Name: 用于AAV转导研究的3D类球体评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学习使用三维类球体平台评估腺相关病毒载体效力与转导效率的方法。该技术支持实时定量分析多种细胞系中的基因表达动力学，为基因治疗开发提供可靠的临床前评估工具。

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作者感谢 Morten Seirup 和 Trish Hoang 提供用于 AAV 纳米荧光素酶生产的质粒以及活体底物试剂。本项目得到了美国食品药品监督管理局生物制品评价与研究中心（CBER）ORISE 研究参与项目的支持，该项目由橡树岭科学与教育研究所根据美国能源部与 FDA 之间的机构间协议进行管理。

本研究使用了来自商业来源或先前已发表研究的 established 人类细胞系（HEK293T、HeLa、Huh7、HEP3B、HEPG2 和 A375）。未使用原代人类或动物样本，因此无需伦理审批。
1. 无菌实验设置及初始超净台准备
<ol>
	<li>启动生物安全柜。</li>
	<li>在开始操作前15分钟打开II级层流微生物安全柜，以确保气流充分稳定。</li>
	<li>用70% (v/v) 乙醇喷洒生物安全柜内所有表面。</li>
	<li>在500 mL玻璃烧杯中配制5% (v/v) 次氯酸钠消毒液，用于细胞上清液和细胞碎片的处理。</li>
	<li>使用70% (v/v) 乙醇彻底消毒所有移液器和吸头盒，对设备进行清洁。</li>
</ol>
2. 细胞培养基的制备
<ol>
	<li>配制 500 mL 的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）基础培养基。</li>
	<li>在基础培养基中添加 10 mL 热灭活的胎牛血清（FBS）、1 mL 青霉素/链霉素溶液（100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）以及 5 mL 的 2 mM L-谷氨酰胺。 
	注意：所有操作过程中均应保持无菌操作技术。每次实验均需新鲜配制培养基。有关具体仪器规格，请参阅材料表。</li>
</ol>
3. 类球体准备
<ol>
	<li>按上述方法配制完全DMEM培养基。</li>
	<li>将培养基置于37 °C水浴中预热10–15分钟。</li>
	<li>从液氮罐中取出所需细胞系。</li>
	<li>将冻存的HEK293T、Huh7、HEP3B、HEPG2、A375和HeLa细胞迅速放入37 °C水浴中解冻。</li>
	<li>一旦最后的冰晶融化，立即从水浴中取出。</li>
	<li>将1 mL解冻后的细胞加入9 mL完全DMEM培养基中稀释。 
	注意：本实验方案中使用的所有细胞系均在相同的DMEM培养基和培养条件下维持。</li>
	<li>在室温下以350 × g 离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于5 mL完全DMEM培养基中。</li>
	<li>将细胞接种至T75细胞培养瓶中。</li>
	<li>将接种后的培养瓶置于细胞培养箱中，培养箱条件维持在37 °C、5% CO2和95%湿度。</li>
</ol>
4. 细胞生长监测
<ol>
	<li>每隔 3 天添加 15 mL 培养基。</li>
	<li>当 HEK293T、Huh7、HEP3B、HEPG2、A375 和 HeLa 细胞达到 70% 汇合度时进行传代，从 T75 培养瓶中吸除完全 DMEM 培养基。&#160;</li>
	<li>向含有细胞的 T75 培养瓶中加入 5 mL PBS 洗涤细胞。&#160;&#160;&#160;</li>
	<li>加液后 30 秒，吸除 T75 培养瓶中的 5 mL PBS。&#160;&#160;</li>
	<li>重复此洗涤步骤一次。</li>
	<li>用 5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞 5 分钟。&#160;&#160;</li>
	<li>将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟，以确保细胞完全脱落。&#160;&#160;</li>
	<li>加入 5 mL 完全 DMEM 培养基以中和胰蛋白酶。&#160;&#160;</li>
	<li>在 350 × g 条件下离心 5 分钟，去除胰蛋白酶。&#160;</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 5 mL DMEM 培养基中。&#160;</li>
	<li>常规传代时按 1:10 比例进行细胞分瓶。&#160; 
	注意：建议在进行实验前将细胞传代两次，以使细胞进入对数生长期并恢复代谢活性。&#160;</li>
	<li>在上述受控条件下继续培养，直至细胞达到 70% 汇合度，然后进行后续实验操作。 
	注意：应定期监测细胞形态和生长模式。确保培养瓶摆放位置适当，以利于气体交换。整个培养期间必须保持无菌条件。</li>
</ol>
5. 细胞收获与初始细胞制备
<ol>
	<li>通过吸取T75培养瓶中的现有培养基，移除培养液。</li>
	<li>用PBS洗涤HEK293T、Huh7、HEP3B、A375、&#160;HEPG2和HeLa细胞3次，以去除残留的培养基和碎片。</li>
	<li>向这些细胞中加入5 mL预热的1×胰蛋白酶溶液，使贴壁细胞从培养瓶表面脱落。 
	注意：确保胰蛋白酶已预热，以维持其最佳酶活性。将培养瓶置于37 °C培养箱中5分钟，以促进细胞完全脱落。密切监控胰蛋白酶消化时间，避免过度消化。</li>
	<li>加入5 mL完全培养基以灭活胰蛋白酶。</li>
	<li>用移液器反复吹打混合液，使溶液均匀悬浮。</li>
	<li>将全部细胞悬液转移至分别标记的离心管中，收集各细胞悬液。 
	注意：重悬细胞时应轻柔操作，以保持细胞活性。</li>
	<li>在室温下以350 × g 离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞沉淀轻柔地重悬于5 mL新鲜培养基中。</li>
</ol>
使用细胞计数器进行细胞计数和活力评估
<ol>
	<li>通过轻轻吹打悬浮液，使其充分混匀，确保离心管内细胞分布均匀。</li>
	<li>为 HEK293T、Huh7、HEP3B、HEPG2、A375 和 HeLa 细胞准备计数管。</li>
	<li>用完全 DMEM 培养基将样品稀释至 1:10。例如，将 40 µL 细胞悬液加入 360 µL 完全 DMEM 培养基中。</li>
	<li>轻轻吹打混合液 4 次，确保稀释均匀。</li>
	<li>在登录界面标记样品，并填写所用细胞类型、稀释倍数和样品名称。</li>
	<li>将样品加载到细胞计数仪上，并将含有稀释后细胞悬液的试管放入指定编号位置。 
	注意：细胞计数仪是一种自动细胞计数设备，可自动吸取细胞样品并与台盼蓝混合，从而减少操作者之间的差异。</li>
	<li>在计数前让细胞悬液静置 1 分钟。</li>
	<li>计数前需将细胞重新混匀，以获得准确结果。</li>
	<li>计算总细胞数量。</li>
	<li>根据活细胞总浓度确定实验所需的接种细胞量。</li>
	<li>使用活率 &#62; 90% 的活细胞。</li>
	<li>区分活细胞（未染色）与死细胞（蓝色染色）。 
	注意：所有样品应保持一致的计数标准。</li>
</ol>
7. 类球体接种与尺寸优化
<ol>
	<li>用移液器将细胞悬液上下吹打，以混匀溶液。</li>
	<li>接种不同密度的 HEK293T、Huh7、HEP3B、HEPG2 或 HeLa 细胞。</li>
	<li>起始接种密度为每孔 1 × 104 个细胞，溶于 200 µL 培养基中，接种于超低吸附（ULA）96 孔圆底板中。</li>
	<li>将每孔 1 × 104 个细胞进行连续 2 倍梯度稀释，直至达到实验所需的细胞密度。</li>
	<li>除最上一排外，向所有排（1B–1H）加入 1 体积的完全培养基。</li>
	<li>向第 1A 排（最上一排）加入 2 体积的 1 × 104 个细胞/孔。</li>
	<li>通过将 1A 排的 1 体积液体加入 1B 排，依次进行连续稀释。实验布局示例见下方补充图 1。 
	注意：轻轻敲击培养板侧壁，确保细胞充分重悬。</li>
	<li>将 ULA 培养板在离心机中以 350 × g 离心 5 分钟，使细胞沉降至孔底中心，促进细胞间接触。 
	注意：若使用本文未报道的其他细胞系，可能需要优化实验参数，因为不同细胞系的生长速度和类球体形成速率存在差异。</li>
	<li>在最初 24–48 小时内避免扰动培养板，以利于类球体的初始形成。让类球体继续培养 3 天，使其直径达到约 400 µm。</li>
	<li>检查类球体大小的均一性。确保细胞重悬均匀，且培养板无变形。 
	注意：不要使用类球体大小不一致的培养板。确保每个孔内的类球体直径相对均匀。</li>
	<li>观察类球体形态。 
	注意：形态良好的类球体呈圆形，边缘清晰。</li>
	<li>制备具有紧密细胞间黏附的成熟类球体，而非松散的细胞聚集体。</li>
	<li>若类球体不够致密，可提高接种密度或延长形成时间。</li>
	<li>通过降低接种密度或延长离心步骤，减少多个小聚集体的形成。</li>
</ol>
8. 活细胞实时类球体监测
<ol>
	<li>细胞悬液离心后，将培养板转移至含有活细胞成像仪器的37 °C培养箱（5% CO2，95%湿度）中，用于自动化的活细胞成像。</li>
	<li>根据实验需求设置类球体活细胞成像的参数： 
	注意：以下参数适用于所有测试的细胞系。</li>
	<li>登录采集软件。</li>
	<li>选择以下命令：|Schedule To Acquire&#160;|&#160;Launch Add Vessel&#160;|&#160;Scan On Schedule&#160;|&#160;Create Vessel: New。</li>
	<li>|Select Scan Type|：Spheroid。|Select the channels of interest|：Phase + Brightfield（用于监测类球体生长），Green/Red（用于监测AAV转导，采集时间分别为300 ms或400 ms）。</li>
	<li>选择所需的放大倍数：10x。</li>
	<li>选择培养板型号及其在抽屉中的位置。</li>
	<li>选择需要成像的孔位，以及每孔所需的图像数量。</li>
	<li>输入实验描述信息：名称、细胞类型、细胞数量。</li>
	<li>在分析设置中，选择&#160;Defer Analysis Until Later。</li>
	<li>右键单击时间轴，选择&#160;Set Selected Scan Group Interval选项。</li>
	<li>设置&#160;每隔6小时添加一次扫描，并&#160;无限期扫描。设定期望的起始时间（至少在自动成像装置中孵育1小时后）。</li>
	<li>每天登录成像软件，检查类球体的生长情况。</li>
	<li>选择&#160;View Recent Scans&#160;选项，双击目标实验。|Select&#160;Brightfield&#160;in the image channels panel| ，然后使用&#160;|Measure image|&#160;功能&#160;工具测量类球体的直径。 
	注意：可能需要优化成熟时间，以使目标细胞形成致密的类球体。</li>
	<li>在类球体形成达到最佳状态的当天取出培养板，用于AAV转导。</li>
</ol>
9. AAV 转导
<ol>
	<li>购买或制备感兴趣的AAV血清型3和转基因。</li>
	<li>通过向490 mL DMEM培养基中加入10 mL FBS，配制含2% FBS的DMEM培养基，用于AAV转导。 
	注：如代表性结果部分所示，对于衣壳或基因组调控元件的筛选，GFP转基因具有很高的有效性。将感兴趣的AAV用含2% FBS的DMEM培养基（不含抗生素）稀释。</li>
	<li>在指定的96孔圆底板中进行连续稀释。</li>
	<li>从起始MOI开始进行10倍系列稀释，以滴定AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAV9。</li>
	<li>参见下方示例实验设计图补充图2。计算AAV转导所需的MOI，方法见讨论部分。</li>
	<li>将33 µL AAV原液加入297 µL培养基中，得到总体积为330 µL、MOI为1 × 106的溶液。</li>
	<li>进行10倍系列稀释，起始MOI为1 × 106，方法是将33 µL加入297 µL含2% FBS的DMEM培养基中。 
	注：建议避免使用高MOI，以防细胞活力降低。由于不同细胞类型和AAV血清型可能显著影响最佳MOI，因此可能需要优化实验条件。并非所有病毒基因组都具有感染性；功能滴度可能与vg/mL数值不同。</li>
</ol>
10. AAV 剂量
<ol>
	<li>使用多通道移液器吸出已制备好的类球体培养板中的全部培养基。</li>
	<li>使用多通道移液器，从稀释板向处理板转移所需体积，每孔加入 100 µL 目标 MOI。</li>
	<li>将培养板重新放入成像仪器中，通过在 72 小时内连续监测绿色荧光强度来跟踪转导过程。</li>
	<li>若监测时间超过 3 天，每 3 天需向每孔加入 100 µL 完全 DMEM 培养基，以补充营养物质。</li>
</ol>
11. 活细胞成像、转导监测及数据分析
<ol>
	<li>将所需的AAV和MOI加入处理组后，将培养板放回仪器中。</li>
	<li>每6小时开始记录一次转导效率。 
	注意：通常需要3到5天才能实现最佳的GFP表达，具体时间取决于所使用的启动子和基因组构型。</li>
	<li>通过创建针对目标细胞和报告基因的分析定义来分析数据。 
	注意：或者，将培养板置于标准的37 &#176;在C孵育箱中培养，并通过qPCR、Western印迹或ELISA评估转导效率。</li>
	<li>通过明场分析定义分析参数，用于检测主球状体。</li>
	<li>优化分割参数，步骤如下：
	<ol>
		<li>分析类型： &#34;球体明场成像&#34;</li>
		<li>分割方法： &#34;自适应阈值&#34;</li>
		<li>阈值范围：0.3–0.8（建议初始使用自动调整）</li>
		<li>顶部帽滤波器：200–500 &#181;m（消除不均匀照明）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化明场参数如下：
	<ol>
		<li>载入代表性图像&#160;来自不同时间点。</li>
		<li>测试阈值范围&#160;(0.2–0.9) 以确定最佳检测条件。</li>
		<li>调整尺寸过滤器&#160;根据预期的球状体尺寸范围。</li>
		<li>验证分割结果&#160;通过目视重叠检查。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化用于评估 AAV 转导的绿色通道，步骤如下：
	<ol>
		<li>确定背景水平&#160;未处理孔（MOI=0）的</li>
		<li>设置阈值&#160;2–3&#215; 高于背景噪声</li>
		<li>使用最高感染复数（MOI）处理的样本进行检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化曝光时间&#160;避免信号饱和的同时保持信号强度 
	注意：对于AAV转导，应以每个类球体的总荧光信号作为转导效率的衡量指标。</li>
</ol>
12. 数据分析
<ol>
	<li>选择正确的参数，调整滤镜和掩膜，以便在图像中选中细胞而非背景噪声。</li>
	<li>选择一幅具有代表性的图像用于软件训练。</li>
	<li>将优化后的参数应用于研究中的所有图像。</li>
	<li>提取数据，可选择以单个值或分组形式导出，并将其传输至统计分析系统以进行进一步的数据呈现。</li>
</ol>
13. 起效时间计算
<ol>
	<li>根据每个 MOI 计算检测到首个 GFP 信号所需的时间。</li>
	<li>对未处理孔（MOI = 0）的平均值加 3 倍标准差（SD）进行插值。</li>
	<li>将每个时间点每个类球体的绿色荧光强度从活细胞成像软件复制到统计软件中。</li>
	<li>对重复样本取平均值。</li>
	<li>计算所有未处理类球体孔（MOI = 0）的平均信号和标准差（SD）。</li>
	<li>使用非对称性 S 型五参数逻辑（5PL）曲线拟合，插值计算每个 MOI 的起始时间。</li>
	<li>例如，下表 表 1 中使用了以下插值：
	<ol>
		<li>对于 scGFP：&#160;254,955（均值）+ 3 × 288,055（SD）= 1,412,120（插值信号）</li>
		<li>对于 ssGFP：&#160;2,417,941（均值）+ 3 × 26,093&#160;（SD）=&#160; 3,200,746（插值信号）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
14. 使用具有荧光检测功能的酶标仪测量荧光。
<ol>
	<li>启动连接至酶标仪的计算机上的荧光酶标仪软件。</li>
	<li>导航&#160;到&#160;文件&#160;&#62;&#160;打开&#160;实验方案，选择培养板类型（如96孔板、384孔板），并确保选择正确的孔板布局。&#160;</li>
	<li>设置荧光检测的积分时间，该参数决定读板仪从每个孔收集荧光信号的持续时间。</li>
	<li>调节&#160;任何&#160;增益&#160;或&#160;灵敏度&#160;设置 
	如果&#160;的&#160;检测&#160;需要&#160;较高&#160;或&#160;较低&#160;信号&#160;检测</li>
	<li>GFP 荧光参数设置如下：激发波长 485 nm，发射波长 528 nm。</li>
	<li>在软件中点击“运行”以开始测量。</li>
	<li>测量&#160;荧光&#160;从&#160;每个&#160;好。 
	注意：运行结束后，软件将显示原始荧光值，可通过计算平均值并减去背景值来生成图表。</li>
	<li>导出&#160;结果&#160;在&#160;的&#160;首选&#160;格式&#160;用于&#160;进一步&#160;分析&#160;或&#160;报告。 
	注意：如果修改了样本方案，请使用文件 &#62; 另存为以创建唯一版本，同时保留原始文件供将来使用。</li>
</ol>
15. 发光转基因转导
<ol>
	<li>按照上述相同的接种和AAV给药方案进行操作。</li>
	<li>向已在ULA板中培养好的100 µL HeLa细胞球中，分别加入100 µL携带纳米荧光素酶报告基因的AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAV9，MOI范围为0–106。</li>
	<li>将培养板置于常规37 °C培养箱中孵育，并在转导3天后评估转导效率。</li>
</ol>
16. 准备用于活细胞检测的胞外发光抑制剂和发光底物
<ol>
	<li>在第3天（实验终点）从培养箱中取出检测板。</li>
	<li>直接将胞外发光抑制剂和底物加入细胞中。 
	注意：无需更换培养基。</li>
	<li>从−20 °C冰箱中取出胞外抑制剂，室温下解冻。</li>
	<li>短暂离心，收集管盖和管壁上的液体。</li>
	<li>通过将1&#160;体积的胞外抑制剂与14&#160;体积的完全DMEM培养基混合，配制所需量的15倍浓缩胞外发光抑制剂。
	<ol>
		<li>例如，若实验需要1.0 mL试剂，则将67 µL抑制剂加入933 µL&#160;DMEM中。每块板需配制1&#160;mL DMEM，并加入67 µL抑制剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤16.5中配制好的抑制剂转移至无菌试剂储液槽中。</li>
	<li>使用多通道移液器向转导了AAV的孔中加入10 µL抑制剂。</li>
	<li>从−20 °C冰箱中取出活细胞底物并混匀。</li>
	<li>短暂离心，收集管盖和管壁上的液体。</li>
	<li>配制所需量的3.6倍浓缩活细胞试剂。</li>
	<li>为每块板配制4 mL DMEM，并加入144 µL底物。</li>
	<li>将步骤16.11中配制好的底物转移至无菌试剂储液槽中。</li>
	<li>使用多通道移液器向转导了AAV的相同孔中加入50 µL底物。 
	注意：若同时运行多个检测板，可能需要调整试剂体积。</li>
	<li>在室温下以300 rpm振荡5分钟。</li>
	<li>在加入发光检测试剂后2小时内，使用in vivo成像系统仪器读取检测板。 
	注意：发光强度将在2小时内逐渐衰减。</li>
</ol>
17. 生物发光成像
<ol>
	<li>成像前至少 30 分钟启动生物发光成像系统，使 CCD 相机冷却至 −90 °C。</li>
	<li>确保培养板已准备好用于成像（例如，已添加活细胞成像底物以进行生物发光检测）。</li>
	<li>移除培养板盖，以避免光线反射和散射。</li>
	<li>若从底部成像，需清洁培养板底部。</li>
	<li>将培养板放置于成像室的载物台上。</li>
	<li>将培养板置于相机正下方中心位置。</li>
	<li>设置发光成像参数：&#160;使用自动曝光或设定曝光时间（通常为 1–60 s）、二乘二合并（推荐使用中等模式）、光圈值（f/stop 为 1 以获得最高灵敏度）。</li>
	<li>拍摄一张照片作为解剖学参考。</li>
	<li>采集发光图像。</li>
</ol>
18. 生物发光成像数据分析
<ol>
	<li>使用 ROI 工具圈选孔位或感兴趣区域。</li>
	<li>确保各样本之间的 ROI 大小一致，以便进行比较。</li>
	<li>测量生物发光的总通量（光子/秒）。</li>
	<li>测量辐射效率。</li>
	<li>将数据导出至电子表格以进行统计分析。</li>
	<li>保存图像文件和分析结果。</li>
	<li>将图像导出为 TIFF 或 JPEG 格式用于展示。</li>
</ol>

<ol>
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作者无任何利益冲突需要披露。

我们在此介绍一种简化的 体外&#160;用于腺相关病毒（AAV）开发与效价检测的3D平台。该平台利用三维细胞培养技术，更接近人体组织结构，从而实现增强的转导效率、高灵敏度以及更优的转化预测性。该系统可在多种细胞系中有效区分不同AAV血清型及调控元件（包括单链和自互补载体）之间的转导功效。值得注意的是，与传统二维检测中通常将转导效率定义为携带目的基因的阳性细胞百分比不同，三维球状体系统难以实现单细胞分辨率的定量分析。因此，本研究中转导效率定义为整体报告基因信号强度（荧光或发光信号），该指标综合反映了转导细胞比例及单个细胞内目的基因表达水平的共同贡献。球状体系统的高灵敏度显著降低了对高浓度产品的依赖，使其在AAV的研发中具备成本效益高、应用灵活且生理相关性强的优势。
该方法解决了传统二维细胞培养检测中的关键难题，传统方法依赖于细胞在人工表面的黏附，且缺乏细胞组织结构，可能导致在临床环境中对载体性能的预测不准确&#160;。三维球状体系统能更好地模拟组织结构和药物分布模式，所提供的载体行为数据更接近真实的生物条件22,23。本实验方案采用简单的超低吸附培养板，可在标准实验室条件下轻松实现重复实验。
该可调节系统可用于腺相关病毒（AAV）中和实验，研究AAV的穿透能力，并开发更复杂的共培养实验，以探究不同细胞微环境对AAV转导效率的影响。此外，高通量药物和载体筛选平台可轻松整合至类球体平台，从而在载体发现工作流程中实现自动化并降低成本，助力开发更具靶向性的产品。
类球体的一个主要实际优势是其能够在无需传代细胞的情况下持续生长数周，从而实现对腺相关病毒（AAV）活性的长期研究。这种稳定的培养系统维持了重要的细胞间相互作用和基质成分，避免了二维培养中因反复收获细胞所造成的中断24。保留的细胞环境支持天然的蛋白质排列和膜结构，这对于评估AAV与细胞的结合及进入过程至关重要25。
尽管3D类球体在AAV转导评估方面展现出巨大潜力，但与之相比也存在一些转化应用上的不足 体内&#160;模型，主要归因于其结构相较于天然组织更为简单。类球体缺乏若干关键的生理组分，包括用于载体递送的血管系统、评估免疫原性的免疫细胞，以及诸如血脑屏障等组织特异性屏障，这些因素均可能显著影响腺相关病毒（AAV）的功能表现。26这些局限性表明，尽管球状体在传统二维培养与更复杂的模型之间提供了中等复杂度， 体内 动物模型仍不足以完全重现全面评估腺相关病毒（AAV）所需的生理微环境。
本文所介绍的球状体实验方案一次仅涉及一种细胞类型。该方案可进一步拓展，以包含另外2–3种细胞类型，从而聚集成基本的三维结构。更复杂的三维模型，例如类器官或微流控系统，属于多细胞体系，能够重现特定器官的细胞多样性和组织结构，包含10种或更多不同类型的细胞，并以类似组织的模式排列。此类高级三维类器官可包含多种细胞27、水凝胶包埋培养、悬滴技术以及微流控平台11,27,28。尽管这些方法可提供更为复杂的组织架构，有助于进一步理解腺相关病毒（AAV）生物学特性，但通常需要更专业的试剂、设备以及较高的技术操作水平。相比之下，在超低吸附培养板中形成的三维球状体则显著简化，因其成本低且可重复性好，适用于多数实验室。
成功实施本方案的关键步骤包括维持高细胞活力，因为受损的细胞可能影响类球体的形成和转导效率。使用超低吸附培养板以及优化离心条件对于获得致密的类球体也至关重要。针对每种细胞类型和腺相关病毒（AAV）血清型优化感染复数（MOI）是避免信号过弱或饱和的关键。选择合适的检测方法同样重要，尤其是在进行动力学分析时，需要与连续活细胞成像系统兼容。对于3D类球体中AAV转导结果的准确解读，还需考虑若干技术因素。
转导信号弱或缺失可能由病毒滴度低、MOI 非最适或孵育时间不足引起；可通过验证病毒滴度、优化 MOI 以及延长孵育时间（通常为 3–5 天）来解决。荧光或发光信号弱可能反映外源基因表达水平低或试剂在三维结构中渗透有限，可通过优化曝光设置或延长底物扩散时间加以改善。在某些细胞系（如 HeLa 细胞）中，主要挑战是自发荧光，可能导致背景信号升高并降低基于荧光检测方法的灵敏度。为克服这一局限性，我们采用了基于纳米荧光素酶的发光报告系统，该系统可提供更优的信噪比，从而在具有自发荧光背景的条件下更准确地检测转导效果。此外，背景信号也可能源于阈值设置不当或培养基相关荧光，应通过未处理孔（MOI = 0）进行对照，以确定基线信号水平。最后，在高 MOI 条件下可能出现信号饱和，原因包括病毒输入量过高或检测器性能限制；可通过缩小 MOI 范围并优化检测器曝光设置，使测量值保持在线性动态范围内，从而缓解该问题。
总体而言，这种三维球体方法为评估AAV转导效率、效价及动力学提供了一个简化的、可重复的系统。通过弥合传统二维检测与 体内 研究，它有助于更明智地进行载体开发，并推动具有临床相关性的基因治疗策略的进步。

AAV 载体已成为首选的基因递送系统之一 体内 由于其安全性高且能够实现持久的基因表达，因而具有广泛的应用前景1腺相关病毒基因治疗在多种罕见病的治疗中已显示出成效，目前有数百种相关产品正处于研发管线中2此外，新兴应用包括 体内 递送基因编辑组分（如Cas9），在治疗难治性疾病方面具有巨大潜力3主要的开发挑战包括高昂的制造成本以及现有模型预测能力有限 体外 用于评估产品质量和临床疗效的检测方法4.
AAV 治疗药物的发展从根本上受到缺乏可预测、标准化活性检测方法的限制，这些检测方法本应能够准确预测临床表现4,5。这些检测是研发流程中的关键环节，具有多种用途，包括筛选经过工程化改造的载体文库、优化衣壳修饰以增强靶向性，以及评估组织特异性嗜性。此外，它们还用于表征调控序列对转基因表达的影响6。除了候选分子的筛选外，AAV 转导检测还通过效价检测支持关键的生产质量控制，用于批次放行、批次间可比性研究以及稳定性评估6,7。
科学难题在于开发既能捕捉媒介-宿主相互作用复杂性，又具备常规应用可行性的检测方法7,8目前的方法包括在传统的二维单层培养体系中使用永生化细胞系来模拟靶器官。这些培养条件缺乏生理相关性，且需要高剂量的药物，从而导致实验室预测结果与临床可转化性之间存在显著差距。新型工程化细胞系，例如过表达AAVR或基于CRISPR激活的系统，虽代表了重要进展，但无法重现天然组织所特有的三维结构以及细胞外基质相互作用9,10,11下一代模型能够更准确地模拟 体内 微环境可能弥合这一转化鸿沟12,13,14.
我们近期开发了一种优化用于腺相关病毒（AAV）转导的3D球状体系统，以提高AAV转导检测的可转化性。与传统的2D检测这一金标准相比，该系统在多种细胞系和AAV血清型中均显著提高了AAV转导效率。除了提升检测的灵敏度并减少检测中产品的消耗外，这些模型还通过提供随球状体内细胞位置变化的真实细胞间相互作用，优于传统的2D单层培养。此外，该系统能够有效模拟实际器官环境，用于药物渗透性的有意义研究11,15,16。进一步地，与更复杂的类器官或共培养系统相比，该球状体方法具有实际操作优势，因其使用常规实验室设备，且无需特殊培养基或支架材料。这种简便性保证了实验的可重复性和可扩展性，非常适合常规基因治疗检测和载体开发的工作流程17。
该3D球状体平台特别适用于需要在低剂量下灵敏检测腺相关病毒（AAV）转导效率以及对载体基因组设计进行比较评估的应用场景。它还支持对血清型依赖性趋向性的评价。对于在传统2D培养中转导效率相对较低、需要高剂量AAV的细胞系而言，该平台尤其具有优势。在这些情况下，3D平台所具备的更高灵敏度和更优的生理相关性至关重要。然而，该系统可能不太适用于需要免疫组分、血管递送或完整组织复杂性的研究，因为球状体无法完全模拟in vivo&#160;环境。
因此，我们提出了一种优化用于腺相关病毒（AAV）转导检测的简单三维球状体实验方案，包含两个关键且互补的读出指标：转导效率（此处定义为每个球状体的总报告信号）和转导动力学。该方法为AAV效力评估、载体设计以及中和实验提供了一个经济高效、生理相关性强且信息丰富的平台。

<table><tbody><tr><td>37°C 培养箱</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>标准培养条件</td></tr><tr><td>A375 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>AAV1 质粒</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>AAV 质粒</td></tr><tr><td>AAV2 质粒</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>AAV 质粒</td></tr><tr><td>AAV5 质粒</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>AAV 质粒</td></tr><tr><td>AAV8 质粒</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>AAV 质粒</td></tr><tr><td>AAV9 质粒</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>AAV 质粒</td></tr><tr><td>BioTek GEN5 酶标仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>用于荧光或发光信号的终点检测</td></tr><tr><td>离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>维持类球体悬浮状态</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; 细胞培养用磷酸盐缓冲液（1×）</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>用于清洗细胞的 PBS</td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基，含 GlutaMAX 添加剂和丙酮酸钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>完全生长培养基</td></tr><tr><td>细胞外 NanoLuc 抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>淬灭来自细胞外环境的任何 Nanoluc&amp;reg; 信号&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>提供生长因子</td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>HEP3B 细胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>HEPG2 细胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>Huh7 细胞</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>IncuCyte S3 倒置显微镜</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>监测类球体的形成与生长</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 成像系统</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>用于发光信号的终点检测</td></tr><tr><td>Nano-Glo&amp;reg; 活细胞检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>用于活细胞检测的发光底物试剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>防止细菌污染</td></tr><tr><td>带通气盖的 T75 组织培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>用于细胞培养的培养瓶</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>酶法解离细胞</td></tr><tr><td>超低吸附培养板</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>防止细胞贴壁，促进类球体形成</td></tr></tbody></table>

用于aav转导研究的3d类球体评估

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

腺相关病毒（AAVs）是基因治疗产品中用于基因递送的高效载体。其开发需要 体外&#160;能够可靠检测载体设计、血清型性能、调控元件强度以及表达动力学差异的系统。这些系统还必须支持效价评估和载体优化等应用。本文描述了一种经过优化的三维球状体平台，可用于评估腺相关病毒（AAV）的效价、目的基因表达动力学以及不同血清型在多种细胞系中的转导效率。通过超低吸附培养板生成均一的球状体，并在支持其结构稳定性和长期成像的条件下维持培养。AAV转导后，利用活细胞成像系统实时监测荧光或生物发光信号。该方法可通过连续的动力学成像，对报告基因信号强度、剂量响应性、调控元件活性及表达起始时间进行定量分析。该平台可有效区分高效与低效的载体基因组设计，并能分辨多种AAV血清型之间的差异。该方法在快速和慢速分裂的细胞系中均表现出良好的稳健性。上述结果表明，该平台是一种可扩展且具有生理相关性的系统，适用于基因治疗的临床前评估与开发。

本文展示了三维球状体可作为评估腺相关病毒（AAV）转导效率的工具，用于区分不同的载体基因组设计（如自互补型（sc）和单链型（ss）），并可用于评估转导动力学。该流程的概览见图1。简而言之，首先在二维培养体系中扩增细胞，随后接种至超低吸附（ULA）培养板中以形成致密的球状体（图1A）。接着，通过离心促进细胞聚集（图1B），并将培养板转移至活细胞成像系统，以实时监测球状体的形成过程（图1C）。在第3天，使用不同感染复数（MOI）的AAV对球状体进行转导（图1D）。利用活细胞成像技术纵向追踪转导动力学（图1E），并在实验终点通过基于培养板的荧光或发光信号读数进行终点分析（图1F）。
图2&#160;展示了来自6种不同细胞系的类球体形态，显示出密度、圆度和形状的差异。所有细胞系在用于任何实验前，均在完全DMEM培养基中培养数代。当细胞进入对数生长期后，收集HEP3B、HEK293T、A375、HeLa、HEPG2和Huh7细胞，并在ULA圆底板中进行连续梯度稀释，起始细胞密度为每孔10,000个细胞，随后以2倍梯度稀释（板布局见补充 图1&#160;，代表性结果见补充图2）。类球体的尺寸可小至50 µm，同时仍能维持类球体结构及良好的转导敏感性。接种细胞后，将ULA圆底板在350 × g. 条件下离心5分钟，促使细胞聚集于孔底中心并自组装形成类球体。此步骤对不易自然聚集的细胞尤为有利。对于高度抗性细胞（如淋巴细胞），离心时间可延长至5–15分钟。形态良好的类球体呈现圆形且致密的表型，如HEK293T和Huh7细胞所示；而形态较差的类球体则聚集松散，在换液过程中易发生解体。
接下来，将培养板转移至配备活细胞监测仪器的37 °C培养箱中。每天以6小时为间隔监测培养板，以评估本文所报道的各细胞系的类球体形成情况。大多数细胞系需要3天时间自我组装形成类球体。如图2所示，各细胞系在接种3天后表现出不同的形态特征和不同程度的紧实化。肝源性细胞系（Huh7、HEPG2和HEP3B）形成的类球体比其他细胞系更为致密紧凑。HEK293T形成非常圆整的球形结构，并具有明显的坏死核心，而A375则形成不规则形状的细胞聚集体（先前描述为变形的类球体）18,19。这些形态学上的差异被认为可反映疾病的病理生理状态，进一步支持了三维模型相较于二维培养系统的应用价值18,19。该类球体组装方案在所测试的六个细胞系中均具有高度可重复性，并已应用于本文所示的所有转导实验。
在优化了细胞浓度、类球体形成时间以及绿色/红色自发荧光状态后（见补充图3），我们使用活细胞成像系统和酶标仪对类球体中的腺相关病毒（AAV）转导进行了测试（AAV滴定实验的酶标板布局示例见补充图4）。图3&#160;展示了在四种不同细胞系（HEK293T、Huh7、HEP3B和HEPG2）中应用的优化后类球体培养方案。在类球体形成的第3天，使用携带两种不同载体基因组设计并标记GFP的AAV2载体，以不同的感染复数（MOI）对类球体进行转导。这两种AAV转基因设计分别代表高效（scGFP）和低效（ssGFP）GFP变体。细胞转导后，将培养板置于活细胞成像系统中，以实时监测AAV转导过程。在72小时时间点，使用活细胞成像软件检测绿色荧光强度。图3中，蓝色线条代表sc-GFP基因组，红色线条代表ss-GFP基因组。类球体对AAV转导高度敏感，在scGFP条件下，极低的AAV滴度及多种不同细胞系中均检测到强烈的转导信号。在不同细胞系和MOI条件下实时捕获的AAV转导代表性视频见补充视频1、补充视频2、补充视频3、补充视频4、补充视频5和补充视频6。另一方面，ssGFP AAV的类球体转导水平较低，这与该类调控元件预期的较弱/较慢转导特性一致20,21。该结果表明，三维类球体模型可用于高效和低效AAV转导的研究，并能有效区分强转导基因（如sc-GFP）与弱效基因（如ss-GFP）。在HEK293T细胞中，当MOI为106时，sc与ss转基因之间的相对荧光强度差异达100倍；而在较难转导的细胞系（如HEP3B）中，该差异为3倍。
接下来，我们以剂量依赖的方式测试了不同血清型AAV在HEK293T类球体和Huh7类球体中的转导效果。如图4所示，三维类球体可被四种不同血清型的AAV-scGFP有效转导。转导72小时后，使用荧光酶标仪（图4A、B）和活细胞成像软件（图4C、D）检测scGFP表达。这两种仪器均成功检测到所有4种血清型的信号。活细胞成像系统在信噪比范围上高于荧光酶标仪，但归一化信号水平未显示显著差异。我们发现，在两种细胞系中，AAV2的转导效率最强，其次是AAV1，而AAV5和AAV9的转导效率显著较低。
接下来，我们采用类球体方案评估了发光信号转导。为此，按照本文所述的优化方案将HeLa细胞培养成3D类球体。在第3天，将HeLa类球体用5种不同的编码纳米荧光素酶报告基因的AAV血清型进行转导。AAV转导72小时后，细胞加入活细胞底物，并在室温下孵育5分钟。随后，使用生物发光成像系统检测并成像发光信号（图5A）。该系统观察到所有AAV血清型均实现了高效转导。不同AAV血清型间转导效率的差异具有良好的可分辨性，表明该方案不仅限于荧光检测。与图5中观察到的趋势一致，在HeLa细胞中AAV-纳米荧光素酶的转导结果显示AAV2为最有效的血清型，这与AAV-GFP载体的结果一致。同样，AAV9血清型的转导效率最低，这一点在荧光和发光载体中均得到证实（图4&#160;和&#160;5）。AAV-纳米荧光素酶转导的代表性图像见图5B。
除了转导强度外，三维球状体实验方案还能够实现对转导动力学的实时监测。图6&#160;展示了在不同感染复数（MOI，0–106）条件下，AAV2-scGFP 和 AAV2-ssGFP 对三维 HEK293T 球状体转导动力学的代表性结果（图6A–G）。我们发现，使用活细胞成像系统检测时，AAV2-scGFP 在 MOI 低至 101 时即可检测到转导信号，相较于未处理细胞，约 34 小时后即可观察到 GFP 信号的增强。而 AAV2-ssGFP 的信号则明显更弱且出现更慢。为了进一步比较转导速度，我们计算了 GFP 信号首次可被检测到的时间点（起始时间）。结果显示，scGFP 平均转导速度约为 ssGFP 的 4 倍。各个条件下的具体起始时间列于表1中。这些动力学测量结果揭示了转导效率的另一个重要方面，有助于实验方案的优化。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70517/70517fig1B.jpg" /> 
图1: 使用三维培养进行腺相关病毒转导的概述 (A细胞在二维培养体系中扩增后，接种至超低吸附（ULA）培养板中以形成球状体。B) 将培养板离心以促进聚集，并转移至（C) 用于类球体形成实时监测的 IncuCyte S3 系统。D第3天，类球体以不同的MOI值转导AAV。E通过活细胞成像技术纵向追踪转导动力学，以及（F终点分析可使用基于微孔板的荧光或发光检测进行。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/70517fig1Alarge.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>&#160;
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70517/70517fig2A.jpg" /> 
图2：多种细胞系类球体的形态学表征。由 HEP3B、HEK293T、A375、HeLa、HEPG2 和 Huh7 细胞生成的类球体代表性图像显示了在大小、形态和致密性方面的差异，同时在重复实验中表现出高度可重复性（比例尺，50 µm）。所有细胞系均以每孔 1 × 104 个细胞接种，培养 3 天。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/70517fig2Alarge.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70517/70517fig3B.jpg" /> 
图3：不同细胞系中自互补（scGFP）与单链（ssGFP）腺相关病毒载体转导效率的比较。 （A）HEK293T、（B）Huh7、（C）HEP3B 和（D）HEPG2 的 3D 类球体通过自组装形成，并用不同感染复数（MOI）的 AAV2-scGFP（蓝色）和 AAV2-ssGFP（红色）进行转导。在转导后 72 小时定量测定总的绿色荧光强度。使用活细胞成像系统在最高 MOI 处理条件下于 72 小时时间点拍摄具有代表性的类球体图像。比例尺为 200 µm。误差线表示标准差（SD）。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/70517fig3Alarge.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>&#160;
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70517/70517fig4B.jpg" /> 
图 4：在三维球状体中进行 AAV 转导可区分不同 AAV 血清型的活性。 来自（A,C）HEK293T 和（B,D）Huh7 的三维球状体使用 AAV1、AAV2、AAV5 和 AAV9，携带&#160;scGFP 报告基因，在不同 MOI 条件下进行转导。在 72 小时时，采用基于荧光的酶标仪（A,B）和活细胞成像系统（C,D）测定荧光强度单位。误差线表示标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/70517fig4Alarge.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70517/70517fig5B.jpg" /> 
图5: 3D球状体中带有发光报告基因的AAV转导 HeLa 细胞球体被转导了编码纳米荧光素酶报告基因的 AAV1、AAV2、AAV5、AAV8 和 AAV9，感染复数（MOI）逐渐增加。使用终点读数法检测并测量发光信号。&#160;转导后72小时的生物发光成像系统。(A总通量值。B代表性终点读数&#160;类球体板的发光成像展示了不同感染复数（MOI）和血清型间的信号分布。每种AAV载体均设置两组水平重复。误差棒代表标准差（SD）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/70517fig5Alarge.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70517/70517fig6B.jpg" /> 
图6：3D类球体中的转导动力学评估。HEK293T类球体在7个不同MOI条件下分别用AAV2-scGFP（蓝色）和AAV2-ssGFP（红色）进行转导（A–G）。使用Monitor类球体形成/生长系统，在72小时时间内以每6小时为间隔测量总的绿色荧光强度。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/70517fig6Alarge.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>感染复数（MOI）</td>
			<td>scGFP（小时）</td>
			<td>ssGFP（小时）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>&#62;72小时</td>
			<td>&#62;72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>34.2</td>
			<td>&#62;72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>16.5</td>
			<td>54.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000</td>
			<td>5.6</td>
			<td>23.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10000</td>
			<td>3.3</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100000</td>
			<td>1.9</td>
			<td>8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：GFP检测的起始时间。
补充图1： 类球体滴定的孔板布局。 （A）代表性孔板布局，显示由初始接种密度从10,000至78个细胞梯度稀释生成的HEK293T、Huh7、HEP3B和HEPG2类球体的稀释方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Figure 1_2707.png" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2： 不同接种密度下的类球体形成。 第3天时由初始接种密度从10,000至78个细胞形成的HEK293T和Huh7类球体的代表性显微镜图像。比例尺为50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Figure 2_2707.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 3： 用于 3D 球体形成的细胞系信息。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Figure 3_2707.png" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：AAV系列稀释的孔板布局。（A）代表性孔板布局，显示用于AAV1、AAV2、AAV5和AAV9的AAV系列稀释方案，起始MOI为106。H行显示阴性对照，代表未处理的类球体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Figure 4_2707.png" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 1： 在 MOI 为 106 的条件下，AAV2-scGFP 转导 HEK293T 细胞球的实时活细胞成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Movie 1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 2： 在 MOI 为 106 的条件下，AAV2-scGFP 在 Huh7 类球体中的实时活细胞成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Movie 2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 3： 在 MOI 为 106 的条件下，AAV2-scGFP 转导 HEP3B 类球体的实时活细胞成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Movie 3.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 4： 作为剂量依赖性研究的一部分，在 MOI 为 106 的条件下对 HEK293T 细胞球体中 AAV2-scGFP 转导过程进行的实时活细胞成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Movie 4.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 5： 在 MOI 为 104 的条件下，AAV2-scGFP 转导 HEK293T 细胞球的实时活细胞成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Movie 5.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 6： 在 MOI 为 101 时，AAV2-scGFP 转导 HEK293T 细胞球的实时活细胞成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/SI Movie 6.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1：AAV 转导所需 MOI 的计算方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70517/Supplementary File 1.zip " target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

三维球状体培养系统相较于传统的二维模型，可显著提升腺相关病毒（AAV）基因治疗开发的效果。该方法能够在低剂量条件下灵敏检测AAV的转导效率，提高生理相关性，并实现稳健的长期监测。该平台适用于在多种细胞系和AAV血清型中进行效力评估、高通量筛选以及载体优化。

用于AAV转导研究的3D类球体评估

腺相关病毒（AAVs）是基因治疗产品中用于基因递送的高效载体。其开发需要体外系统，以……

我们开发了一种灵敏且具有生理相关性的三维球状体平台，用于评估腺相关病毒（AAV）的转导活性，并提高基因治疗中载体性能的预测能力。本方案适用于载体效力检测、血清型筛选、转基因优化、中和研究以及体外临床前基因治疗中的AAV活性评估。首先，在标准条件下，将细胞接种于 T75 细胞培养瓶中培养，直至细胞汇合度达到 70%。经胰酶消化后，进行 1:10 的稀释，用于常规传代培养。再次培养细胞至 70% 汇合度后收获细胞。在评估细胞活力后，充分吹打细胞悬液，确保混匀。在超低吸附 96 孔板中，用完全培养基对细胞进行两倍系列稀释，起始浓度为每孔 1 × 10⁴ 个细胞，体积为 200 µL。根据所示实验布局，向除最上一排外的所有排中加入 1 份体积的完全培养基；然后在最上一排（第 1 排）加入 2 份体积的 1 × 10⁴ 个细胞/孔。通过将第 1A 排的 1 份体积转移至第 1B 排进行逐排系列稀释，并依此类推。将超低吸附板在 350 × g 下离心 5 分钟，使细胞沉降至孔底中央，促进细胞间接触。于 37 °C 静置培养 24 至 48 小时，以形成球状体。继续培养约 3 天，使球状体直径达到约 400 µm。检查球状体大小的均一性，确保细胞充分重悬且培养板放置水平。监测球状体形态，选择具有紧密细胞间黏附、而非松散细胞聚集体的成熟球状体。待细胞悬液离心后，将培养板转移至配备活细胞成像仪器的37摄氏度培养箱中。登录采集软件，选择“定时采集”和“按计划扫描”，然后选择“新建容器”。选择扫描类型为“类球体”，并选择感兴趣的荧光通道：明场相位对比，以及绿色或红色荧光通道。将所需放大倍数设置为10倍，选择培养板型号及其在抽屉中的位置，选定需要成像的孔位，并输入实验名称。在分析设置中，暂时选择“差异分析”。设置每六小时添加一次扫描，并持续无限扫描。通过登录成像软件，每天检查类球体的生长情况，选择“查看最近扫描”，然后双击目标实验。在图像通道面板中选择明场后，使用“测量图像”功能测量类球体的直径。在类球体形态达到最佳状态的当天取出培养板，并用于腺相关病毒（AAV）转导。准备一个96孔圆底板，每孔加入297微升含2% FBS但不含抗生素的DMEM培养基。向培养基中加入33微升AAV原液，使初始感染复数（MOI）达到1 × 10⁶。随后通过将每个稀释液33微升转移至297微升培养基中，进行10倍梯度稀释。使用多通道移液器吸除先前制备的类球体板中的全部培养基。使用多通道移液器将稀释板中目标MOI的AAV溶液100微升转移至处理板中。将板放回成像仪器中。通过连续72小时监测绿色荧光强度，开始追踪转导情况。每隔三天，每孔添加100微升完全DMEM培养基以补充营养。将板重新放回成像仪器中，并每六小时开始记录一次转导效率。通过建立针对目标细胞和报告基因的分析定义来分析数据。利用荧光信号进行终点分析。类似地，在携带发光报告基因的3D类球体中进行AAV转导，随后通过生物发光成像进行转导分析。每种细胞系在接种三天后均表现出独特的形态特征和不同程度的紧实度。肝细胞系形成的类球体比其他细胞系更紧密、更致密。HEK293T细胞形成非常规则的球形结构，并具有明显的坏死核心。A375细胞则形成不规则形状的细胞聚集体。类球体对AAV转导高度敏感，在不同细胞系中，即使使用极低滴度的AAV，也能检测到自互补型GFP的强烈转导信号。单链GFP的类球体转导水平低于自互补型GFP。在HEK293T细胞中，当感染复数（MOI）为10⁶时，自互补型与单链转基因之间的相对荧光强度相差100倍。在HEP3B细胞中，自互补型与单链转基因之间的相对荧光强度相差3倍。四种AAV血清型均能通过荧光酶标仪和活细胞成像系统成功检测。AAV2显示出最高的转导效率，其次为AAV1，在两种细胞系中均如此。所有AAV血清型在发光检测系统中均表现出有效的转导，能够精确区分转导效率。在HeLa类球体中，AAV2为最有效的血清型，而AAV9的转导效率最低。在感染复数低至10¹时，即可检测到AAV2介导的自互补型GFP转导信号，与未处理细胞相比，约34小时后信号明显增强。AAV2介导的单链GFP信号弱于且慢于自互补型GFP信号。执行该方案时的关键挑战在于维持较高的细胞活力，生成均一且致密的球状体，并针对每种细胞类型和血清型优化腺相关病毒（AAV）的剂量。本方案可通过RT-qPCR、Western印迹、ELISA、体细胞活性检测以及起效时间动力学分析，评估外源基因的表达水平与功能活性。未来的研究可引入共培养系统、类器官、微流控装置、免疫细胞或血管结构，以更真实地模拟体内微环境。

evaluation-of-3d-spheroids-for-aav-transduction-studies

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

本文中，我们发现腺相关病毒3型（AAV3）是靶向人肝癌细胞效率最高的载体。...

高效转导肝癌细胞的重组腺相关病毒3型载体

我们展示了通过DNA家族洗牌技术对合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体进行分子设计与定向进化的基本方法。此外，我们还提供了在培养细胞或小鼠中筛选和分析具有增强特性的单个嵌合衣壳的一般性指导原则及代表性实例。...

通过DNA家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体

为了研究视网膜疾病动物模型中血-视网膜屏障的通透性以及内界膜的完整性，我们使用了多种腺相关病毒（AAV）变体作为标记视网膜神经元和胶质细胞的工具。随后利用病毒介导的报告基因表达作为视网膜屏障通透性的指标。...

利用腺相关病毒作为工具研究疾病中的视网膜屏障

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内...

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

该方法可用于利用带有荧光标记的肌节蛋白的多能干细胞衍生心肌细胞，检测肌节缩短。...

利用荧光标记的肌节蛋白检测多能干细胞来源心肌细胞的肌节缩短

本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。...

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。...

利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

本文详细介绍了一种优化的小鼠侧尾静脉注射方案，用于在成年小鼠中系统性给予腺相关病毒（AAV）。此外，我们还描述了常用的检测方法，以评估AAV的转导效率。...

通过侧尾静脉注射在成年小鼠中稳定递送腺相关病毒

本报告详细介绍了腺相关病毒载体的局部注射方法 通过...

高效且安全的小鼠肾脏基因递送 通过 腺相关病毒载体的缓慢逆行性肾盂注射

学习使用三维类球体平台评估腺相关病毒载体效力与转导效率的方法。该技术支持实时定量分析多种细胞系中的基因表达动力学，为基因治疗开发提供可靠的临床前评估工具。

用于AAV转导研究的3D类球体评估

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