Xenopus 早期胚胎发生过程中新生转录组的代谢标记

本研究探讨了在非洲爪蟾胚胎早期发育过程中合子基因激活及过渡性调控的发生机制。现有方法难以在大量母源RNA存在的背景下检测新激活的合子转录本。本实验方案通过标记并富集新生转录本，实现了对这类转录本的有效检测。

首先，将显微注射室置于体视显微镜下，并向室内加入1毫升Ficoll溶液。取保存在0.1倍浓度Mark's改良林格液（MMR溶液）中的非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎。使用塑料移液管将20个或更多的胚胎转移至显微注射室的中央。

用镊子剪断玻璃针的精细尖端，制备注射针。将针头垂直放置，尖端朝下，使用带有微量加样头的P2移液器加入0.5 µL的50 mM 5-乙炔基尿苷（5-ethynyluridine）或5 M EU。将针头安装到显微操作仪上。

使用 P10 移液器，将 10 微升卤代烃油滴加到体视显微镜下放置的镜台测微尺上。进行体积校准时，踩下显微注射仪的脚踏开关，将一滴液体注入测微尺上的卤代烃油中。调节显微注射仪的压力和注射时间，直至液滴直径达到 0.27 毫米。

用镊子夹住单细胞期胚胎，并使用显微操作仪控制针头，向胚胎中注射 10 纳升浓度为 50 mM 的 5 EU。将注射后的胚胎转移至含有 Ficoll 溶液的新玻璃培养皿中，孵育 1 小时。移除 Ficoll 溶液，加入 0.1 XMMR 溶液。在胚胎发育过程中进行肉眼观察，必要时去除任何异常胚胎。

将10个处于目标发育阶段的胚胎转移至1.5毫升微量离心管中。去除管中残留的培养基，用液氮速冻胚胎，并置于-80摄氏度冰箱中保存。随后从胚胎中提取总RNA，并使用商业试剂盒测定其浓度。

配制50微升点击反应体系，将所示组分加入1.5毫升微量离心管中混合均匀。将反应混合物置于室温下，在旋转摇床（nutator）上孵育30分钟。随后，向每份反应混合物中加入糖原、乙酸铵和预冷的乙醇。

用移液器吹打混匀五次。在负80摄氏度冰箱中孵育过夜。过夜孵育后，在4摄氏度条件下以13,000 G离心20分钟，然后小心去除上清液，避免扰动沉淀。

用700微升75%乙醇洗涤沉淀物两次。离心后弃去上清液，在室温下将沉淀物晾干5至10分钟，然后将其重悬于10微升无RNase的水中。取5微升链霉亲和素包被的磁珠，加入新的1.5毫升离心管中。

向珠子中加入9 µL洗脱缓冲液2，充分混匀。将离心管置于磁力架上静置2分钟。吸去上清液，并重复洗涤两次。

然后将磁珠重悬于5 µL洗涤缓冲液2中。在1.5 µL微量离心管中配制主混合液。向每管含有RNA样品的反应管中加入15 µL主混合液。

将离心管置于加热金属块上，在69摄氏度下孵育5分钟。随后将离心管放在冰上。然后向每个RNA样品中加入5 µL预洗过的磁珠，并在室温下于旋转混合仪上孵育30分钟。

用50微升洗涤缓冲液1洗涤珠子-RNA复合物五次，随后用50微升洗涤缓冲液2洗涤五次。将珠子重悬于5微升洗涤缓冲液2中。直接使用含有新生EU RNA的珠子进行互补脱氧核糖核酸合成及文库构建。

在合子基因组激活过程中，当比较受精后6小时与受精后5小时的新生转录组时，检测到差异激活的基因数量逐渐增加，并在受精后7小时、8小时和9小时进一步增多。与总RNA测序数据相比，在新生EU RNA测序数据中，合子基因在更高水平且更早时间点被检测到。对代谢标记的新生RNA进行仔细纯化是确保本方案灵敏度和特异性的最关键因素。

利用本方案产生的EU标记的新生RNA可在体外进一步进行生物化学分析。该方法有助于未来在单细胞分辨率下研究基因组激活模式、组织特异性基因表达及调控机制。