Name: 单细胞解离、RNA测序及分离老年泪腺和唾液腺的肌上皮细胞和成纤维细胞的方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-24T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习从老年小鼠泪腺中分离高活性单细胞的方法，用于单细胞RNA测序和流式细胞术分析。该方案通过优化酶解消化步骤，有效分离肌上皮细胞、成纤维细胞及免疫细胞群体，为研究腺体衰老机制提供可靠技术支撑。

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本工作得到了美国国立卫生研究院、国立眼科研究所（NEI）资助项目5R01EY026202、R01EY035333；国立牙科与颅面研究所（NIDCR）资助项目R01DE031044、2R01DE014756；以及国家癌症研究所（NCI）资助项目5R01CA271500的支持。

所有动物实验均按照斯克里普斯研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行（方案编号：08-0123；批准日期：2023年8月29日）。斯克里普斯研究所的动物护理工作已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证。小鼠饲养于标准的12小时光照/12小时黑暗循环环境中，食物和水自由供应。ad libitum。实验中使用了PdgfraEGFP和Acta2GFP转基因小鼠品系。小鼠品系的详细信息见&#34;材料表&#34;部分。
1. 一般注意事项
<ol>
	<li>遵循美国国立卫生研究院通用预防措施17 处理生物危害性材料和动物组织时，应遵守批准的IACUC规程和指定的动物生物安全等级进行所有动物实验。</li>
	<li>遵循标准实验室安全规范：禁止口吸移液，尽量减少锐器使用，在产生气溶胶的操作中使用生物安全柜，穿戴适当的个人防护装备，将锐器丢弃于防刺穿容器中，并在处理前对所有生物危害废物进行正确标识和去污染。</li>
	<li>定期使用适当的消毒剂（如10%次氯酸钠溶液）对工作台面和设备进行去污处理。</li>
	<li>所有离心步骤均需在4 °C下使用预冷的冷冻离心机进行，以维持细胞活力并尽量减少温度诱导的应激反应。</li>
	<li>根据特定仪器配置优化流式细胞仪和细胞分选仪的设置，并使用适当的对照样本调整每种抗体-荧光染料偶联物的参数。在同一系列实验中，应使用相同的细胞仪和分选仪器，并保持固定且已优化的设置，以尽量减少实验变异。</li>
	<li>最多可提前一天配制所选溶液，并妥善保存至使用。所有溶液均须在生物安全柜内的无菌条件下配制。</li>
	<li>保持 Ca2+/毫克2+-含溶液应与含EDTA的缓冲液分开，以防止在酶促步骤中发生螯合。本实验所需的所有试剂均列于 材料表.</li>
</ol>
2. 塑料器皿
<ol>
	<li>在无菌条件下，用 1× PBS + 1% BSA 在室温（RT）下预包被培养皿、试管和注射器 1 小时。吸除液体，保持所有物品无菌直至使用。</li>
	<li>预包被移液器吸头。用每个吸头吸取并排出 1× PBS + 1% BSA 三次，以包被内表面。将包被后的吸头放回无菌吸头盒中，并在无菌培养箱中过夜干燥。在次日细胞分离操作过程中使用这些预包被的吸头。</li>
</ol>
3. 溶液与缓冲液
<ol>
	<li>DNase I 储存液（5 mg/mL）
	<ol>
		<li>使用 5 M NaCl 储存液配制 150 mM NaCl，并对溶液进行无菌过滤。</li>
		<li>向过滤后的 150 mM NaCl 溶液中加入 1 M CaCl₂，使 CaCl₂ 的终浓度为 5 mM。</li>
		<li>将 100 mg DNase I 溶解于 20 mL 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂ 缓冲液中，得到浓度为 5 mg/mL 的 DNase I 储存液。</li>
		<li>分装为 500 µL 每份，于 −20 °C 保存，最长可保存 6 个月。避免反复冻融，以防酶活性丧失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化培养基
	<ol>
		<li>实验前一天，将 DMEM/F12 与 0.5% BSA 混合，配制基础培养基混合液，并进行过滤。</li>
		<li>向基础培养基 DMEM/F12 / 0.5% BSA 中加入 1 M HEPES 和 1 M CaCl₂，使终浓度分别为 15 mM 和 3 mM。</li>
		<li>使用前立即加入以下所有酶：胶原酶 IV（1 mg/mL；125 U/mL）、分散酶 II（2.5 mg/mL；1.25 U/mL）和 DNase I（20 U/mL；由 5 mg/mL 储存液稀释得到 0.05 mg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阻断培养基 1（BM1）
	<ol>
		<li>向 1× HBSS 中加入 1 M HEPES 和 0.5 M EDTA，使终浓度分别为 15 mM 和 3 mM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阻断培养基 2（BM2）
	<ol>
		<li>向 DMEM/F12 中加入 FBS 和 1 M HEPES，使终浓度分别为 10% 和 15 mM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNase 处理用培养基
	<ol>
		<li>实验前一天，将 1× HBSS 与 0.5% BSA 混合，配制基础培养基，并进行过滤。</li>
		<li>向基础培养基 1× HBSS / 0.5% BSA 中加入 1 M HEPES、1 M CaCl₂ 和 1 M MgCl₂，使终浓度分别为 10 mM、1.5 mM 和 2 mM。</li>
		<li>使用前立即向配制好的混合液中加入 DNase I（200 U/mL；由 5 mg/mL 储存液稀释得到 0.5 mg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阻断培养基 3（BM3）
	<ol>
		<li>使用相同的过滤后基础培养基 1× HBSS / 0.5% BSA，加入 1 M HEPES 和 0.5 M EDTA，使终浓度分别为 10 mM 和 1 mM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阻断培养基 4（BM4）
	<ol>
		<li>使用相同的过滤后基础培养基 1× HBSS / 0.5% BSA，加入 1 M HEPES，使终浓度为 10 mM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS 缓冲液
	<ol>
		<li>实验前一天，将 1× DPBS 与 0.5% BSA 混合，配制基础培养基，并进行过滤。</li>
		<li>向 1× DPBS / 0.5% BSA 中加入 1 M HEPES 和 0.5 M EDTA，使终浓度分别为 25 mM 和 1 mM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞 RNA 测序用培养基（MSC）
	<ol>
		<li>实验前一天，将 1× DPBS 与 0.4% BSA 混合，配制培养基，并进行过滤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织采集与显微解剖（约 40 - 50 分钟）
<ol>
	<li>根据机构IACUC指南，使用异氟烷麻醉小鼠，并通过颈椎脱位实施安乐死。</li>
	<li>使用精细镊子和剪刀切开眼与耳之间的皮肤，轻轻剥离以暴露泪腺。</li>
	<li>为分离泪腺，用钝头镊子轻轻提起腺体，并以圆形运动方式小心地将周围结缔组织轻轻剥离。泪腺边界清晰可见，易于与邻近组织（包括腮腺）分离。</li>
	<li>将泪腺（每颗腺体重量约为10–25 mg，具体取决于小鼠体重、性别和年龄）转移至含有2 mL冰上预冷的1×PBS的35 mm培养皿中。在解剖显微镜下，去除残留脂肪，并使用两把镊子小心剥离结缔组织被膜。</li>
	<li>在进行酶消化前，取少量组织碎片在荧光显微镜下观察，确认细胞标记情况，验证预期的报告基因或荧光信号。</li>
	<li>将无菌的35 mm培养皿置于冰上，在皿中央加入800–1000 µL预冷的1×PBS（体积根据腺体大小调整）。将一颗泪腺转移至1×PBS中。</li>
	<li>使用两把无菌手术刀，将腺体精细切割成小碎片，直至形成柔软、糊状的质地。确保在切割过程中组织碎片始终浸没于PBS中，但避免其在培养皿内自由漂浮。</li>
	<li>将组织碎片聚集于培养皿一侧，吸除残余PBS，并用1 mL新鲜预冷的PBS洗涤碎片。</li>
	<li>将洗涤后的组织碎片转移至6孔板中，每孔加入2 mL预热的消化液。在处理所有样品期间，将6孔板保持在冰上。</li>
</ol>
5. 第一次酶消化（约1.5 - 2小时）
<ol>
	<li>将培养板置于37 °C、60 rpm的摇动水浴中孵育30分钟。</li>
	<li>使用宽口1 mL枪头轻柔吹打组织15次，然后将培养板放回37 °C、60 rpm的摇动水浴中继续孵育30分钟。</li>
	<li>使用普通1 mL枪头轻柔吹打样品10次，然后将培养板放回37 °C、60 rpm的摇动水浴中继续孵育30分钟。</li>
	<li>轻柔吹打样品10次，然后将细胞悬液转移至2 mL Dolphin微量离心管中。</li>
	<li>向培养板的每孔中加入1 mL预冷的BM1，以收集含有残留细胞的消化液。将培养板置于冰上，直至进行下一步操作。 
	注意：如果此时仍可见较大的细胞团块或组织碎片，可将每次孵育时间延长10-20分钟。但吹打次数不得超过规定范围（最多10-15次轻柔吹打），因为过度的机械剪切会降低细胞活力。</li>
</ol>
6. 终止酶活性及初次洗涤（约 15 分钟）
<ol>
	<li>将含有细胞悬液的离心管在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。将初始培养板各孔中的 BM1（含有残留细胞）转移至对应的离心管中，并轻轻重悬细胞沉淀。</li>
	<li>用额外的 600 µL 冷 BM1 冲洗每个孔，并将洗涤液合并至对应的离心管中，以收集所有剩余细胞。</li>
	<li>轻轻重悬细胞悬液，再次在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。</li>
</ol>
7. Accutase 和 DNase 处理（约 30 - 35 分钟）
<ol>
	<li>向细胞沉淀中加入 1 mL Accutase，并轻轻重悬。在 37 °C、60 rpm 条件下孵育 5–10 分钟。 
	注意：孵育期间将离心管平放，以防止细胞沉降并粘附于管底。</li>
	<li>使用 1 mL 移液枪头轻轻吹打 10 次。</li>
	<li>加入 1 mL 冷的 BM2 以稀释 Accutase，终止酶反应。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 DNase 处理所需的培养基重悬细胞，加液至管口满溢。</li>
	<li>室温孵育 10 分钟，于 5 分钟时轻柔重悬一次。</li>
	<li>同时，将 70 µm 细胞筛置于 15 mL 尖底离心管上，并加入 1 mL BM3 预润湿。</li>
	<li>将细胞悬液转移至筛网上。</li>
	<li>用 1 mL BM3 冲洗原始收集管，并将冲洗液转移至同一筛网。</li>
	<li>再用额外的 5 mL BM3 清洗筛网。</li>
</ol>
8. 细胞计数与活力检测
<ol>
	<li>取10 µL BM3中的过滤后细胞悬液，与10 µL台盼蓝混合。通过台盼蓝染色排除法测定细胞浓度和活率，并通过手动计数或自动细胞计数仪（例如Countess 3自动细胞计数仪）进行定量。仅当细胞活率达到下游应用所需阈值时（通常为≥70-80%），方可继续后续操作。 
	注意：计算得率时，请考虑当前15 mL离心管中的总体积约为7-9 mL。</li>
	<li>根据下游应用继续操作。如进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），请进入第9节；如进行基于流式细胞术的细胞分选，请进入第10节。 
	注意：单细胞RNA测序流程中包含红细胞裂解和磁珠法去除死细胞，以减少碎片和游离RNA，提高数据质量。然而，这些步骤可能因优先影响脆弱或稀有的上皮细胞群体（包括腺泡细胞）而导致细胞类型表征出现偏差。对于基于流式细胞术的分选，为最大化细胞回收率并保留细胞表面表位，已省略上述步骤。因此，应根据实验目标选择流程：若以scRNA-seq为主，则优先考虑数据质量；若以细胞分选及后续应用为主，则优先考虑细胞回收率和活率。</li>
</ol>
9. 单细胞RNA测序用细胞的制备（约1 - 1.5小时）
<ol>
	<li>通过将10倍浓缩的溶液用超纯水稀释，制备1倍红细胞（RBC）溶液。</li>
	<li>将含有细胞悬液的15 mL离心管在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用5 mL 1倍RBC缓冲液重悬细胞沉淀，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>再次在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用2 mL冷BM4缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>取10 µL经滤膜过滤后的BM4细胞悬液，与10 µL台盼蓝混合，用于评估细胞浓度和活力。</li>
	<li>用1 mL 1倍HBSS预润MACS 30 µm滤网，将细胞悬液经滤网过滤至15 mL离心管中。</li>
	<li>用2 mL冷BM4缓冲液冲洗之前的收集管，并将洗涤液通过同一滤网进入15 mL离心管。</li>
	<li>再用额外的10 mL冷BM4缓冲液冲洗滤网。</li>
	<li>将15 mL离心管在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，并完全移除上清液。</li>
	<li>轻轻将沉淀重悬于100 µL MACS磁珠中，在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>同时，使用无菌双蒸水从死细胞去除试剂盒中配制1倍结合缓冲液（BB）。</li>
	<li>用500 µL 1倍BB冲洗MACS MS柱以进行平衡。</li>
	<li>向样品中加入400 µL BB，用磁珠重悬细胞，并将全部体积加至已平衡的MS柱上。将穿流液收集至15 mL离心管中。</li>
	<li>每次用500 µL BB洗涤柱子共四次，收集所有穿流液组分。</li>
	<li>将收集的穿流液在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用400 µL MSC缓冲液轻轻重悬细胞，将悬液转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>用700 µL MSC缓冲液冲洗之前的离心管，并将洗涤液与样品合并。</li>
	<li>在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>使用宽口吸头在MSC缓冲液中轻轻重悬细胞沉淀，最终体积约为1.5 mL。</li>
	<li>再次在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>保留约100 µL上清液，轻轻重悬沉淀，取6 µL细胞与6 µL台盼蓝混合，再次计数细胞。</li>
	<li>用MSC缓冲液调整最终体积，使细胞浓度达到700–1200个细胞/µL，并重新计数以确认细胞浓度。</li>
	<li>在进行10x Chromium单细胞测序处理（Chromium Single Cell 3' Solution V3）前，确保红细胞裂解和死细胞去除后的细胞活力≥70%（通常为70–95%）。</li>
	<li>应用基本的单细胞RNA测序质量控制标准：UMI数 &#62; 500，基因数 &#62; 200，线粒体基因比例 &#60;15%。采用较宽松的线粒体阈值（15%），以保留代谢活性较高的上皮细胞群体。仅将满足所有质量控制标准的细胞纳入后续分析。 
	注：这些质量控制阈值是我们数据集得出的示例值（补充图1），已在我们先前的出版物18中报道。</li>
</ol>
10. 基于流式细胞术的细胞分选前细胞准备（约 1 - 1.5 小时）
<ol>
	<li>为了通过流式细胞术分离 MEC 和成纤维细胞，分别使用 PdgfraEGFP 和 Acta2GFP 报告基因小鼠品系，以实现对各细胞群体的精确定位。</li>
	<li>将含有细胞悬液的 15 mL 离心管在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用预冷的 FACS 缓冲液重悬细胞沉淀，最终浓度为每 100 µL 含 5 × 10⁵ 至 2 × 106 个细胞。</li>
	<li>准备流式细胞术补偿所需的对照样本：阴性对照——来自野生型小鼠的未染色细胞；背景荧光对照——来自 Acta2GFP 和 PdgfraEGFP 小鼠的未染色细胞；单染对照——来自野生型小鼠并用实验中每种抗体单独染色的细胞。 
	注意：每份对照样本应至少使用 1 × 10⁵ 个细胞，重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。</li>
	<li>加入 FcBlock（1:100），冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>加入 CD326（EpCAM）-APC 单克隆抗体（1:100）或 CD140a（PDGFRα）单克隆抗体（1:100），避光冰上孵育 45 分钟。</li>
	<li>抗体孵育期间，每隔 15 分钟轻轻重悬细胞一次。</li>
	<li>用预冷的 FACS 缓冲液将每支离心管加满，于 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>在 FACS 缓冲液中配制 FxCycle 工作液（1:1000）。</li>
	<li>将样本用含 FxCycle 的 1 mL 预冷 FACS 缓冲液重悬，对照样本则用 500 µL 重悬。</li>
	<li>将所有样本转移至流式细胞仪专用管中，置于冰上并避光保存。</li>
	<li>立即送至流式细胞术核心平台进行分选。根据下游应用需求，将分选后的细胞收集至 FACS 缓冲液、培养基、裂解缓冲液或 RNAlater 中。 
	注意：仪器设置（如喷嘴尺寸和压力）及事件速率取决于分选仪配置和目标细胞群体；因此，建议先进行初步预实验，以确定每次实验的最佳参数。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者声明均无利益冲突。

本文中，我们优化并评估了一种显著改进的从外分泌组织制备单细胞悬液的方案，重点针对泪腺。利用该方法，我们成功从老年和年轻个体的泪腺中获得了纯净且高质量的单细胞悬液，适用于单细胞测序及其他下游应用。
尽管已有多种组织解离方案可供使用，但我们仍需对其进行修改和优化，以高效回收在分离过程中最易受损的细胞群体。由于某些特定细胞群体十分脆弱，同时组织中上皮和间充质细胞群体并存且难以分离，因此我们从一开始就排除了仅依赖非酶法机械解离的方案21,22。冷酶解离法依赖于来自嗜冷生物的蛋白酶，这些酶在低温（0–10 °C）下仍具有较高的催化活性，可在低温条件下进行组织解离，从而最大限度地减少因应激引起的转录激活假象16,23。然而，该方法需要显著更长的分离时间，这使得后续步骤（如单细胞RNA测序或流式细胞分选分析所需的及时细胞制备）变得复杂。由于操作上的限制，这些步骤无...

泪腺（LG）是一种外分泌性管泡状腺体，负责分泌泪膜的水性层。在人的一生中，角膜表面和泪腺均可能遭受细菌和病毒感染，这些感染可能导致上皮细胞系统性破坏、慢性炎症反应的启动、免疫细胞浸润泪腺以及组织再生能力的缺失。随着年龄增长，慢性炎症性疾病的发病率随之升高1。其中，干眼症（DED）是全球范围内导致视力障碍的十大常见病因之一，也是造成老年人群独立性下降、行动能力受限及日常功能减退的主要因素之一2。DED的主要病因之一是泪腺功能障碍3。
随着年龄增长，小鼠和人类的泪腺（LG）会发生显著的结构和功能改变，包括腺泡细胞萎缩、导管扩张、免疫细胞浸润、纤维化以及脂质沉积4,5,6,7。这些退行性变化还常伴随泪腺的慢性炎症和组织纤维化3,5,8,9。尽管衰老与泪腺病理之间存在明确关联，但驱动这些变化的分子和细胞机制仍不清楚。
单细胞RNA测序能够全面分析细胞群体及其在衰老过程中的转录变化10。该方法可无偏倚地鉴定泪腺中不同的细胞类型和状态，揭示衰老如何改变基因表达谱、免疫细胞浸润以及上皮-间质相互作用。
目前，已有多种组织解离方法可供使用，包括机械解离法11以及在37 °C下使用胶原酶、分散酶或胰蛋白酶等酶进行温育消化的方案12。针对肝脏、肺、肾、心脏及多种肿瘤组织等多种组织类型，已有不同的解离策略被报道13,14,15。然而，由于老年泪腺组织纤维化程度增加且细胞更为脆弱，从中制备具有活性的单细胞悬液在技术上仍具挑战性。此外，正如我们先前所报道，脆弱的腺泡细胞回收尤为困难，因为解离过程中细胞膜通透性的改变可能导致这些体积较大、具有分泌功能的细胞释放大量胞内RNA，从而增加后续单细胞测序数据中的背景信号16。尽管已有若干研究报道了衰老泪腺的单细胞RNA测序图谱，但这些数据集的质量受限于不够理想的解离方法，导致上皮细胞的得率低于间质细胞群体。本文中，我们提供了一种详细且经过优化的方案，用于高效解离老年小鼠泪腺组织，并分离出可用于后续单细胞RNA测序（scRNA-seq）和批量RNA测序（bulk RNA-seq）分析的 distinct 细胞群体（图1）。该方法为研究与年龄相关的泪腺功能障碍的分子机制提供了有力工具。
该方案能够从老龄泪腺组织中制备出高质量且具有活性的单细胞悬液，为全面的转录组学分析提供了可靠基础。该方法可实现对多种细胞群体的详细鉴定和分子特征分析，包括经历年龄相关变化的肌上皮细胞、成纤维细胞以及其他上皮和间质细胞类型。优化后的实验流程可有效保持细胞完整性，并最大限度减少因应激引起的转录偏差，从而准确反映体内细胞的真实状态。此外，该方法具有广泛的适用性，可推广至其他外分泌腺体或纤维化组织的研究，尤其适用于需要温和解离组织并精确分离特定细胞群体的下游单细胞分析研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (1&amp;nbsp;M 溶液)</td><td>BioVision</td><td>B1010-100</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>死细胞去除试剂盒</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>死细胞去除试剂盒</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>分散酶 II</td><td>Roche</td><td>C756V28</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，超低 IgG</td><td>Gibco</td><td># 16250078</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Corning (Thermo Fisher Scientific)</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1&amp;nbsp;M 溶液)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷溶液</td><td>Covertus</td><td># 11695067772</td><td></td></tr><tr><td>MACS&amp;reg; SmartStrainers (30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS&amp;reg; SmartStrainers (70 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>Medium/F12 (DMEM/F12)</td><td>Millipore</td><td>DF-042-B</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MS 柱</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M 储存液)</td><td>Invitrogen&amp;trade;</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500ML</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液 (10&amp;times;)</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>超纯 EDTA (0.5M, pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD140a (PDGFRA) 单克隆抗体 (APA5)，APC-eFluor&amp;trade; 780，大鼠 / IgG2a, kappa</td><td>eBioscience</td><td>47-1401-82; RRID:AB_2784706</td><td></td></tr><tr><td>FcBlock (CD16/CD32 Fc 阻断剂)</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>553141; RRID:AB_394656</td><td></td></tr><tr><td>FxCycle&amp;trade; Violet 染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10347</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 CD326 (EpCAM)-APC 单克隆抗体 (G8.8)，大鼠 IgG2a, kappa</td><td>eBioscience</td><td>17-579182; RRID:AB_2716944</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Acta2GFP&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>由 Ivo Kalajzic 博士惠赠</td><td>PMID: 18571490</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;PdgfraEGFP&amp;nbsp; - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J&lt;/em&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>RRID:IMSR_JAX:007669</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&amp;trade;&amp;nbsp;Countess&amp;trade; 3 自动细胞计数仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>A49862; RRID:SCR_026963</td><td></td></tr></tbody></table>

从老年泪腺和唾液腺中分离肌上皮细胞与成纤维细胞的单细胞解离、rna测序操作方案

Protocol for Single-Cell Dissociation, RNA Sequencing, and Isolation of Myoepithelial Cells and Fibroblasts from the Aged Lacrimal and Salivary Glands

泪腺（LG）的老化与泪液分泌减少和慢性炎症相关，是导致干眼症的重要因素。与年龄相关的泪腺变化包括免疫细胞浸润、细胞损伤、腺泡细胞内脂质积聚、细胞外基质沉积以及导管扩张。单细胞RNA测序（scRNA-seq）为解析衰老过程中细胞异质性和转录变化提供了强有力的手段；然而，由于老年泪腺组织纤维化程度增加、细胞脆弱性升高以及脂质积聚，制备可存活的单细胞悬液在技术上具有挑战性。本研究提出了一种优化的、可重复的实验方案，可高效解离老年小鼠泪腺并分离多种细胞类型，适用于后续的单细胞RNA测序分析。重要的是，该方案同样适用于年轻泪腺、结膜以及其他外分泌组织。该流程采用分步酶解策略，首先使用胶原酶IV、分散酶II和DNase I进行组织初步消化，随后用Accutase解离残留的细胞团块，并通过最终的DNase I处理获得纯净的单细胞悬液。为最大限度减少细胞损伤，所有塑料器皿均预先用含牛血清白蛋白的PBS包被，且组织处理过程在严格控制的温度和振荡条件下进行。红细胞裂解及通过多级滤网的连续过滤进一步提高了细胞纯度。通过报告基因小鼠品系结合荧光激活细胞分选（FACS）实现特定细胞类型的分离。利用Acta2GFP和PdgfraEGFP&#160;小鼠，在使用EpCAM抗体进行免疫染色后，我们成功分离了肌上皮细胞和成纤维细胞。FACS可将EpCAM⁺/αSMA⁺的肌上皮细胞群分离出来，而PdgfraEGFP小鼠中的EGFP⁺细胞则代表成纤维细胞群体。该方案可从老年泪腺中获得高质量、高活性的单细胞悬液，并可便捷地推广至其他需要温和解离和靶向细胞分离的纤维化或衰老外分泌组织。

由于脂质积聚和大量细胞外基质（ECM）沉积，老化外分泌腺的解离具有挑战性。老化腺体表现出明显的淋巴细胞浸润以及显著的导管扩张，并伴有管腔内物质积聚，反映了使组织解离复杂化的结构和炎症性改变。泪腺是一种外分泌器官，由三种主要的上皮细胞类型组成：腺泡细胞、导管细胞和肌上皮细胞。腺泡细胞产生泪膜中的水相和蛋白质成分，以维持角膜的水合状态，并提供抗菌和促进伤口愈合的功能。在老化泪腺（LG）中，慢性炎症与上皮损伤、免疫细胞浸润、腺泡细胞内脂质积聚、细胞外基质沉积增加以及导管扩张相关，这些变化均可损害泪液分泌并进一步增加组织异质性（图2）。尽管如此，我们的方案能够有效解离泪腺，并在年轻（2个月）和老化（20个月）腺体中均成功鉴定出所有主要的细胞簇。UMAP分析显示，上皮和间质细胞群体均得到良好表征，包括MEC和成纤维细胞（图3A–C），以及多种免疫细胞（图3A、B）。与年...

本方案描述了一种优化的分离老龄小鼠泪腺以获取可用于单细胞RNA测序的活单细胞的方法。通过依次进行酶消化并配合轻柔操作，可保持细胞完整性，获得高质量的单细胞悬液，适用于分离特定细胞类型，并对泪腺细胞群中与衰老相关的变化进行转录组学分析。

从老年泪腺和唾液腺中分离肌上皮细胞与成纤维细胞的单细胞解离、RNA测序操作方案

泪腺老化与泪液分泌减少及慢性炎症相关，是导致干眼症的重要因素。与年龄相关的泪腺……

我的实验室利用流式细胞术和单细胞RNA测序技术，研究衰老相关的唾液腺和泪腺变化如何影响不同类型的细胞。传统的解离方法难以有效回收衰老唾液腺和泪腺中脆弱的上皮细胞。而我的实验方案可提高细胞活性，实现可靠的单细胞分析和细胞分选。首先，将已处死的小鼠仰卧位放置于解剖台上。使用精细镊子和剪刀，从眼与耳之间的位置切开皮肤。轻柔地牵拉皮肤以暴露泪腺。使用钝头镊子轻轻提起泪腺。通过轻柔地以环形动作剥离周围结缔组织，仔细分离。辨认泪腺的可见边界，并将其与邻近组织（包括腮腺）分离。然后将泪腺转移至一个含有2毫升冰冷PBS、置于冰上的35毫米培养皿中。在解剖显微镜下，去除残留的脂肪，并小心剥离泪腺表面的结缔组织被膜。将一个无菌的35毫米培养皿置于冰上备用。向培养皿中央加入 800 至 1000 微升冷 PBS，并将一个泪腺转移至 PBS 中。确保组织始终浸没在 PBS 中。使用两把无菌手术刀，将泪腺仔细切碎成小片段，直至形成柔软的糊状物。将组织碎片收集至培养皿的一侧。吸除残留的 PBS，并用一毫升新鲜的冷 PBS 清洗碎片。将清洗后的组织碎片转移至 12 孔板中，每孔加入两毫升预热的消化液。将培养皿放入摇动水浴中，在 37 摄氏度、60 转/分钟的条件下孵育 30 分钟。使用宽口 1 毫升移液器吸头，轻轻吹打组织 15 次。将培养皿重新放回摇动水浴中，继续孵育 30 分钟。接下来，使用普通的1毫升移液枪头，轻轻吹打样本10次，再次孵育30分钟。然后再次轻轻吹打样本10次，并将细胞悬液转移至2毫升离心管中。向培养板的每个孔中加入1毫升预冷的封闭液一（BM1），以收集含有残留细胞的消化液，并将培养板置于冰上，直至下一步操作。 将含有细胞悬液的离心管在4°C条件下以300 G离心5分钟。弃去每管中的上清液。将含有残留细胞的培养板各孔中的BM1转移至对应的离心管中。接下来，向每个孔中加入 600 µL 冷的 BM1 以洗涤残留的细胞，并将洗涤液转移至相应的离心管中，与细胞悬液合并。轻轻重悬细胞悬液。将离心管再次在 4 °C 条件下以 300 ×g 离心 5 分钟，弃去上清液。向细胞沉淀中加入1 mL的Accutase，轻轻重悬细胞。将离心管置于37°C、60 rpm条件下孵育5至10分钟。使用1 mL移液枪头，轻柔吹打样本10次。然后向管中加入1毫升冷的BM2，通过稀释Accutase来终止酶反应。在4°C下以300 ×g离心5分钟，并弃去上清液。向管中加入含有DNase 1的培养基，DNase 1浓度为每毫升200单位，重悬细胞并加培养基至管口。将试管在室温下孵育10分钟，并在5分钟后轻轻重悬一次。同时，将一个70微米的细胞筛置于15毫升锥形管上，并用1毫升BM3预湿筛网。孵育结束后，将细胞悬液转移至筛网上。向原始收集管中加入一毫升 BM3 以冲洗管壁，并将冲洗液转移至同一滤器中。再用额外的五毫升 BM3 冲洗滤器。最后，使用台盼蓝染色法和自动细胞计数仪测定滤后细胞悬液的细胞浓度和细胞活力。进行后续应用，例如用于基因表达谱分析的单细胞RNA测序，或基于流式细胞术对荧光标记的细胞群体进行分选。单细胞RNA测序数据的UMAP分析在泪腺中鉴定了代表性良好的上皮和间质细胞群体，包括肌上皮细胞和成纤维细胞，以及多种免疫细胞群体。衰老的泪腺中含有大量表达IGHM和IGHD的浆细胞和活化B细胞。通过连续的流式细胞术设门，可清晰区分出EpCAM阳性、GFP阳性的肌上皮细胞与EpCAM阴性、GFP阳性的血管壁细胞。表达PDGFRα的GFP阳性成纤维细胞为EpCAM阴性，因而可与上皮细胞相区分。在PDGFRα-EGFP小鼠中，所有GFP阳性细胞均表达I型胶原，证实其成纤维细胞身份。流式细胞术分析显示，99.6%的GFP阳性细胞对应于PDGFR alpha免疫染色的细胞。本方案旨在从泪腺中分离出有活力的单细胞，用于上皮、间质和免疫细胞群体的分子表征。主要挑战是在解离脆弱的老化组织时，尽量减少机械和酶解损伤，同时保持较高的细胞活力，以适用于单细胞RNA测序。按照此操作步骤，分离的细胞可用于单细胞RNA测序、批量RNA测序以及特定细胞群体的分子谱型分析。分选后的细胞也可培养用于下游功能检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

单细胞解离、RNA测序及分离老年泪腺和唾液腺的肌上皮细胞和成纤维细胞的方案

器官特异性感觉神经元难以鉴定。利用荧光示踪剂Fast...

一种靶向并分离小鼠气道支配感觉神经元的方法

本实验方案的目的是利用激光显微切割技术（LCM），从未经固定、新鲜切除的人类肠道组织中分离肠神经节，并获得高完整性的RNA样本。该方案包括制备速冻的人类肠道组织样本、冷冻切片、乙醇染色与脱水、激光显微切割以及RNA提取等步骤。...

优化激光显微切割技术以分离新鲜冷冻人组织中的肠神经节

泪腺（LG）含有两种表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）的细胞类型：肌上皮细胞（MECs）和周细胞。MECs起源于外胚层，存在于多种腺体组织中，而周细胞是起源于内胚层的血管平滑肌细胞。本方案从鼠类LG中分离MECs和周细胞。...

从小鼠成年泪腺和下颌下腺中分离肌上皮细胞

我们介绍一种分离和培养原代人唾液腺来源上皮细胞的方法。这些细胞表现出与唾液腺上皮来源一致的基因表达模式，可在来源于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的基底膜基质上以唾液球（salispheres）形式培养，也可在经处理的培养皿上以单层形式生长。...

从人唾液腺中分离唾液腺上皮细胞用于体外培养形成唾液球或单层细胞

本方案描述了利用激光显微切割技术从新鲜冷冻的小鼠胚胎切片中分离软骨和骨组织的方法。通过焦宁Y染色可快速可视化软骨和骨组织，并可精确采集，以获得高质量的RNA用于转录组分析。...

激光捕获显微切割小鼠胚胎软骨与骨骼用于基因表达分析

获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。...

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

本方案介绍了一种快速、高效且温和的方法，适用于从持续生长的小鼠门齿、小鼠磨牙以及人类牙齿中分离单细胞，以进行单细胞RNA测序分析。...

从小鼠和人类牙齿中快速分离单个细胞

介绍了一种小鼠输卵管显微解剖方法，该方法可在保持RNA完整性的前提下分离并收集输卵管的各个节段。此外，还描述了一种非酶法的输卵管细胞解离步骤。这些方法适用于对功能不同的输卵管节段以及解离后的输卵管细胞进行后续的基因和蛋白质分析。...

小鼠输卵管的显微解剖与分离：各节段识别及单细胞获取

本文提供了一种简化的小鼠嗅上皮解剖与解离方案，用于单核RNA测序。...

小鼠嗅上皮组织快速解剖与解离以制备单细胞核悬液

本方案详细描述了小鼠眼晶状体上皮细胞与纤维细胞大量组织的分离步骤，随后进行RNA提取及qPCR分析。该方法可实现晶状体不同细胞区室的分离，从而更深入地分析上皮细胞与已分化的纤维细胞在转录组及生物学过程中的差异。...

从小鼠眼晶状体上皮和纤维细胞团块中分离RNA

学习从老年小鼠泪腺中分离高活性单细胞的方法，用于单细胞RNA测序和流式细胞术分析。该方案通过优化酶解消化步骤，有效分离肌上皮细胞、成纤维细胞及免疫细胞群体，为研究腺体衰老机制提供可靠技术支撑。

从老年泪腺和唾液腺中分离肌上皮细胞与成纤维细胞的单细胞解离、RNA测序操作方案

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