. 动物选择与处理
<ol>
	<li>使用5月龄、遗传背景为50% C57BL/6和50% BALB/c的小鼠。实验设计中无需考虑性别因素。</li>
	<li>将小鼠饲养在12 h/12 h明暗循环、温度23 ± 2 °C、湿度50 ± 5%的环境中。</li>
</ol>
2. 眼内压测量
<ol>
	<li>使用密闭舱室，以2.5%异氟烷和80%（体积/体积）氧气对小鼠进行3.5分钟麻醉。 
	注意：异氟烷为挥发性麻醉剂。应在通风良好的区域或适当的密闭系统中实施麻醉。</li>
	<li>将小鼠转移至手术平台，通过面罩维持麻醉状态，持续额外30秒。</li>
	<li>所有测量应在9:00至12:00之间进行。每只眼睛记录三次测量值，并计算每个数据点的平均值。</li>
</ol>
3. 系统设置（图1）
<ol>
	<li>将一个 100 µL 注射器连接到注射泵上。</li>
	<li>将注射器连接至流通式压力传感器。</li>
	<li>将传感器连接至数据采集系统。 
	注意：确保压力传感器与眼托架处于同一高度，以避免产生压力伪影。</li>
	<li>用 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）填充系统，去除所有气泡。</li>
	<li>将眼球置于带有圆形凹槽（直径 4–6 mm）的托架中，确保在插管过程中眼球保持稳定。将压力传感器与眼托架调节至同一高度。 
	注意：位置错位可能导致压力测量误差。定制眼托架的 STL 设计文件见补充文件 1。</li>
</ol>
4. 软件操作
<ol>
	<li>压力传感器校准
	<ol>
		<li>打开数据采集软件。加载 校准设置文件。选择 校准 功能。</li>
		<li>将系统连接至两个指定高度的储水容器。</li>
		<li>使用以下换算关系输入测量压力与实际压力： 
		1 cm H2O = 0.735 mmHg</li>
	</ol>
	</li>
	<li>泵的设置
	<ol>
		<li>打开模块设置。加载 调节器配置文件。</li>
		<li>选择泵设备。输入 最大流速 和 注射器直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据记录
	<ol>
		<li>开始记录。</li>
		<li>每次压力变化后停止记录。</li>
		<li>输入下一个压力值。</li>
		<li>重新开始记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 针头准备
<ol>
	<li>根据既定方案拉制玻璃微电极8。</li>
	<li>将尖端研磨至内径为 80–100 µm，并对针尖进行抛光处理。 
	注意：操作玻璃针头时需小心，避免造成伤害。</li>
	<li>将针头安装至显微操作器上，并将针头连接至压力传感器。</li>
	<li>用 PBS 填充针头。</li>
	<li>调整针头尖端位置，使其与压力传感器处于同一高度。</li>
	<li>阻力测定
	<ol>
		<li>施加 1 mmHg 的压力，记录流速。</li>
		<li>计算针头阻力： 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/70433/70433eq1v2.jpg" style="margin:auto;" /></li>
		<li>选用阻力在 0.01 至 0.5 mmHg/(µL/min) 范围内的针头。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 系统设施与合规性
<ol>
	<li>设施测量
	<ol>
		<li>用 PBS 灌注系统。使用三通阀密封系统。</li>
		<li>施加 6、8、10、12、14 和 16 mmHg 的压力梯度。</li>
		<li>在每个压力梯度下记录 P 和 Q 持续 10 分钟。取最后 5 分钟的数据计算平均值。</li>
		<li>进行线性回归分析。将斜率解释为系统设施值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>验证
	<ol>
		<li>重复测量 3 次。</li>
		<li>确认系统设施值小于 0.2 nL/min/mmHg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>顺应性测量
	<ol>
		<li>将一段 35 cm 的硅胶管接入系统。</li>
		<li>测量有和无聚四氟乙烯（Teflon）管路时的顺应性。</li>
		<li>采用离散体积法计算体积变化14。</li>
		<li>确定系统顺应性为 4 nL/mmHg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灵敏度检查
	<ol>
		<li>确认可检测的系统顺应性大于 9.9 nL/mmHg。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 去核
<ol>
	<li>使用 CO2&#160;处死小鼠，流速为 0.7 L/min，持续 3 分钟。 
	注意：CO2&#160;处死必须遵循机构指南，以确保人道终点。</li>
	<li>使用无菌器械解剖眼外肌和视神经。摘除眼球。</li>
	<li>立即将一只眼球置于 35.5 °C 的支架上固定。</li>
	<li>将对侧眼球储存在 4 °C。</li>
	<li>使用同一系统测量双眼。</li>
</ol>
8. 插管
<ol>
	<li>进针
	<ol>
		<li>以45°角将针头穿过中央角膜插入。</li>
		<li>将针头向前推进至前房深度达0.3–0.5 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>验证
	<ol>
		<li>稳定系统，确认在最后5分钟内压力波动≤ 0.4 mmHg。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 眼部 Cr
<ol>
	<li>将眼压稳定在 8 mmHg，持续 30 分钟。</li>
	<li>依次施加 6、8、10、12、14 和 16 mmHg 的压力梯度。</li>
	<li>最后再施加一个 8 mmHg 的压力步骤。</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>将最大流速设置为 4 µL/min。</li>
		<li>在每个压力步骤下记录 10 分钟的压力（P）和流量（Q）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析
	<ol>
		<li>绘制 P–T 和 Q–T 曲线，取最后 5 分钟的数据计算平均值。</li>
		<li>将数据拟合至幂律模型27： 
		<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/70433/70433eq2v2.jpg" style="margin:auto;" /></li>
	</ol>
	</li>
	<li>将（扣除系统导流能力后的）Cr 定义为眼内流出易度。</li>
	<li>设定 Pr = 8 mmHg。</li>
	<li>将 β 定义为非线性系数。</li>
</ol>
10. 眼部&#160;Φr
<ol>
	<li>在压力递增过程中分析 P–T 和 Q–T 曲线。识别流量上升至&#160;Qmax&#160;以及随后的减速现象。</li>
	<li>使用离散体积法计算&#160;tp 与&#160;tmax&#160;之间的体积变化30。</li>
	<li>将数据拟合至修正的 Friedenwald 方程30： 
	<img alt="方程 3" src="/files/ftp_upload/70433/70433eq3v2.jpg" style="margin:auto;" /></li>
	<li>设定 Pr&#160; = 13 mmHg。将（扣除系统顺应性后的）&#160;Φr 定义为眼顺应性&#160;Φr,eye&#160;，γ 定义为材料参数。</li>
</ol>

<ol>
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D., Clark, A. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+the+trabecular+meshwork+cell.">The many faces of the trabecular meshwork cell.</a> Exp Eye Res. 158, 112-123 (2017).</li><li>Stamer, W. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+Schlemm&#x2019;s+canal+endothelium+and+intraocular+pressure+reduction.">Biomechanics of Schlemm&#x2019;s canal endothelium and intraocular pressure reduction.</a> Prog Retin Eye Res. 44, 86-98 (2015).</li><li>Overby, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+regulates+calcium+homeostasis,+cytoskeletal+remodeling,+conventional+outflow+and+intraocular+pressure+in+the+mammalian+eye.">TRPV4 regulates calcium homeostasis, cytoskeletal remodeling, conventional outflow and intraocular pressure in the mammalian eye.</a> Sci Rep. 6, 30583 (2016).</li><li>Reina-Torres, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vital+role+for+nitric+oxide+in+intraocular+pressure+homeostasis.">The vital role for nitric oxide in intraocular pressure homeostasis.</a> Prog Retin Eye Res. 83, 100922 (2021).</li><li>Reina-Torres, E., Boussommier-Calleja, A., Sherwood, J. M., Overby, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+humor+outflow+requires+active+cellular+metabolism+in+mice.">Aqueous humor outflow requires active cellular metabolism in mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 45 (2020).</li></ol>

作者声明无利益冲突。

本研究提出了一种优化的注射泵系统，用于评估小鼠眼球的流出道通畅性及眼球顺应性，所得数值与采用压力控制型眼灌注系统报道的结果一致。该方法在保持实验装置简单且易于实现的同时，提高了基于注射泵测量的准确性。这种在方法学上的改进与操作便捷性的结合，可能有助于在缺乏更先进设备的实验室中更广泛地推广应用。
该系统的主要优势在于提高了数据准确性，从而能够识别与房水流出及眼生物力学相关的关键基因和分子通路。这一改进有助于针对青光眼的药物干预和基因操作，同时支持对细微的年龄相关性变化、早期疾病进展以及短期内治疗反应的监测。例如，对C的准确评估促进了力学敏感性靶点的发现，如TRPV4介导的钙内流在调控小梁网力学特性及影响房水流出中的作用38，以及压力依赖性一氧化氮释放在线粒体收缩性和Schlemm管松弛中的重要作用39。对ϕ的精确计算表明，眼部顺应性随年龄增长出现细微下降，提示角巩膜硬度增加可能提高发生青光眼损伤的易感性36。
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维持适当且稳定的眼内压（IOP）对眼部健康至关重要1。持续性的眼内压升高是青光眼的主要危险因素2,3。数月或数年内的长期眼内压波动也会导致视力丧失4,5。近期研究发现另一种眼内压波动形式，即由日常活动引起的短暂性波动，也可能加速青光眼的进展6,7。例如，一名有20年揉眼史的46岁男性和一名有10年揉眼史的52岁男性均表现出视盘损伤的加速进展8,9。这些发现凸显了及时采取适当措施应对眼内压变化以最大限度降低视力丧失风险的重要性。
眼内压（IOP）由房水（AH）的生成与排出之间的平衡所调节10。房水主要通过常规途径和葡萄膜巩膜途径离开眼球11。在正常眼和青光眼眼中，常规途径（包括小梁网（TM）和施勒姆管（SC））是影响眼内压稳态的主要流出阻力来源12,13,14。因此，小梁网和施勒姆管的生物力学特性对于眼球适应眼内压变化至关重要15,16,17。
近年来的技术进步使得对房水外流的评估更加准确。已开发出一些侵入性方法，例如基于重力的灌注系统和注射泵系统，用于计算外流易度（C），该参数可反映小梁网（TM）和施莱姆管（SC）对稳态外流的调控作用18,19,20,21,22,23,24。一些非侵入性方法，如眼压描记法25和荧光光度法26，已在临床上用于测定青光眼患者的外流易度（C）。然而，大多数方法无法特异性地评估小梁网和施莱姆管的功能。例如，在注射泵系统中，稳态下的流量和压力数据通过简单的线性回归进行拟合，其斜率被解释为压力依赖性的外流易度（C）。然而，这种在活体小鼠中计算得到的外流易度（C）并不能准确反映通过传统途径的房水外流能力，因为它受到房水分泌、葡萄膜巩膜外流以及巩膜上静脉压的影响，正如Goldmann方程所描述的那样。
为解决这一局限性，Millar 等人通过多次恒定流速测量，基于安乐死后房水流入为零、无巩膜上静脉压以及葡萄膜巩膜外流保持不变的假设，在同一只小鼠眼球中计算了房水流入量、传统外流和葡萄膜巩膜外流222016年，Sherwood等人报道葡萄膜巩膜外流为0 离体 在0 mmHg眼内压下观察眼睛，随后通过引入幂律模型并使用iPerfusion（一种压力控制灌注系统，下文简称灌注系统）来探讨同一问题27方法学的进步阐明了小梁网（TM）和睫状肌（SC）的不同作用，加深了对其在维持房水稳态流出中生理功能的理解。
此外，小梁网（TM）和Schlemm管（SC）对眼内压（IOP）波动的瞬时反应对于维持眼内压稳态至关重要。为了追踪这种运动，Xin等人开发了相敏光学相干断层扫描技术（OCT），可在秒级时间尺度上实现观测28。三维连续块面扫描电子显微镜可在超微结构水平上研究此类运动29。然而，基于图像的方法仅能估算TM和SC的生物力学特性，无法获得房水（AH）瞬时引流的实际数值。2019年，Sherwood等人在开发iPerfusion系统后，将眼顺应性（ϕ）计算为评估角巩膜弹性以及TM和SC瞬时反应的关键指标30。这一进展为评估TM和SC在眼内压波动下的瞬时行为提供了定量参数。
基于这些在评估小梁网和睫状体功能方面的进展，本研究通过引入用于计算 C 的幂律模型，并整合新的方法来计算 ϕ，从而改进了注射泵系统。这些测量结果与使用灌注系统获得的已发表数据进行了比较，以评估优化后的注射泵系统是否适用于测量房水外流设施和眼球顺应性 离体 小鼠眼睛

<table><tbody><tr><td>试剂</td><td>1&amp;times; PBS缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中国</td><td>R640</td><td></td></tr><tr><td>材料</td><td>100 &amp;mu;L高精度移液器</td><td>Hamilton</td><td>1710</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter, Novato, CA</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌注射器</td><td>江西丰林医疗器械有限公司，中国</td><td>10 ml</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>IcuMedical</td><td>PX26-015G</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>南京润泽流体科技有限公司，中国&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>透明PTFE管</td><td>南京润泽流体科技有限公司，中国&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td>火焰/布朗移液器拉制仪</td><td>Sutter, Novato, CA</td><td>P-97&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手动显微操作器</td><td>世界精密仪器公司（WPI）</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>金属浴</td><td>贝沃生物，苏州，中国</td><td>2016C</td><td></td></tr><tr><td>微电极烧制仪</td><td>Narishige科学仪器实验室，东京，日本</td><td>MF830</td><td></td></tr><tr><td>微电极研磨仪</td><td>MPInstrument有限公司，武汉，中国</td><td>KDG-02</td><td></td></tr><tr><td>PZMIII体视变倍双目显微镜</td><td>世界精密仪器公司（WPI）</td><td>PZMIII&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>世界精密仪器公司（WPI）</td><td>AL-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

测量房水流出设施与眼球顺应性 离体 使用注射泵系统的小鼠眼部给药

Measuring Outflow Facility And Ocular Compliance In Ex Vivo Mouse Eyes Using A Syringe-pump System

维持眼内压（IOP）在适宜且稳定的水平对眼部健康至关重要。小梁网（TM）、施莱姆管（SC）以及整个角巩膜壳的生物力学特性在眼内压稳态中起着关键作用。流出易度（C）是评估TM和SC引流房水效率的关键参数，而眼球顺应性（ϕ）则反映了角巩膜壳的弹性以及通过TM和SC的瞬时流出情况。此前已开发出一种简单且成本较低的注射泵系统用于评估C值。然而，使用简单的线性回归方法对活体（in vivo）数据进行分析在表征TM和SC功能方面存在局限性。本研究通过引入已建立的压力控制型眼灌注系统所采用的分析方法，对注射泵系统进行了优化。在离体（ex vivo）眼球中测得的C和ϕ值与先前发表的灌注系统数据进行了比较，结果处于已报道的数值范围内。综上所述，这种简便且低成本的注射泵系统有助于评估TM和SC的生物力学特性。

通过将5月龄小鼠中优化后的注射泵系统的C和ϕ值与先前发表的控压式眼灌注研究结果进行比较，评估了该系统的性能。图2F中的数据集正态性采用Shapiro–Wilk检验进行评估，统计学比较采用双尾配对Student t检验进行。
如图所示 图2A–C，眼内压（IOP）， Cr，眼睛，和&#160;&#934;r，眼内压分别为14.0 mmHg（95%置信区间：13.2–14.8 mmHg）、5.2 nL/min/mmHg（95%置信区间：4.1–6.4 nL/min/mmHg）和46.0 nL/mmHg（95%置信区间：40.6–51.3 nL/mmHg）。注射泵系统测得的流出易度值与灌注系统所得结果相当（图2D)31,<sup ...

整合已建立的压力控制灌注方法中的分析手段，优化了一种简单且低成本的注射泵系统，用于评估小鼠眼球的流出道功能和眼顺应性。

维持眼内压（IOP）在适宜且稳定的水平对眼健康至关重要。小梁网的生物力学特性……

本研究旨在利用注射泵系统评估小梁网、施莱姆管以及整个角巩膜壳的生物力学特性。线性回归在分析房水外流时存在局限性。该系统尚未被用于计算眼顺应性。首先，取一支100微升的注射器。将注射器连接至泵和流通式压力传感器。接着，将传感器连接至数据采集系统。用1×PBS填充系统，并彻底去除所有气泡。打开数据采集软件。加载校准设置文件，并选择校准功能。将系统连接至位于两个已知高度的储水容器，输入测得压力与实际压力值。打开PID调节器设置，加载配置文件。选择泵设备。输入最大流速和注射器直径。然后开始记录数据。完成后，输入下一个压力值，并重复该过程。将玻璃微量移液管尖端研磨至内径为80至100微米，并对尖端进行抛光。将移液管固定在显微操作器上，并将其连接至压力传感器。用PBS填充移液管，并将移液管尖端置于与压力传感器相同高度。施加1毫米汞柱的压力并记录流速。选择阻力在0.01至0.5毫米汞柱·分钟/微升之间的移液管。用PBS灌注系统，并使用三通阀密封系统。依次施加6、8、10、12、14和16毫米汞柱的压力阶跃。在每个压力阶跃下记录10分钟的压力和流速，并取最后5分钟的数据计算平均值。进行线性回归分析，将斜率解释为系统通透性；重复测量三次后，确认系统通透性小于0.2纳升/分钟·毫米汞柱。随后，将一段35厘米长的硅胶管引入系统。测量有或无聚四氟乙烯（Teflon）管时的顺应性。施加6、8、10、12、14和16毫米汞柱的压力阶跃，采用离散体积法测定有或无聚四氟乙烯管时的系统顺应性，并确认其值超过9.9纳升/毫米汞柱。将一只遗传背景为50% C57BL/6和50% BALB/c的安乐死五个月龄小鼠置于解剖台上。使用无菌器械摘除眼球，解剖眼外肌和视神经。立即将一只眼球安装在保持35.5摄氏度的固定装置中。将对侧眼球保存在4摄氏度环境中，待后续使用。进行插管时，将针头以45度角穿过中央角膜，并向前房内推进0.3至0.5毫米。系统稳定后，确认压力波动小于0.4毫米汞柱。将眼球置于系统中，并在8毫米汞柱压力下稳定30分钟。调整设置，依次施加6、8、10、12、14和16毫米汞柱的压力梯度，最后再回到8毫米汞柱的终末步骤。在每个压力水平下记录10分钟的压力和流量数据。利用幂律方程和修正的Friedenwald方程分析压力-时间及流量-时间数据，以确定眼房水外流易度和眼球顺应性。眼内压为14.0毫米汞柱。流出易度为5.2纳升/分钟/毫米汞柱，眼球顺应性为46.0纳升/毫米汞柱。注射泵系统测得的流出易度值与灌注系统所得结果相当。采用注射泵系统获得的眼球顺应性值落在灌注系统计算所得的文献报道范围内。在8毫米汞柱压力下，压力升高后的平均流量低于压力升高前的测量值。这种简单且低成本的注射泵系统可用于测量离体小鼠眼球的房水外流易度和眼顺应性。在执行该操作时，必须确保正确插管，并对系统的外流易度和顺应性进

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用注射泵系统测量体 外 小鼠眼睛的出流设施和眼部顺应性

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测量房水流出设施与眼球顺应性离体使用注射泵系统的小鼠眼部给药

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