Name: 在层层多孔的UiO-66纳米颗粒中合成、血红蛋白封装及双正交PEG化，用于氧气输送应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解在UiO-66纳米颗粒中封装血红蛋白并进行双正交PEG化的方法，用于构建基于血红蛋白的氧载体。该方案实现了规模化制备与优异的稳定性。

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我们衷心感谢欧洲研究理事会（European Research Council）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助编号：101002060）下的资助支持。

作者声明不存在竞争性财务利益。

本方案提供了一种稳健且可重复的方法，用于合成、功能化及表征专为血红蛋白（Hb）包封和氧输送应用设计的HP-UiO-66纳米颗粒（NPs）。通过采用由内而外的工程化策略，本研究建立了一个可广泛推广的框架，用于设计适用于生物医学领域的金属有机框架（MOF）纳米颗粒，包括生物大分子和药物递送系统。尽管该材料的基本概念和功能性能此前已有报道，但本方案通过强调操作的清晰性、可重复性及可扩展性，显著拓展了先前的研究。文中提供了详细的处理步骤、对敏感环节的故障排除指导以及克级规模合成的实用操作说明，以促进在不同实验室间的可靠实施。如下所述，若干步骤对于获得结构和功能特性均最优的稳定纳米颗粒尤为关键。
HP-UiO-66-NH2 纳米颗粒的缺陷合成 
缺陷工程策略依赖于引入DA作为调节剂，使其与主要连接体BDC-NH2竞争与Zr4+节点的配位。这种竞争有意产生&#34;缺失连接体&#34;缺陷，随后在去除调节剂后转化为可及...

充足的氧合在多种生物医学环境中对有效治疗和组织修复至关重要1。在创伤和手术出血情况下，严重的缺氧可能危及生命，当供体血液不可获得时，安全的血液替代品显得尤为必要2。在肿瘤学中，缺氧的肿瘤区域会限制依赖氧气的治疗效果，而补充氧气输送可显著提高治疗疗效3,4,5,6。氧气在伤口愈合过程中也起着核心作用，增加氧气的可利用性可促进血管生成和组织修复7。同样，在缺血状态和器官移植中，氧载体可减轻缺氧性损伤，改善组织存活率和恢复能力8,9。
合成血红蛋白（Hb）类氧载体（HBOCs）是缓解缺氧的一种有前景的策略10。然而，红细胞（RBCs）外的血红蛋白本质上不稳定，会迅速解离为二聚体，这些二聚体可通过清除一氧化氮引发肾毒性、氧化损伤和血管收缩11。为应对这些挑战，已开发出包封策略，将血红蛋白稳定在生物相容性纳米载体中，例如脂质体12、聚合物囊泡13和聚合物纳米颗粒（NPs）14,15,16,17。尽管这些系统可提高血红蛋白的稳定性，但在保持天然氧结合功能的同时实现高包封效率仍具挑战性18。此外，氧化转化为高铁血红蛋白以及血红素泄漏可能损害其携氧能力19。快速清除和过早的血红蛋白泄漏进一步限制了循环时间及临床转化潜力20。
金属有机框架材料（MOFs）因其结晶结构、高比表面积和可调的孔隙率，近年来已成为药物和生物大分子递送的多功能纳米平台21。MOFs由金属节点与有机连接体配位构成，能够实现分子扩散和结构定制，因而适用于多种生物医学应用。然而，大多数MOFs主要具有微孔结构（&#60;2 nm），严重限制了蛋白质、核酸或酶等大分子在合成后的负载22,23,24,25。克服这一限制的一种方法是原位仿生矿化法，即在MOF生长过程中利用生物分子作为成核中心，该策略已在ZIF-8和ZIF-90中得到验证26,27,28。尽管该方法有效，但其合成条件需保持温和，从而限制了可适用的MOF化学体系的范围29,30。
UiO-66 是一种基于锆的金属有机框架材料（MOF），由 Zr6O4(OH)4 八面体节点和 1,4-苯二甲酸（BDC）连接单元构成，以其卓越的化学稳定性和生物相容性而著称31。其坚固的框架在水相和生理环境中均能抵抗分解，因此非常适合用于生物医学应用32。然而，其固有的微孔结构限制了其在生物大分子封装方面的应用。血红蛋白（Hb）的分子尺寸约为 5 nm，无法进入原始 UiO-66 的内部孔道。因此，目前仅有少数研究探索了 UiO-66 在与 Hb 相关体系中的应用，且这些研究主要将 MOF 用于基于表面的 Hb 检测，而非框架内的封装33,34。因此，基于 UiO-66 的 Hb 封装平台仍相对缺乏发展。
最近，我们开发了一种具有分级多孔结构的UiO-66纳米颗粒（HP-UiO-66 NP），通过引入可容纳血红蛋白（Hb）的介孔区域，克服了孔径尺寸受限的问题，从而拓展了UiO-66在血红蛋白氧载体（HBOC）开发中的功能应用范围35。分级孔隙结构是通过缺陷工程实现的，具体方法是在合成过程中使用长链单羧酸（如十二烷酸（DA））作为调节剂36,37。该调节剂会与BDC配体竞争与Zr4+的配位，从而导致缺陷形成并扩大介孔孔径。随后去除调节剂后，即可获得同时具有微孔和介孔结构域的HP-UiO-66纳米颗粒，其孔径大小可通过调节剂的浓度或碳链长度进行调控36。
尽管引入介孔结构可提高分子可及性，但在含磷酸盐的缓冲液中可能损害骨架完整性。磷酸根离子可与锆（Zr）簇配位，导致部分或完全的结构解体38,39。因此，必须采用表面稳定化策略，以在生理条件下维持胶体和化学稳定性40。通常，金属有机框架（MOF）的表面稳定化可通过非共价相互作用（如范德华力和氢键）41、与暴露金属位点的配位作用42，或与有机连接基团的共价连接43来实现。在各类连接基团中，聚乙二醇（PEG）因其广泛可得性和较低的合成复杂性而尤为引人关注44。重要的是，PEG表面修饰（通常称为PEG化）赋予药物递送系统多种有利特性，包括优异的生物相容性、减少非特异性蛋白吸附，以及降低免疫识别和巨噬细胞摄取45,46。总体而言，这些效应可降低免疫原性反应并延长系统循环时间47。
传统的聚乙二醇化（PEGylation）技术通常依赖于碳二亚胺或马来酰亚胺化学方法，这些方法通常需要催化剂或反应性中间体，可能损伤血红蛋白（Hb）等敏感生物分子。为克服这一局限，我们采用应变促进的炔烃-叠氮化物环加成反应（strain-promoted alkyne-azide cycloaddition, SPAAC），这是一种无催化剂、具有生物正交性的反应，发生在叠氮化物与二苯并环辛炔（DBCO）功能化分子之间，可在温和的水相条件下实现位点特异性的偶联35,48。该方法可在不损害包封Hb功能的前提下，实现高效的表面修饰。
在我们先前报道的HP-UiO-66纳米颗粒35基础上，本研究此前侧重于结构设计与生物功能验证，而本实验方案则通过提供参数范围明确、关键操作注意事项清晰的详细分步实验流程，强调方法的透明性与可重复性。针对合成、血红蛋白（Hb）包封以及通过SPAAC化学进行聚乙二醇化（PEGylation）等关键步骤，本方案提供了相应的故障排除指导，最终获得稳定的Hb@HP-UiO-66-PEG纳米颗粒（见图1）。
该工作流程包括：(i) 使用DA作为调节剂进行缺陷工程，合成氨基修饰的HP-UiO-66-NH2纳米颗粒；(ii) 对表面氨基进行叠氮功能化；(iii) 在温和的水相条件下包封血红蛋白（Hb）；(iv) 通过SPAAC反应实现共价PEG偶联。
对于每个主要步骤，本方案均指出了常见的实验挑战，例如颗粒聚集、孔隙坍塌或表面功能化效率低下，并提供了实用的故障排除策略，以提高实验室间的可重复性。重要的是，本文充分证明了HP-UiO-66纳米颗粒的合成具有良好的可扩展性，能够实现每批次稳定的克级生产。
最终的聚乙二醇化纳米载体在生理盐水、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和血清中表现出高度的胶体稳定性，同时保持血红蛋白（Hb）的氧结合与释放能力35。傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振（NMR）、粉末X射线衍射（PXRD）、氮气（N2）吸附、泽塔（ζ）电位分析、动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）等分析方法证实了化学结构的转变、框架完整性、孔隙率、纳米级形貌以及表面功能化的成功实现。
通过强调可重复性、可扩展性以及操作的清晰性，并结合对技术敏感步骤的视频可视化展示，该方法为制备稳定的基于金属有机框架（MOF）的载氧体提供了一条可重复、稳健且易于实现的途径。重要的是，该策略具有模块化特点，可便捷地拓展应用于其他需要在受保护且透氧的微环境中维持功能的生物大分子或酶。因此，Hb@HP-UiO-66-PEG 纳米颗粒代表了在开发高效输氧且能在生物液体中抵抗降解的血红蛋白基氧载体（HBOC）方面迈出的有前景的一步。
从实际应用的角度来看，只要其他生物大分子具备以下一个或多个特性，且尺寸小于约 20 nm（对应于最大可及的介孔尺寸），该策略便可拓展应用于血红蛋白（Hb）以外的生物大分子：（i）对苛刻的化学条件敏感，因而更适用于温和的合成与表面修饰；（ii）需要一个含水且允许氧气渗透的微环境以维持其功能活性；（iii）易受磷酸盐诱导的金属有机框架（MOF）降解影响，因而需要表面稳定化。该方法依赖适度的缺陷密度，以在介孔可及性与框架完整性之间实现平衡。当需要在无催化剂条件下进行位点特异性的表面修饰以保持生物分子功能时，基于SPAAC反应的聚乙二醇化（PEGylation）具有明显优势。因此，本实验方案非常适合在生理条件下实现高效的生物大分子负载、功能保持以及长期的胶体稳定性；而对于尺寸显著更大的生物分子，或需要极高热稳定性或酸稳定性的体系，则可能需要采用其他类型的MOF平台。

<table><tbody><tr><td>2-氨基-1,4-苯二甲酸&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，DK</td><td>381071-25G</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸</td><td>默克生命科学公司（S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>丙酮（99%）</td><td>VWR 国际（S&amp;oslash;borg，DK</td><td>23J244030</td><td></td></tr><tr><td>二辛可宁酸蛋白质测定&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技（罗斯基勒，丹麦）</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>牛血&amp;nbsp;</td><td>SSI Diagnostica A/S（Hillerød）&amp;oslash;d，DK</td><td>77667</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州）</td><td>75009903</td><td>Megafuge ST Plus 系列&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重水</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg, DK</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>二苯并环辛炔-聚乙二醇</td><td>BroadPharm</td><td>BP-23949</td><td></td></tr><tr><td>十二烷酸&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg, DK</td><td>L556-1KG</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;s 培养基&amp;minus;高葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，丹麦）</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（100%）</td><td>VWR 国际（S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>24L044013</td><td></td></tr><tr><td>傅里叶变换红外光谱法&amp;nbsp;</td><td>布鲁克（Billerica，美国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血氧分析仪&amp;nbsp;</td><td>TSC Scientific Crp（宾夕法尼亚州，美国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人枸橼酸抗凝血浆</td><td>TebuBio</td><td>SER-PLP25</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（37%）</td><td>默克生命科学公司（S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>版本 1.47t</td></tr><tr><td>Lacey碳膜铜网（300目）</td><td>Agar Scientific Ltd.，（英国埃塞克斯郡斯坦斯特德）</td><td>AGS166-3H</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>IKA-Werke GmbH &amp;amp; Co. KG（德国）</td><td>识别编号：0010011496</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova 软件</td><td>Mestrelab Research（西班牙）</td><td></td><td>版本 12</td></tr><tr><td>Micromeritics Tristar 比表面积分析仪</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>ASAP 2020 Plus</td><td></td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>Eppendorf Nordic (H&amp;oslash;rsholm, DK</td><td>货号&amp;nbsp;5452000010</td><td></td></tr><tr><td>小鼠血清</td><td>Innovative Research（美国密歇根州诺维）</td><td>IGMSCD1SER10ML</td><td></td></tr><tr><td>马弗炉&amp;nbsp;</td><td>Nabertherm GmbH (Bremen, DE)</td><td>马弗炉 LE 6/11</td><td></td></tr><tr><td>N,N&amp;prime;-二甲基甲酰胺（99.9%）</td><td>VWR International (S&amp;oslash;borg，DK</td><td>250131a008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c 仪器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>核磁共振&amp;nbsp;</td><td>布鲁克（Billerica，美国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 米&amp;nbsp;</td><td>PreSens（德国雷根斯堡）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 2022 软件</td><td>OriginLab Corporation (MA, USA)</td><td></td><td>版本 2022&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氧气传感器</td><td>PreSens（德国雷根斯堡）</td><td>OXY-1 ST 痕量</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Tecan集团有限公司&amp;nbsp; （M&amp;auml;nnedorf, CH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>六氰合铁(II)酸钾</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>60299-100G</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>默克生命科学公司（S&amp;oslash;borg，DK</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>粉末X射线衍射&amp;nbsp;</td><td>马尔文帕纳科有限公司，（英国马尔文）</td><td></td><td>型号：Malvern Panalytical Aeris Research 600W X射线衍射仪，用于粉末测量（发布于2020年）</td></tr><tr><td>圆底压力容器&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>SYNP170004-1EA</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>FEI 公司（Hillsboro，美国）</td><td>双束 FEI Helios Nanolab 600</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>连二亚硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>71699-250G</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg, DK</td><td>L4509-100G</td><td></td></tr><tr><td>Synthware&amp;trade; 圆底压力容器</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg, DK</td><td>SYNP170003</td><td></td></tr><tr><td>叔丁基亚硝酸酯&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，DK</td><td>20370-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃（99.7%）</td><td>VWR 国际（S&amp;oslash;borg，DK</td><td>201022A004</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Grant Instruments (Cambridge) Ltd (英国)</td><td>PHMT-PSC18 (01012015020119)</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜技术&amp;nbsp;</td><td>FEI 公司（Hillsboro，美国）</td><td>FEI Tecnai T20</td><td></td></tr><tr><td>三甲基硅基叠氮化物&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，DK</td><td>155071-10G</td><td></td></tr><tr><td>TSC HEMOX 数据采集系统</td><td>TSC Scientific Crp（宾夕法尼亚州，美国）</td><td></td><td>Hemox分析仪软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超声波破碎仪&amp;nbsp;</td><td>Branson Ultrasonics Corporation（美国丹伯里）</td><td>货号：2410240003</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计&amp;nbsp;</td><td>岛津（京都，日本）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空烘箱&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>马尔文帕纳科有限公司，（英国马尔文）</td><td>序列号 MAL1188530</td><td></td></tr><tr><td>四氯化锆</td><td>默克生命科学 A/S (S&amp;oslash;borg，丹麦</td><td>357405-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

用于氧气输送的分级多孔uio-66纳米颗粒的合成、血红蛋白封装及生物正交peg化

Synthesis, Hemoglobin Encapsulation and Biorthogonal PEGylation in Hierarchically Porous UiO-66 Nanoparticles for Oxygen Delivery Applications

基于血红蛋白的氧载体（HBOCs）是缓解多种生物医学背景下缺氧状况的重要氧输送平台。然而，游离血红蛋白（Hb）在红细胞外不稳定且具有血管活性。本文介绍了一种可重复、可放大的分步实验方案，用于制备封装血红蛋白并由生物正交聚乙二醇（PEG）外壳稳定的分级多孔UiO-66纳米颗粒（HP-UiO-66 NPs）。通过十二烷酸调控及后续酸洗引入分级介孔结构，获得保持结晶性的HP-UiO-66-NH₂纳米颗粒，并呈现I型/IV型联合的N2吸附-脱附等温线。表面氨基被转化为叠氮基团（HP-UiO-66-N₃ NPs），从而实现无需催化剂的应变促进炔-叠氮环加成反应（SPAAC），生成Hb@HP-UiO-66-PEG纳米颗粒。该实验流程包括：i）UiO-66-NH₂纳米颗粒的缺陷工程，ii）调控剂去除，iii）叠氮基团引入，iv）在缓冲水相介质中装载血红蛋白，以及v）通过SPAAC介导的PEG化。每个步骤均详细说明了关键实验参数、常见失败模式及相应的解决方案，以提高实验室间的可重复性。该方案适用于每批次克级规模制备HP-UiO-66-NH₂纳米颗粒。在温和条件下实现约35%的封装效率（载药量约24 wt%），PEG化后获得可再分散、流体力学直径约140 nm、低多分散性的纳米颗粒。全面的理化表征验证了框架结构的完整性、介孔特征、表面化学修饰的成功实施，以及宽度达约12 nm的弥散性PEG冠层。功能实验表明，所封装的血红蛋白可逆地进行氧合与脱氧，说明其氧运输能力得以保留。PEG化显著提高了纳米颗粒在生理盐水、HEPES缓冲液和血清中的胶体稳定性和结构稳定性，避免了未PEG化样品在磷酸盐环境中发生的降解现象。通过整合详细的故障排查指导、关键步骤的视频可视化演示以及放大生产的考量，本模块化方案为基于金属有机框架的HBOCs提供了稳健且易于实施的制备路径。该策略可便捷地拓展至其他需要保护性且可及微环境以实现治疗递送的生物大分子或酶类。

通过PXRD验证了HP-UiO-66-NH2 NPs的成功合成（图2A），其在2θ = 7.3°、8.4°和25.7°处显示出特征衍射峰，与模拟的UiO-66结构高度一致36。相对于模拟图谱的轻微峰展宽归因于颗粒的纳米级尺寸，并证实了合成后晶体结构的完整性得以保持54。通过碱性消解后的1H NMR光谱确认了DA的完全去除，表现为1.2 ppm处DA特征亚甲基质子信号的消失（图2B）。N2吸附-脱附等温线呈现出I型与IV型的组合特征，在P/P₀ = 0.8–1.0范围内观察到滞后环（图2C），表明微孔和介孔结构共存55。在最佳条件下，HP-UiO-66-NH2 NPs应表现出700–800 cm3g-1...

本方案详细描述了用于氧气递送的分级多孔UiO-66纳米粒子的合成、血红蛋白封装及表面聚乙二醇化。该方法结合缺陷工程与应变促进的生物正交偶联，以制备高通透性且生理稳定性良好的载体，适用于生物医学应用。

用于氧气输送的分级多孔UiO-66纳米颗粒的合成、血红蛋白封装及生物正交PEG化

基于血红蛋白的氧载体（HBOCs）是一种重要的氧递送平台，可用于缓解多种生物医学情境下的缺氧状态。然而，游离的……

本研究旨在定义一种稳定的金属有机框架，基于MOF的纳米颗粒用于血红蛋白封装和氧气输送。层叠多孔型态可以克服血红蛋白封装的后体尺寸限制，且表面种群能增强颗粒在生理环境中的稳定性。首先，准确称重50毫克备制的层级多孔UIO 66胺纳米颗粒，放入一个25毫升圆形底部瓶中。向烧瓶中加入10毫升四氢呋喃。然后对混合物进行超声波五分钟，使颗粒完全分散，产生均匀不透明的悬浮液。将圆底烧瓶放入冰水浴中，置于设定为400转/分钟的磁性搅拌器上。使用玻璃注射器，在五分钟内滴入0.4毫升三丁基亚硝酸盐，同时保持温度低于5摄氏度。立即在同样低温条件下滴滴加入0.35毫升三甲基SL叠氮化物。可能会出现轻微的气泡，表明氮化进展。然后用铝箔包裹冰水浴，保护反应免受光照伤害。在冰水浴中继续搅拌反应混合物一夜。第二天，按照图示洗涤和烘干产品。然后使用FTIR光谱法验证化学转化。将5毫克分层多孔的UIO 66叠氮化纳米颗粒转移到2毫升离心管中。加入0.5毫升HEPES缓冲液，进行超声波处理2到5分钟。加入0.5毫升含20毫克每毫升血红蛋白的HEPES缓冲液，轻轻倒置管子多次，使纳米颗粒完全扩散。现在将管子放在热摇杆上，在室温下以1000转/分钟摇晃两小时。培养后，在室温下以13,500克离心五分钟，沉淀装载的血红蛋白层级多孔UIO 66叠氮纳米颗粒。然后仔细收集上清液，用于定量未被困的血红蛋白。用一毫升超纯水轻轻清洗沉淀三次，通过移液法上下吸血，去除松散吸收的血红蛋白。然后仔细采集每次洗涤液的上清液，以定量被困的血红蛋白。将最终沉淀重新悬浮于0.5毫升超纯水中，并在表征前存放于冰箱。使用月桂硫酸钠血红蛋白测定法确定收集的上清液中被困血红蛋白。将每种上清液移液10微升移入96孔微板。加入100微升月桂硫酸钠试剂，在室温下黑暗中培养五分钟。使用紫外可见光分光度计，测量412纳米的吸收强度。随后，在HEPES缓冲液中准备血红蛋白连续稀释，生成标准曲线。将预备好的稀释液转移到预备好的96孔板中，生成一条标准曲线，将吸收读数转换为血红蛋白浓度。将10毫克含层级多孔的血红蛋白UIO 66叠氮化纳米颗粒转移到一个2毫升离心管，管内含0.5毫升超纯水，进行超声处理2到5分钟。加入20毫克用聚乙二醇修饰的二苯并环霉素，达到聚乙二醇与纳米颗粒的等摩尔比例。轻轻地将管子旋转，直到混合物均匀。将管子放在热摇杆上，在室温下孵育，摇晃时以1000转/分钟摇晃一小时。然后将管子转移到保持4摄氏度的冰箱中进行过夜反应。在室温下以12,000克离心五分钟，沉淀出聚乙二醇修饰、血红蛋白负载、层级多孔的UIO 66纳米颗粒。然后丢弃含有无反应聚乙二醇的上清液。用两毫升超纯水在相同条件下上下移液和离心，将沉颗粒洗涤三次。将纯化的富基化血红蛋白、层级多孔的UIO 66聚乙二醇纳米颗粒重新悬浮在两毫升超纯水中。悬挂设备存放在四摄氏度。所得胶体呈现均匀且略带乳白色，表明良好的分散稳定性。然后通过动态光散射（DLS）确认成功实现双洹化。表面氨基成功转化为叠氮化物。这一点通过层层多孔的UIO 66叠氮纳米颗粒FTIR光谱中2,122反向厘米处出现的特征性不对称叠氮化物拉伸带得以证明。该能带在层级多孔的UIO 66胺纳米颗粒中缺失。血红蛋白被包通过明显的黄色转红色可见。血红蛋白加载后氮吸收减少，表明中间孔被血红蛋白分子占据。层级多孔的UIO 66叠氮纳米颗粒的ζ电位在血红蛋白封装后从42.9毫伏降至20.4毫伏。通过在2,122反向厘米处叠氮化物拉伸振动消失以及FTIR频谱中出现聚乙二醇相关信号，确认了聚乙二醇的成功共轭。DLS分析显示，撴化后流体动力学直径从约114.9纳米增加到140.8纳米，同时保持较低的PDI。该颗粒使得合成层级多孔形态纳米颗粒、血红蛋白封装、表面封闭以及氧气释放功能评估成为可能。利用该方案，可以进行额外的物理化学表征和功能研究，包括体外氧释放和纳米颗粒生物相容性的分析。未来的研究可以聚焦于保护血红蛋白功能以维持更长时间的原因，比如加入防止实质降解的成分。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

在层层多孔的UiO-66纳米颗粒中合成、血红蛋白封装及双正交PEG化，用于氧气输送应用

我们介绍了基于磷光猝灭的氧气检测原理，并综述了用于生物系统中氧气成像的卟啉类树状纳米传感器的设计。...

生物系统中用于氧成像的磷光纳米探针的合成与标定

本实验方法描述了如何将细胞色素c（cyt.

在不含金属纳米颗粒的情况下将细胞色素 c 封装于二氧化硅气凝胶纳米结构中并保持其气相生物活性

金属有机框架材料在气体储存和多相催化方面具有高效性，但传统的合成方法通常得到松散的粉末，难以整合到智能材料中。我们展示了一种方法：首先通过原子层沉积（ALD）在织物上涂覆金属氧化物，随后在溶剂热合成过程中，可在织物表面形成保形的金属有机框架（MOF）薄膜。...

在纤维垫上原子层沉积金属氧化物涂层后通过溶热法合成MIL-96和UiO-66-NH2

本文介绍了一种设计和制备纳米结构多孔硅（PSi）薄膜的方案，该薄膜可作为可降解载体用于递送神经生长因子（NGF）。通过负载NGF的PSi载体处理后，评估了PC12细胞及小鼠背根神经节（DRG）神经元的神经元分化与突起生长情况。...

设计多孔硅薄膜作为神经生长因子的载体

我们展示了用于高效体外和体内寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成方法。多孔硅纳米颗粒负载siRNA形成核心，通过挤出法包覆融合性脂质形成外壳。本方法包括靶向配体的功能化修饰及颗粒的表征。...

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通过结合电化学和化学去合金化方法，可制备具有分级结构和双峰孔径分布的多孔纳米金。合金成分可被实时监测。 通过...

一种制备纳米多孔金分级结构的通用技术

合成后配体交换（PSE）是一种将功能基团引入金属-有机框架（MOFs）的多功能且强大的工具。将MOFs暴露于含有三唑和四唑功能化配体的溶液中，可通过PSE过程将这些杂环基团引入Zr-MOFs中。...

通过合成后配体交换法合成三唑和四唑功能化锆基金属有机框架材料

本文介绍了利用明胶的热可逆特性及其通过凝聚相分离的特性制备MOF-明胶水凝胶的方法。这些水凝胶复合材料具有高MOF载量、大孔隙率以及MOF颗粒在明胶基质中良好的空间分布。...

通过共凝聚法制备金属有机框架-明胶水凝胶

了解在UiO-66纳米颗粒中封装血红蛋白并进行双正交PEG化的方法，用于构建基于血红蛋白的氧载体。该方案实现了规模化制备与优异的稳定性。

用于氧气输送的分级多孔UiO-66纳米颗粒的合成、血红蛋白封装及生物正交PEG化

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