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本研究得到了巴斯克政府卫生部资助项目（2023111027 和 IT524-22）的支持。C.R.-V. 获得了巴斯克大学（UPV/EHU）提供的奖学金支持。谨此感谢 SGIker（UPV/EHU）在动物护理方面的技术支持以及分析与高分辨率显微镜服务。

人胎盘来自知情同意的捐赠者，符合《赫尔辛基宣言》要求，并获得克鲁塞斯大学医院伦理委员会（批准编号 CEIC E15/03）的批准。所有动物实验均经巴斯克大学（UPV/EHU）动物研究伦理委员会（批准编号 CEEA M20/2023/038）批准，并遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用的规定。所有操作均在UPV/EHU动物实验中心（SGIker）进行，全程保持无菌技术（处理生物材料时使用II级生物安全柜）。
1. 水凝胶合成
<ol>
	<li>明胶-核黄素前体溶液（5% 和 10% w/v） 
	&#8203;注意：在光线较暗的环境下操作，或使用琥珀色瓶或包裹铝箔的容器，以避免溶液暴露于光线下。当水凝胶用于生物学用途时，所有步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。
	<ol>
		<li>称取所需量的明胶和核黄素磷酸盐（RFP）：配制10 mL 5%（w/v）明胶加0.01%（w/v）RFP前体溶液时，称取500 mg明胶和1 mg RFP；配制30 mL 10%（w/v）明胶加0.02%（w/v）RFP储备液时，称取3 g明胶和6 mg RFP。</li>
		<li>将明胶和RFP加入相应体积的去离子水中（&#8776;最终体积的90%）。轻轻搅拌，直至粉末完全分散。</li>
		<li>使用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.0，边监测 pH 值边逐滴加入碱液。记录所用 NaOH 的体积及最终调节后的体积。pH 调节完成后，用去离子水将溶液补足至最终体积。</li>
		<li>在80 ℃下溶解并均匀混合溶液 &#176;在200 rpm磁力搅拌下，37°C反应30分钟。 
		注意：操作热溶液时（&#62;70–80 &#176;C）使用耐热手套。</li>
		<li>让溶液冷却至 30–40&#160;&#176;C，并通过0.22 &#181;m 聚醚砜（PES）亲水性膜滤器装入无菌棕色瓶中。 
		注意：温和加热粘稠溶液（&#8776; 40–50 &#176;C）若需要，过滤前进行；避免过热。</li>
		<li>用成分、日期和操作者姓名首字母标记瓶子。将过滤后的水凝胶溶液在4℃下避光储存。 &#176;C保存至使用，确保储存时间不超过制备后2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加了补充成分的明胶水凝胶（终体积：10 mL）
	<ol>
		<li>按照第4和第5节所述步骤制备自体血清（AS）或人羊膜提取物（HAMe）。提取物在使用前应保持无菌和冷藏状态。</li>
		<li>每制备10 mL含生物活性成分的水凝胶，需将5 mL的10% (w/v)明胶 + 0.02% (w/v) RFP储备液与5 mL相应的生物提取物（AS或HAMe）混合。 
		注意：温和加热粘稠溶液（&#8776; 40–50 &#176;C）若需要，过滤前完成；避免过热。</li>
		<li>将温热的溶液经0.22 μm滤膜过滤 &#181;m PES 亲水性膜滤器过滤至无菌棕色瓶中。</li>
		<li>将水凝胶标记并在4℃下储存 &#176;C下保存至使用。确保储存时间不超过制备后2周。 
		&#8203;注意：所有废弃物应根据机构的生物安全规定进行处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 水凝胶应用 体外 
<ol>
	<li>按照第1部分所述制备水凝胶配方，并将其保持在32 &#176;应用前需保持低温以维持足够的黏度。</li>
	<li>使用无菌技术，将所需体积的水凝胶移液至目标孔、模具、培养皿或基质中（图1A).</li>
	<li>将 Led-C 固化灯置于水凝胶表面上方 2 cm 处。启动 原位 通过将水凝胶暴露于蓝光下进行交联（&#955; = 420–480 nm）和光输出为 850–1000 mW/cm²2 总时长为2 min。将光照分为6次20 s的脉冲照射，每次脉冲之间插入5–10 s的间歇，以防止局部过热（图1B).</li>
	<li>通过肉眼观察并用无菌器械轻轻触碰表面，确认凝胶完全形成，以确保生成坚实且可操作的水凝胶（图1C，D).</li>
	<li>立即使用交联后的水凝胶，或于4℃保存 &#176;在无菌条件下进行，条件需符合后续应用的要求。 
	&#8203;注意：整个操作过程中需保持无菌技术。避免皮肤或眼睛直接暴露于蓝光照射下。</li>
</ol>
3. 人羊膜（HAM）的获取
注意：仅使用血清学阴性且已签署知情同意书并符合机构和伦理要求的供体的胎盘。
<ol>
	<li>供体资格与知情同意
	<ol>
		<li>确认每位供体均已接受筛查，并且人类免疫缺陷病毒1型和2型（HIV-1和HIV-2）、乙型肝炎、丙型肝炎及梅毒检测结果为阴性。</li>
		<li>在手术前获得每位供体签署的书面知情同意书。</li>
		<li>在健康供体择期剖宫产术后立即获取人胎盘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集与初步处理
	<ol>
		<li>分娩后立即将胎盘置于无菌不锈钢容器中收集。</li>
		<li>在手术室内，用无菌生理盐水充分冲洗胎盘以去除血凝块。辨认羊膜——即衬于羊膜腔内侧的最内层透明膜——使用无菌镊子从胎盘边缘开始轻轻剥离，将羊膜与绒毛膜分离。 
		注：操作过程中应小心处理膜组织，避免撕裂。</li>
		<li>完全分离后，在羊膜基质面贴附无菌硝酸纤维素滤膜片，以方便操作并标准化分割。将人羊膜（HAM）分为三个明确区域（图2A、B）：远端羊膜：宽10 cm的区域；中段羊膜：宽10 cm的区域；近端羊膜：延伸至胎盘边缘的部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运输
	<ol>
		<li>将每一片人羊膜组织放入无菌瓶中，浸没于添加了1.25 µg/mL两性霉素B、50 µg/mL青霉素-链霉素和50 µg/mL新霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。</li>
		<li>在每个瓶子上清晰标注供体编号、日期以及来源区域（远端、中段或近端）。</li>
		<li>立即将样本在洁净、无菌且冷藏条件下（4 °C）运送至实验室。 
		注：运输时应采用符合联合国UN 3373标准（生物物质，B类）的密封三级包装，遵守机构关于人体组织的生物安全规定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验室处理 
	&#8203;注：所有后续步骤均须在II级生物安全柜内无菌条件下进行。
	<ol>
		<li>使用无菌剪刀将每一片远端、中段和近端的人羊膜组织剪成4.0–4.5 × 4.0–4.5 cm的正方形片段。</li>
		<li>将片段浸入前述含抗生素的DMEM中，并用无菌夹子轻轻刷洗以去除血渍残留。随后在含50 µg/mL青霉素-链霉素的DMEM中洗涤2次，每次5分钟。</li>
		<li>再用不含任何抗生素的DMEM洗涤2次，每次5分钟。</li>
		<li>将筛选出的片段在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤。</li>
		<li>将每一片段转移至不含任何培养基的5 mL无菌离心管中。直接于–80 °C冷冻保存，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 人羊膜提取物（HAMe）的制备
注意：所有步骤均需在无菌和低温条件下进行，以最大限度减少蛋白质降解和污染。
<ol>
	<li>取出存放在 −80 °C 的含有人体羊膜（HAM）碎片的试管。将试管浸入液氮中 5 分钟，使组织硬化。</li>
	<li>将每个冷冻的碎片转移至预冷的研钵（−80 °C）中，用研杵彻底研磨，直至获得柔软且均匀的粉末。</li>
	<li>立即在天平上称量粉末样品，以尽量减少解冻。将称量后的粉末转移至 5 mL 离心管中，并加入 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），每毫克组织补充 5 µL 蛋白酶抑制剂混合物进行重悬。 
	注：处理过程中始终保持所有试管置于冰上，以保护蛋白质完整性。</li>
	<li>使用超声破碎仪和直径为 1.5 mm 的探头，以 90% 的振幅对每个样品超声处理 20 分钟，采用工作 15 秒、间歇 15 秒的循环模式，防止过热。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 3,000 × g 离心 10 分钟。小心收集上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>在无菌条件下，通过 0.22 µm 聚醚砜（PES）亲水膜滤器过滤上清液。将过滤后的 HAMe 分装至 0.2 mL 微量离心管中。分装后于 −80 °C 保存，直至后续使用。 
	&#8203;注：确保保存时间自制备之日起不超过 6 个月。</li>
</ol>
5. 从兔子体内提取血液来源的自体血清
注意：所有操作均需在无菌且避光条件下进行 体内 新西兰白兔中的实验&#8776;在获得相应机构动物研究伦理委员会批准并遵守机构指南的情况下进行。
<ol>
	<li>在采血部位使用利多卡因进行局部麻醉（表面或皮下）。每次操作时，在采血部位皮下注射 0.1 mL 浓度为 50 mg/mL 的利多卡因溶液。&#160;</li>
	<li>从兔耳中央动脉采集血液至含有聚合物凝胶分离剂的 4.5 mL 血液采集管中（图 3A、B）。室温静置 2 小时使血液凝固，期间不进行振荡（图 3C）。</li>
	<li>在室温下以 1,000 × g 离心 15 分钟。收集上清液（血清），即为兔自体血清（AS）（图 3D）。</li>
	<li>使用 0.22 µm 聚醚砜（PES）亲水膜滤器过滤血清。分装至无菌的 0.2 mL 管中，于 −80 °C 保存直至使用。 
	&#8203;注意：确保保存时间自制备之日起不超过 6 个月。</li>
</ol>
6. 体内 手术步骤
注意：所有实验操作均须遵循相应机构的动物研究伦理委员会规定，并符合《赫尔辛基宣言》原则以及眼科与视觉研究中动物使用 ARVO 声明的要求。
<ol>
	<li>术前准备 
	&#8203;注意：使用新西兰白兔（&#8776;2 kg）作为动物模型。
	<ol>
		<li>手术前，通过肌肉注射给予氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（6 mg/kg）以实施全身麻醉。在继续操作前，确认角膜反射和足部反射消失。 
		注意：若操作不当，对兔后肢进行肌肉注射可能有损伤坐骨神经的风险。建议考虑注射至表轴肌（腰部/椎旁）肌肉，作为降低该风险的较优替代方案。</li>
		<li>将动物置于侧卧位 仰卧位 置于无菌手术台上，用聚维酮碘溶液消毒眼周区域。在手术眼放置眼睑撑开器，以在操作过程中持续暴露眼表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前基质层角膜切除术
	<ol>
		<li>将直径为6.5 mm的真空环钻居中置于兔角膜上（图4A）。通过抽吸固定装置，旋转角膜环钻四分之三圈，达到约187 μm的基质层深度 &#181;m</li>
		<li>在环钻区域内使用新月形刀片进行前基质层角膜切除术，去除上皮层和前基质层，直至获得光滑的创面床（图4B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体内 水凝胶应用
	<ol>
		<li>用50 μL将角膜缺损处填充 &#181;相应水凝胶配方的 L，预热至 32 &#176;以确保最佳黏度（图4C).</li>
		<li>开始 原位 通过蓝光照射角膜表面进行交联&#955;= 420–480&#160;nm）照射2分钟。以6次20秒脉冲照射，脉冲间间隔5–10秒，以限制局部升温（图4D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>侧方部分睑缘缝合术
	<ol>
		<li>确定上下眼睑边缘的鼻侧三分之一，以暴露内侧区域便于观察和治疗。</li>
		<li>根据眼睑长度和所需的稳定性，使用不可吸收的涂层编织丝线缝合1-2针。&#160;(图4E).
		<ol>
			<li>用镊子夹住外侧上眼睑边缘。将针从皮肤侧穿过灰线/睑缘至结膜侧，穿透全层组织，但应尽量避免过深刺入睑板。</li>
			<li>从结膜侧穿过下眼睑缘的对应点至皮肤侧进针，使睑缘相互对合。</li>
			<li>以牢固的外科结打结，并加两个方结，将结扎于皮肤表面，位置略偏向眼睑边缘外侧，而非正对眼睑边缘上方。</li>
			<li>如果需要额外的稳定性，可在第一根缝线内侧约3–4 mm处放置第二根缝线，使用相同的全层U形缝线或单纯间断缝合。</li>
			<li>将缝线末端修剪至3–4 mm以减少刺激，同时保留足够长度以便后续拆除。</li>
			<li>确认眼睑对合能够保护治疗后的角膜，同时允许对结膜和角膜的鼻侧及颞侧区域进行检查和滴眼液治疗。确保睑缘缝合不过紧，且动物眼睑无缺血表现。图4F).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后监测与护理
	<ol>
		<li>在角膜切除术前通过皮下注射给予0.05 mg/kg的丁丙诺啡，并在术后每12小时给药一次，持续72小时，以提供镇痛。</li>
		<li>滴加3 mg/mL妥布霉素滴眼液，每日两次（每眼1滴）&#160;术后7天内直至伤口完全闭合，以预防感染。</li>
		<li>所有眼睛（包括对照组）每日四次，每次一滴0.2%透明质酸（HA）人工泪液，以维持角膜水合状态。</li>
		<li>每日至少检查睑缘缝合两次，观察缝线是否松动、有无感染、局部组织坏死或张力过大。持续观察动物的一般行为、进食情况及有无眼部不适表现。</li>
		<li>术后72小时，剪断缝线结，并用镊子轻轻抽出每根缝线，注意避免将污染物拖过结膜表面。</li>
		<li>检查眼睑边缘的愈合情况以及角膜表面的上皮完整性。根据需要继续进行眼部治疗，直至观察到上皮完全闭合。</li>
		<li>从第3天到第7天监测并记录眼部愈合情况及临床体征，通过裂隙灯显微镜和荧光素染色评估上皮闭合、角膜混浊和新生血管形成。 
		&#8203;注意：若出现任何缺血、伤口裂开或严重刺激的迹象，应立即拆除缝线并进行相应处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Draize 急性眼刺激性评估
	<ol>
		<li>用毛巾或毯子轻轻固定兔子。先在白光下检查虹膜和结膜。</li>
		<li>根据Draize评分标准对结膜充血、水肿（chemosis）和分泌物进行评分（参见 表1 和 表 2).</li>
		<li>在数据表中记录全部六项Draize参数。将各组成部分的评分相加，计算眼刺激指数（OII）；OII范围为0至110，数值越高表示刺激性越强。</li>
		<li>根据OII将每只眼睛按照Kay-Calandra分类法进行分类；将分类结果记录在数据集中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>伤口愈合的摄影记录
	<ol>
		<li>滴加荧光素溶液(5 &#181;L）注入下结膜囊内。</li>
		<li>用蓝光照射眼睛，评估角膜混浊程度（密度和范围）及荧光素染色范围。</li>
		<li>将相机设置为手动白平衡，关闭光学变焦，并置于距离眼睛约3 cm处，以确保各次实验中所有图像均采用相同参数拍摄。在荧光素染色后，分别在蓝光照明下和非蓝光照明下拍摄图像，以明确显示上皮缺损范围。在第0天（缝合睑缘前）以及从第3天（拆除睑缘缝合后）开始每日拍摄，直至上皮完全闭合。</li>
		<li>使用 ImageJ 软件分析图像，并量化荧光素染色区域的面积。 
		&#8203;注意：由于部分睑缘缝合，通常无法在第1天和第2天进行 photographic documentation。需注明数据集中缺少第1天和第2天的图像，并记录任何不良事件（例如偶然发生的角膜擦伤）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安乐死与组织采集
	<ol>
		<li>在第21天（双眼评估期结束后），通过肌肉注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg），对动物进行深度麻醉。</li>
		<li>通过耳缘静脉注射10 mL饱和氯化钾（KCl）溶液实施安乐死。</li>
		<li>通过观察尸僵的出现以及生命反射的消失来确认动物死亡，然后进行组织取材。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案提供了一种可重复的工作流程，用于制备、装载及应用光交联明胶–核黄素水凝胶以促进角膜伤口愈合。若干 体外 步骤对于获得稳定的凝胶质量至关重要，需要特别强调，因为这些步骤是最常见的变异来源。首先，在搅拌过程中将前体溶液维持在80 °C，可确保明胶和磷酸核黄素完全溶解，防止产生影响光学透明性和交联均匀性的颗粒聚集体。在无菌过滤前，必须将配方重新加热至40 °C以确保完全液化，因为在较低温度下过滤会导致过滤不完全并增加污染风险。制备完成后，水凝胶应保存在4 °C避光环境中，并在使用前加热至32 °C，此时其保持半固态但仍可移液，防止操作过程中发生泄漏 体外 和 体内 应用中，这些温度参数的任何失效通常表现为凝胶浑浊、滤器堵塞、光固化不均匀或在应用部位扩散。纠正措施包括将80 °C的混合步骤延长至45&#160;若颗粒物持续存在则延长搅拌时间；在冷却前确认pH为7.0；预先润湿聚醚砜（PES）滤膜；当过滤速度仍较慢时，先使溶液通过0.45 µm预滤膜，再进行最终除菌过滤。在 原位 交联，标准化灯距（≈2&#160;厘米）并以六个20秒脉冲的形式提供光照，脉冲间间隔5–1...

角膜是一种透明的无血管结构，约占眼球屈光力的三分之二，其结构和功能的完整性对视力至关重要1。由于直接暴露于外部环境，角膜极易受到外伤、感染、化学损伤以及术后并发症的影响2,3。若未能及时有效地恢复上皮完整性，可能导致持续性上皮缺损（PEDs）和慢性角膜溃疡，最终引发基质溶解、穿孔、瘢痕形成以及不可逆的视力丧失4,5。常规治疗手段——包括润滑剂、抗生素预防和自体血清滴眼液——往往只能提供部分疗效，且在中重度缺损中无法充分促进基质修复6,7,8。
为克服这些局限性，基于生物材料的疗法因其能够保护伤口、支持上皮修复并恢复基质组织而成为颇具前景的替代方案9,10,11,12,13,14。水凝胶尤其具有吸引力，因其具备良好的生物相容性、光学透明性、可调节的力学性能，以及负载治疗剂的能力。天然和合成水凝胶（包括明胶15,16,17、胶原蛋白18,19、壳聚糖20,21、聚乙二醇（PEG）22,23 和透明质酸18,24）在促进角膜伤口愈合方面已展现出潜力。其中，基于明胶的水凝胶尤为有价值，因其来源于胶原蛋白，并含有固有的细胞黏附基序。
光交联水凝胶具有额外的优势，可通过在眼表直接按需固化，实现精确放置并提高机械稳定性，且无需缝合。核黄素介导的交联技术最初用于圆锥角膜的治疗，近年来因其优异的生物相容性、眼科学安全性以及在可见光或紫外光照射下产生活性氧以诱导交联的能力，已被应用于水凝胶的光聚合25,26。蓝光（≈445 nm）在角膜应用中尤为有利，可在避免紫外线相关风险的同时实现高效的交联27,28,29。
本文介绍了由5% (w/v) 明胶和0.01% (w/v) 核黄素磷酸盐（RFP）组成的光交联水凝胶的制备、富集及外科应用。文中提供了详细的实验方案，用于 体外 水凝胶制备，包括可选添加人羊膜提取物（HAMe）或自体血清（AS），以及 体内 在兔角膜基质层切除模型中的应用。羊膜提取物（HAMe）已知对眼表具有抗炎、抗纤维化和促再生作用30,31,32,33,34,35而自体血清可提供类似泪液浓度的维生素A、EGF、纤维连接蛋白及其他对上皮再生至关重要的生长因子36,37,38这些组分共同促进再上皮化，减轻炎症反应，并可能防止基质降解39,40.
尽管所述方法可实现可控的光聚合和可定制的生物活性，但其目前的应用仅限于浅层和基质中层的角膜缺损，且需要直视下的蓝光照射，这可能限制其在不透明或深层浸润组织中的应用。通过整合水凝胶制备与富集、眼科操作以及包括部分外侧睑缘缝合在内的术后护理，本文提供了一种可重复的方法，不仅支持角膜修复，还有助于将光激活水凝胶技术转化为临床实践，并推动角膜再生研究标准化平台的建立。

<table><tbody><tr><td>两性霉素B</td><td>Gibco（Thermo Fisher Scientific）</td><td>15290018</td><td>终浓度：&amp;nbsp;1.25&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>自体血清，兔（AS）</td><td>自制</td><td>-</td><td>由全血制备；经滤过&amp;nbsp;0.22 &amp;mu;m&amp;nbsp;PES</td></tr><tr><td>蓝光LED固化灯</td><td>伍德佩克医疗仪器公司</td><td>LED.C 模型</td><td>波长：&amp;nbsp;&amp;lambda;=420&amp;ndash;480&amp;nbsp;纳米（nm）；距离：&amp;nbsp;1&amp;ndash;2&amp;nbsp;厘米；光输出：850-1000 毫瓦/平方厘米&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>布托啡诺（Buprecare）</td><td>Ecuphar</td><td>578950</td><td>剂量：&amp;nbsp;0.05&amp;nbsp;mg/kg，皮下注射，每隔&amp;nbsp;12&amp;nbsp;h&amp;nbsp;用于&amp;nbsp;72&amp;nbsp;h</td></tr><tr><td>相机</td><td>松下</td><td>LUMIX TZ35</td><td>配备徕卡光学镜头的相机</td></tr><tr><td>Cimarec 数字搅拌加热板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SP131320-33</td><td>220-240 V，最高温度：540 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>新月形显微手术刀</td><td>BVI 医疗</td><td>373807</td><td>-</td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco）&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基)</td><td>Gibco（Thermo Fisher Scientific）</td><td>11966025</td><td>-</td></tr><tr><td>Eppendorf管（0.2 mL）</td><td>默克股份公司</td><td>30124707</td><td>为制备 HAMe 保持低温；分装</td></tr><tr><td>Eppendorf 管（5 mL）</td><td>默克股份公司</td><td>30119606</td><td>为HAMe制备保持低温；分装</td></tr><tr><td>荧光素溶液&amp;nbsp;</td><td>诺华</td><td>Colorcusi Fluotest</td><td>2% 荧光素溶液，5 &amp;micro;滴眼液</td></tr><tr><td>Gibco 新霉素</td><td>默克股份公司</td><td>N1142</td><td>终浓度：&amp;nbsp;50&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>明胶粉</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890</td><td>溶解于&amp;nbsp;80 &amp;deg;C；pH 调至 7.0</td></tr><tr><td>透明质酸人工泪液（0.2%）</td><td>Chem.-pharm. Fabrik GmbH</td><td>Hylo-Tear</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ 图像处理软件</td><td>美国国家心理健康研究所</td><td>-</td><td>由美国国立卫生研究院研究服务部的 Wayne Rasband 开发</td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketolar）</td><td>辉瑞</td><td>631028.1</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因</td><td>Vet One</td><td>NDC 13985-222-04</td><td>局部或皮下注射</td></tr><tr><td>青霉素&amp;ndash;链霉素</td><td>Gibco（赛默飞世尔科技）</td><td>15140-122</td><td>终浓度：&amp;nbsp;50&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>PES 注射器滤器&amp;nbsp;0.22&amp;thinsp;&amp;mu;0.22 m&amp;mu;m&amp;nbsp;（Millex）</td><td>默克股份公司</td><td>SLGP033RS</td><td>-</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>-</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td>添加于&amp;nbsp;5&amp;nbsp;&amp;mu;L&amp;nbsp;每&amp;nbsp;mg&amp;nbsp;组织</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Meda pharma</td><td>7167204</td><td>术前消毒</td></tr><tr><td>核黄素磷酸盐（RFP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0630000</td><td>浓度：&amp;nbsp;0.01%&amp;nbsp;w/v&amp;nbsp;（最终）&amp;nbsp;0.02%&amp;nbsp;w/v&amp;nbsp;（储备液）</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Bandelein 电子设备</td><td>Sonoplus GM mini20</td><td>-</td></tr><tr><td>超声波破碎探头</td><td>班德莱因电子</td><td>MS 1.5</td><td>直径1.5 mm，长度63 mm的探针</td></tr><tr><td>睑缘缝合缝线（不可吸收）</td><td>Alcon&amp;nbsp;</td><td>8065308001</td><td>1&amp;ndash;根据需要使用 2 根缝线</td></tr><tr><td>妥布霉素眼用溶液（3 mg/mL）</td><td>诺华</td><td>Tobrex</td><td>给药方案：每日两次，直至愈合</td></tr><tr><td>Hessburg-Barron 角膜环钻，6.5&amp;nbsp;毫米直径</td><td>杰德迈德</td><td>21-8265</td><td>-</td></tr><tr><td>含聚合物凝胶分离剂的真空采血管</td><td>BD（Becton, Dickinson and Company）</td><td>367704</td><td>-</td></tr><tr><td>赛拉嗪溶液</td><td>Laboratorios Calier SA</td><td>Xylagesic</td><td>剂量：&amp;nbsp;5&amp;nbsp;mg/kg&amp;nbsp;肌内注射</td></tr></tbody></table>

富集型光交联明胶–核黄素水凝胶的制备及其在兔角膜伤口修复中的外科应用

Fabrication and Surgical Application of Enriched Photo-crosslinked Gelatin&#8211;Riboflavin Hydrogels for Corneal Wound Repair in Rabbits

本文介绍了一种逐步操作方案，用于制备、补充以及外科应用一种 原位 用于兔角膜基质伤口修复的蓝光交联明胶水凝胶。该水凝胶前体包含5%（w/v）明胶和0.01%（w/v）核黄素磷酸，于无菌避光条件下制备，经无菌过滤并在使用前加热以达到可注射黏度。文中详细说明了可选添加人羊膜提取物或兔自体血清的方法。在眼表通过波长λ = 420–480 nm的蓝光照射2分钟，实现按需凝胶化。 体内 该方法包括可重复的前基质角膜切除术（角膜环钻直径6.5 mm；深度约187 µm），随后进行水凝胶填充、光激活，以及部分外侧睑缘缝合，以稳定治疗效果、促进伤口愈合并标准化术后护理。代表性 体外 表现出类凝胶的粘弹性行为，具有剪切稀化和快速恢复特性，以及高光学透过率（&#62; 90%）在500 nm以上，表明适用于角膜使用。 体内基于水凝胶的治疗可促进上皮逐步闭合，具有良好的眼部耐受性（第3天和第7天的Draize评分较低），并随时间推移出现可见水凝胶的减少，符合生物降解与组织替代的特征。本方案强调了确保可重复性的关键步骤和暂停节点，包括溶解与过滤过程中的温度控制、避光操作以及交联过程中的光源定位。该方法可实现无需缝合、精确定位、光激活的水凝胶稳定化，且兼容多种生物活性添加剂的引入。本方案为下一代眼科生物材料的临床前评估提供了实用平台，并有助于光交联水凝胶疗法在角膜伤口修复中的转化应用。

水凝胶的合成与表征 
水凝胶的合成与评价 体外 以确定其光交联前后流变学和光学特性。采用剪切流变学表征其粘弹性、屈服行为及流动特性。频率扫描结果显示，在所有测试频率下，G′始终高于G″，表明材料呈类固态行为（图 5A）。在 10 rad·s⁻1 显示出一个较宽的线性黏弹性区域（约100%应变），其中储能模量（G′）始终高于损耗模量（G″），表明具有类凝胶结构（图5B）。蓝光交联前进行的流动扫描显示了剪切变稀现象，随着剪切速率从10⁻³ s⁻¹增加，黏度显著下降。4 至 100 s⁻1，模拟注射条件（图 5C）。阶跃剪切测试表明，该材料在高剪切破坏后5秒内黏度即可恢复至基线水平，显示出快速恢复特性，支持其具备自愈合能力（图 5D).
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一种可重复的方案被提出，用于制备、富集及应用 原位 用于兔角膜基质伤口修复的蓝光交联明胶-核黄素水凝胶，包括手术操作步骤、部分睑缘缝合术及术后护理。

本文介绍了一种逐步操作方案，用于制备、补充以及外科手术应用一种原位蓝光交联...

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

制造与外科应用强化光联明胶-核黄素水凝胶，用于兔子角膜创口修复

我们报道了一种在电纺丝膜内制造微孔结构以研究细胞行为的技术。具体而言，我们描述了一种结合微立体光刻与电纺丝的方法，用于制备具有微结构特征的PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）角膜生物材料装置。...

结合微立体光刻与静电纺丝技术制备用于角膜再生的带壁龛结构膜

角膜胶原交联（CXL）是目前唯一可用于阻止圆锥角膜进展的保守治疗方法，其通过增强角膜基质的生物力学刚性来实现。本文旨在介绍三种不同CXL方案的操作方法：传统CXL（C-CXL）、加速CXL（A-CXL）和离子导入CXL（I-CXL）。...

圆锥角膜中三种不同的角膜胶原交联方案：传统法、快速法与离子导入法

我们展示了核黄素联合UVA对轴向伸长的兔眼进行巩膜交联的效果。通过缝合13日龄新西兰兔（雄性和雌性）的右眼眼睑（睑缘缝合术），诱导其产生轴向伸长。...

使用核黄素和紫外线A辐射进行巩膜交联以预防兔模型中的轴性近视

本方案描述了利用化学交联评估兔巩膜的方法 二次谐波成像与 差示扫描量热法.

兔巩膜中二次谐波信号作为近视治疗性组织交联（TXL）疗效评估的工具

本文描述了一种用于角膜伤口愈合研究的离体角膜器官培养模型的实验方案。该模型系统可用于评估药物在有序的三维多细胞环境中促进再生性愈合或产生药物毒性的效应。...

离体角膜器官培养模型在伤口愈合研究中的应用

本文建立了基于小鼠和兔的动物模型，用于角膜上皮机械性和化学性损伤的研究，以筛选新的治疗方法及其潜在机制。...

Ex Vivo 和 In Vivo 角膜上皮机械性与化学性损伤动物模型

本文介绍了一种用于研究角膜解剖结构、组织学特征及其愈合过程的新型动物模型。该新型动物模型采用蒙古沙鼠，其角膜在多个方面与人角膜具有相似性。...

蒙古沙鼠作为伤口愈合的动物模型

单纯后弹力层剥离术（Descemet's Stripping Only，DSO）是一种实验性手术方法，适用于因福克斯内皮角膜营养不良（Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy）导致中央角膜出现滴状赘疣的患者，通过剥离后弹力层，促使周边细胞再生内皮层。本文提出一种新的方法，模拟在体外（ex...

一种仅进行后弹力层剥离的人类角膜器官培养模型及其由工程化成纤维细胞生长因子1促进的加速愈合

本方案描述了从羊膜（AM）中提取lumican的方法，以及将羊膜提取物（AME）在-20 °C、4 °C和室温（RT）下分别保存6、12、20和32天的储存条件，以定量其蛋白质含量和lumican浓度。...

从羊膜中提取Lumican及其储存温度的确定

本文所述方案展示了强效黏附性水凝胶明胶邻硝基苯甲醛（gelatin-NB）的合成方法。gelatin-NB具有快速且高效的组织黏附能力，可形成坚固的物理屏障以保护创面，因此有望应用于损伤修复生物技术领域。...

强效粘附性水凝胶 Gelatin O-硝基苯甲醛的合成

机械分离的基质血管组分（SVF）与纤维蛋白水凝胶联用，可为具有多种适应症的活性脂肪来源基质细胞提供一种简便且高效的载体，适用于组织工程或伤口愈合等用途。本文介绍了一种用于转化研究和临床应用的机械法SVF（mSVF）-纤维蛋白水凝胶构建物的制备方法。...

机械分离基质血管组分与纤维蛋白水凝胶的联合应用：一种处理方案

University of the Basque Country UPV/EHU.  本书提出了一种可重复的方案，用于原 位 制备、富集和应用蓝光交联明胶核黄素水凝胶，用于兔子角膜间质伤口修复，包括手术处理、部分跗骨术及术后护理的操作步骤。

富集型光交联明胶–核黄素水凝胶的制备及其在兔角膜伤口修复中的外科应用

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