从冻存的血沉棕黄层样本重编程诱导多能干细胞系

本实验方案的目的是将人类冻存的血沉棕黄层或外周血单个核细胞重编程为诱导性多能干细胞。该方案的独特之处在于解冻后对血沉棕黄层进行纯化，并识别出一种可指示重编程成功与否的体细胞形态。首先，取出来源于人血的冻存血沉棕黄层，并置于冰上。

将样品在37摄氏度的水浴中轻轻摇晃，当仅剩少量冰晶时取出小瓶。将小瓶中的内容物逐滴小心转移至含有12毫升DPBS的锥形管中。用1毫升DPBS冲洗小瓶，并将冲洗液加入含有回收细胞的锥形管中。

使用水平转子在室温下以 200 g 离心样品 10 分钟。小心移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 4 毫升含 1% FBS 的 DPBS 中。接着，将血沉棕黄层混合物轻柔地铺加在 3 毫升密度梯度溶液之上，避免在界面处发生混合。

使用水平转子，在室温下以800 ×g离心20分钟，关闭刹车。用移液器小心吸除上层血浆层并弃去，注意不要扰动血浆与分离液的界面。然后吸取位于界面处的外周血单个核细胞（PBMC）层，并转移至一个新的15毫升离心管中。

通过加入三毫升扩增培养基，以200 ×g在室温下离心10分钟，洗涤外周血单个核细胞（PBMCs）。小心吸去上清液，并将细胞沉淀重悬于两毫升含有细胞因子（如SCF、IL-3、EPO和IGF-1）的扩增培养基中。将细胞接种至12孔板中的1个孔内。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳和20%氧气条件下培养10至14天。每隔一天更换一半培养基，直至观察到大量明亮、圆形的成红细胞，表明细胞已准备好进行转导。用携带山中因子的仙台病毒转导三天后，将细胞以每孔两毫升的体积接种至小鼠胚胎成纤维细胞上。

将培养物孵育约七天，每隔一天用hESC培养基喂养新出现的克隆。将含有转导细胞及已出现克隆的培养板置于解剖显微镜下。利用显微镜定位一个待挑选的克隆，并掀开培养板盖子以暴露孔位。

无菌条件下打开注射器，露出针头。在显微镜引导下，用针尖沿克隆集落的边缘划线，将其从周围的饲养层细胞中分离。用针尖将克隆集落切割成若干大小相近的小块。

如果组织块尚未脱落，可用针的侧面将其从培养板上舀起或刮下，直至其悬浮于液体中。接着使用P200移液器，在显微镜下找到已挑选的菌落，用移液器吸取悬浮的菌落，并将其转移至预先准备好的24孔板中的一个孔内。确保完整转移整个菌落，避免同时吸走其他菌落或饲养细胞。

将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳和20%氧气的培养箱中培养，直至达到所需汇合度。选择体积较大、呈圆形且边缘发亮的克隆作为准备传代的细胞。吸除孔中的培养基，并用1毫升DPBS冲洗样品一次。

然后移除DPBS，并加入500 µL的0.5 mmol/L EDTA解离缓冲液。将样品置于37°C、5% CO₂条件下孵育2分钟，直至细胞集落松解且细胞变圆。接着，从培养箱中取出培养板，吸除EDTA解离缓冲液。

使用 P1000 移液器，加入一毫升人多能干细胞培养基，轻轻吹打细胞，直至细胞集落脱离并略微分散。将含细胞的一毫升培养基转移至新的六孔板中，该孔板内已预先加入一毫升新鲜的人多能干细胞培养基。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 20% 氧气的培养箱中培养。

每天更换培养基以培养诱导多能干细胞，直至细胞长满培养孔，准备进行传代。同时，用 7 毫升以 DPBS 配制的、浓度为每毫升 5 微克的玻连蛋白溶液包被一个 10 厘米培养皿，在室温下孵育 1 小时。继续传代时，向该 10 厘米培养皿中加入 7 至 10 毫升人多能干细胞培养基，将六孔板中的细胞以 1:1 的比例转移至培养皿中，并按照之前所示条件进行孵育。

在再次传代细胞前，确认10厘米培养皿中的细胞已达到汇合状态。根据细胞形态和密度调整传代比例，通常使用1:10的比例，并记录每次传代的代数。最后，通过免疫荧光法检测干细胞多能性标志物NANOG的表达，对诱导性多能干细胞进行表征。

使用特定的培养条件将细胞分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系。通过检测PAX6、Brachyury和SOX17的染色情况以及NANOG表达的消失来评估分化潜能。在扩增结束时，外周血单个核细胞（PBMCs）分化为成红细胞，表现为大小不一的明亮圆形细胞。

而缺乏这些细胞或出现死亡的培养物则很难成功重编程。成功的转导和重编程表现为在经照射的饲养细胞上出现诱导性多能干细胞集落，并逐渐形成典型的干细胞形态。而未能获得类似干细胞形态的细胞则未被成功重编程。

成功重编程的诱导性多能干细胞呈现出致密、圆形的克隆集落，边缘光滑且明亮。通过调整传代条件，可清除形态欠佳的亚克隆，例如出现自发分化或中心过于致密的克隆。部分挑选的克隆未能成功扩增。

除了形态学特征外，诱导性多能干细胞还表现出干性，表现为干性标志物 NANOG 的表达。重编程获得的诱导性多能干细胞具有向外胚层、中胚层和内胚层分化的潜能。本方案提供了详细的检测节点，用于追踪和预测重编程的成功情况。

为了进一步确认iPSC细胞系是否适合使用，应进行核型分析、基因分型以及常规支原体检测。本方案可利用已有的患者群体及其生物样本库中保存的血沉棕黄层进行重编程，从而拓展iPSC技术的应用范围。