利用溶液核磁共振在双相条件下表征生物分子凝聚体

我们开发了NMR方法来研究生物分子凝聚态。这些是细胞组织的关键，但它们的每一个信息在多种疾病中都存在。利用我们的方法，我们研究凝析液材料的性质，分析其形成机制，并监测如凝析液成熟或生物分子病理性纤维颤动等长期变化。

首先，将蛋白原料、RNA原料或两者混合于温热琼脂糖缓冲液，置于1.5毫升微型离心管中，制备最终双相样品，并用琼脂糖水凝胶稳定。最终的蛋白质或RNA浓度通常为50至500微摩尔用于NMR检测。将准备好的双相样品插入光谱仪，然后像平常一样锁定、垫片、匹配和调谐质子通道。

使用通用校准程序校准质子通道上的90度脉冲长度。然后记录一个一维抑制水的光谱，检查该光谱是否包含强生物分子信号。如果没有或信号极少，则不要使用REDIFINE，而是使用CONDENSE-MT。

记录一个扩散有序光谱实验，将扩散梯度强度从2%到95%排列，分16个线性步骤。为了继续获取完整的REDIFINE数据集数据，可以复制刚运行的初始实验的参数，创建九个新的PPP GPQ S19实验。在每个连续实验中，只需将D20扩散延迟以可变步进，范围从100毫秒延伸到1000毫秒。

用相应的命令运行每个实验。用最后一个N来保持接收机在10个实验中的增益。把Q Sign和SSB2设置为窗口函数。

然后用相应命令提取第五片。对一维光谱进行相位处理，并将相位参数保存到二维数据集中。用XF2处理二维数据集，用ABS2进行基线校正。

之后，用分割二维提取16片。对剩余九个实验重复类似程序。至少检查前四到五个切片，以确保相位正确和基线修正。

如有需要，手动校正相位和基线。然后使用合适的MATLAB代码进行分析。在代码中，修改扩散时间，根据探针梯度强度设置PG值，并根据实验总数分配实验1到10。

然后利用该代码根据REDIFINE模型拟合数据。记录一维水抑制频谱。如果观测到的信号非常微弱，则进行CONDENSE-MT实验。

通过T1反演回收确定定量CONDENSE-MT的水R1速率。将提供的脉冲序列和VD列表复制到相应文件夹。校准质子90度脉冲后，NS设为2，DS设为0，D1为20秒，SW设为10ppm。

TD2到16K，TD1到24公里。对于CONDENSE-MT实验，将提供的Bruker参数集、序列和频率列表复制到Bruker专用文件夹中。然后根据光谱仪调整频率和功率。

将P1设置为校准后的90度脉冲长度，P4设置为一微秒作为激发脉冲，以避免辐射阻尼。将 NS 设为 2，DS 设为 16，D1 设为四秒，SW2 设为 20 ppm，TD2 设为 8k，TD1 设为频率列表长度。将SPNAM10设置为Squa100,000，P10设置为五秒。

找到产生100赫兹辐射的SP10功率。相应地调整照射脉冲的SP10功率。用相应命令运行伪二维实验，并设置一系列伪二维实验，变化SP10照射功率。

调整完所有参数后，运行代码读取NMR光谱，将水信号积分并保存到一个新变量中。在代码反演恢复中，调整路径到相应数据并检查水整合区域。然后调整包含反演恢复数据的实验编号。

设置所有实验参数，输入琼脂糖空池值，以类似方式拟合琼脂糖数据集获得。运行压缩空代码的第一部分，以获得水纵向松弛拟合。然后运行压缩空拟合部分，启动显示拟合函数最小化的活图。

运行代码的下一部分以确定不确定性并绘制数据图。REDIFINE拟合确定了稀释相和浓缩相的扩散系数、凝聚相蛋白质的数量、平均液滴大小以及FUS N端结构域样品的间期通透率。FUS N端结构域的NMR信号在凝聚相中仍可检测。

通过相位样品，琼脂糖参考与FUS N端域之间未观察到磁化转移曲线的差异。对于CAG重复RNA凝聚物，则未观察到NMR信号。因此，磁化转移曲线与琼脂糖参考有显著不同。

CONDENSE-MT实验对重复扩展RNA凝聚态进行了动态表征。CONDENSE-MT分析得出了凝析水与散装水之间的质子交换动力学。CONDENSE-MT分析还得出了凝聚液中RNA的横向松弛时间以及体积水的表观横向松弛速率。

在该协议中，我们可以在双相状态下表征凝聚态的性质，无需化学标签。这些液滴与稀释环境共存，使两相之间的交换能够模拟细胞环境。我们专注于凝聚液表征的方法，可以辅以传统核磁共振方法，研究分子结构相互作用和各相动力学。

未来研究中，我们计划开发更复杂的凝聚液模型，将方法学应用于更复杂的系统，最终直接研究凝析液在细胞内环境中的表现。