Synthesis, Hemoglobin Encapsulation and Biorthogonal PEGylation in Hierarchically Porous UiO-66 Nanoparticles for Oxygen Delivery Applications

本研究旨在定义一种稳定的金属有机框架，基于MOF的纳米颗粒用于血红蛋白封装和氧气输送。层叠多孔型态可以克服血红蛋白封装的后体尺寸限制，且表面种群能增强颗粒在生理环境中的稳定性。首先，准确称重50毫克备制的层级多孔UIO 66胺纳米颗粒，放入一个25毫升圆形底部瓶中。

向烧瓶中加入10毫升四氢呋喃。然后对混合物进行超声波五分钟，使颗粒完全分散，产生均匀不透明的悬浮液。将圆底烧瓶放入冰水浴中，置于设定为400转/分钟的磁性搅拌器上。

使用玻璃注射器，在五分钟内滴入0.4毫升三丁基亚硝酸盐，同时保持温度低于5摄氏度。立即在同样低温条件下滴滴加入0.35毫升三甲基SL叠氮化物。可能会出现轻微的气泡，表明氮化进展。

然后用铝箔包裹冰水浴，保护反应免受光照伤害。在冰水浴中继续搅拌反应混合物一夜。第二天，按照图示洗涤和烘干产品。

然后使用FTIR光谱法验证化学转化。将5毫克分层多孔的UIO 66叠氮化纳米颗粒转移到2毫升离心管中。加入0.5毫升HEPES缓冲液，进行超声波处理2到5分钟。

加入0.5毫升含20毫克每毫升血红蛋白的HEPES缓冲液，轻轻倒置管子多次，使纳米颗粒完全扩散。现在将管子放在热摇杆上，在室温下以1000转/分钟摇晃两小时。培养后，在室温下以13,500克离心五分钟，沉淀装载的血红蛋白层级多孔UIO 66叠氮纳米颗粒。

然后仔细收集上清液，用于定量未被困的血红蛋白。用一毫升超纯水轻轻清洗沉淀三次，通过移液法上下吸血，去除松散吸收的血红蛋白。然后仔细采集每次洗涤液的上清液，以定量被困的血红蛋白。

将最终沉淀重新悬浮于0.5毫升超纯水中，并在表征前存放于冰箱。使用月桂硫酸钠血红蛋白测定法确定收集的上清液中被困血红蛋白。将每种上清液移液10微升移入96孔微板。

加入100微升月桂硫酸钠试剂，在室温下黑暗中培养五分钟。使用紫外可见光分光度计，测量412纳米的吸收强度。随后，在HEPES缓冲液中准备血红蛋白连续稀释，生成标准曲线。

将预备好的稀释液转移到预备好的96孔板中，生成一条标准曲线，将吸收读数转换为血红蛋白浓度。将10毫克含层级多孔的血红蛋白UIO 66叠氮化纳米颗粒转移到一个2毫升离心管，管内含0.5毫升超纯水，进行超声处理2到5分钟。加入20毫克用聚乙二醇修饰的二苯并环霉素，达到聚乙二醇与纳米颗粒的等摩尔比例。

轻轻地将管子旋转，直到混合物均匀。将管子放在热摇杆上，在室温下孵育，摇晃时以1000转/分钟摇晃一小时。然后将管子转移到保持4摄氏度的冰箱中进行过夜反应。

在室温下以12,000克离心五分钟，沉淀出聚乙二醇修饰、血红蛋白负载、层级多孔的UIO 66纳米颗粒。然后丢弃含有无反应聚乙二醇的上清液。用两毫升超纯水在相同条件下上下移液和离心，将沉颗粒洗涤三次。

将纯化的富基化血红蛋白、层级多孔的UIO 66聚乙二醇纳米颗粒重新悬浮在两毫升超纯水中。悬挂设备存放在四摄氏度。所得胶体呈现均匀且略带乳白色，表明良好的分散稳定性。

然后通过动态光散射（DLS）确认成功实现双洹化。表面氨基成功转化为叠氮化物。这一点通过层层多孔的UIO 66叠氮纳米颗粒FTIR光谱中2,122反向厘米处出现的特征性不对称叠氮化物拉伸带得以证明。

该能带在层级多孔的UIO 66胺纳米颗粒中缺失。血红蛋白被包通过明显的黄色转红色可见。血红蛋白加载后氮吸收减少，表明中间孔被血红蛋白分子占据。

层级多孔的UIO 66叠氮纳米颗粒的ζ电位在血红蛋白封装后从42.9毫伏降至20.4毫伏。通过在2,122反向厘米处叠氮化物拉伸振动消失以及FTIR频谱中出现聚乙二醇相关信号，确认了聚乙二醇的成功共轭。DLS分析显示，撴化后流体动力学直径从约114.9纳米增加到140.8纳米，同时保持较低的PDI。

该颗粒使得合成层级多孔形态纳米颗粒、血红蛋白封装、表面封闭以及氧气释放功能评估成为可能。利用该方案，可以进行额外的物理化学表征和功能研究，包括体外氧释放和纳米颗粒生物相容性的分析。未来的研究可以聚焦于保护血红蛋白功能以维持更长时间的原因，比如加入防止实质降解的成分。