使用24孔板的中通量柱法DNA提取

我们的研究聚焦于用于平行旋转柱法进行DNA和RNA提取的3D打印轨道，旨在连接手动与自动化方法。该技术通过实现最多116个DNA或RNA样本的同步处理，解决了传统手动旋转柱方法劳动强度大的局限性。首先，使用配备0.4毫米喷嘴的熔融沉积成型3D打印机打印支架。

使用通用的聚乳酸（PLA）、聚对苯二甲酸乙二醇酯改性塑料（PETG）或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）耗材，填充率为100%。将层高设置为0.1毫米，并启用表面平滑功能。调整打印参数，以确保打印件的防水性和机械稳定性。

首次使用前测试支架的防水性。使用前，向打印的储液槽中加入70%乙醇进行测试。通过逐步延长离心时间，确认无泄漏或结构损坏。

使用胶水成功测试后，将基础储液池组件连接在一起，形成一个密封单元。将大肠杆菌（Escherichia coli）或E.Coli转化子接种到含有适当抗生素的三至五毫升LB培养基（Lysogeny Broth）中。在37摄氏度下振荡培养12至16小时。

在 2000 G 条件下离心 10 分钟以收集细胞。弃去上清液。向沉淀中加入 250 微升重悬缓冲液。

通过涡旋振荡或移液将沉淀完全重悬。加入250 µL裂解缓冲液，通过倒置离心管4至6次或轻轻摇动24孔板来轻柔混匀。

加入350微升中和缓冲液并混匀。观察白色沉淀的形成，以确认中和反应成功。将裂解缓冲液加入含有二氧化钛粉末的离心管中。

按照体积与质量的2:1比例加入。向裂解液中加入250 µL二氧化钛悬浮液，并通过振荡试管混匀。

加入 350 微升中和缓冲液并充分混匀。在 2000 ×g 下离心 10 分钟。观察到细胞沉淀完全析出，且在二氧化钛存在下上清液完全透明。

在没有二氧化钛的情况下，注意上清液中存在残留的沉淀物。收集上清液时避免扰动沉淀，并将其转移至结合柱中。将DNA结合柱放入支架的柱固定层中。

将离心柱盖置于指定的插槽中，以在离心过程中固定。将澄清或过滤柱放入直接位于结合柱上方的过滤柱层中。将制备好的中和裂解液转移至过滤柱中。

将组装好的支架放入摆动桶式板转子中。在室温下以 2000 ×g 离心一分钟。从离心机中取出支架后，移除并丢弃滤柱层。

将储液槽中的流穿液弃入废液容器中。重新组装带有结合柱的支架。向每个结合柱中加入 500 至 700 微升洗涤缓冲液。

在2000 G下离心一分钟。弃去储液槽中的流穿液，并重复之前的洗涤步骤。从支架上取下结合柱，转移至2毫升收集管中。

在10,000 G或更高条件下离心一分钟以干燥膜。将柱子转移至洁净的1.5毫升离心管中。直接向膜上加入50微升洗脱缓冲液或水，并在室温下孵育一分钟。

在10,000 G或更高条件下离心一分钟以洗脱DNA。总质粒得率在传统方法与使用支架配置进行提取的方法之间无显著差异。质粒构型保持完整，松弛型、线性化和超螺旋形式的分布相似。

染料分布局限于加载柱正下方的废液区域，在相邻孔或邻近柱尖处未检测到可见信号，表明该支架设计降低了飞溅和柱间交叉转移的可能性。仅在添加了扩增产物的柱子洗脱液中检测到扩增信号。该颗粒可使研究人员获得高质量的质粒DNA，用于后续应用，包括克隆、测序和PCR分析。

执行本方案时最重要的考虑因素是防止交叉污染，需使用密封性良好、无重叠区域的3D打印储液槽。此外，按照本流程操作后，这些支架可用于任何基于柱法的核酸提取分析。