一种使用叔丁基过氧化氢诱导原代人黑素细胞产生应激诱导性早衰的标准化方案

我们的研究重点是探讨黑素细胞的衰老表型及其在皮肤外源性衰老中的作用。已建立的衰老模型通常使用成纤维细胞，无法反映黑素细胞特有的生物学特性。本方案通过在原代人黑素细胞中诱导tBHP介导的氧化应激，建立相应的衰老模型。

首先，准备好所需的试剂。在解冻黑色素细胞并使其恢复培养三天后，确保在接种当天细胞融合度达到80%至90%。用移液器吸除培养瓶中的培养基。

用DPBS洗涤细胞两次。加入2毫升胰蛋白酶EDTA溶液以解离细胞。将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育5分钟。

轻轻敲击培养瓶，然后在显微镜下观察细胞，以确认细胞完全脱落。加入1.5倍体积的胰蛋白酶抑制剂以终止反应。

将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。用DPBS稀释悬液至终体积10毫升。在相对离心力100 ×g条件下离心细胞悬液5分钟。

吸弃上清液，并将细胞沉淀重悬于所需体积的培养基中。对于叔丁基过氧化氢（tBHP）处理组，每10厘米培养皿接种600,000个细胞；对照组每皿接种400,000个细胞。

使用DPBS或培养基将tBHP储备液稀释，配制10毫摩尔/升的工作液。每孔加入100微摩尔/升的tBHP处理细胞，作用时间为1小时。轻轻左右晃动培养板，使tBHP在培养基中均匀分布。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中精确孵育1小时。吸除培养基以终止tBHP处理。用预热至37摄氏度的DPBS洗涤培养板两次。

向培养板中加入适量的新鲜培养基。将培养板放入培养箱中，使细胞恢复至少4小时后再进行下一步处理。当天晚些时候重复处理步骤，进行第二次处理。

继续治疗方案至第4天，随后将细胞培养至第9天以检测衰老标志物。计数经tBHP处理的细胞和对照细胞。以相同的初始密度重新接种，或如果从tBHP处理的培养板中获得的细胞少于600,000个，则将所有收集的细胞重新接种。

在培养的第4天、第9天和第15天对细胞进行计数。在第9天，用PBS洗涤细胞两次，然后使用2%甲醛和0.4%戊二醛对细胞进行固定。

用 PBS 清洗固定后的细胞两次。将固定后的细胞置于 pH 6 的染色液中孵育。盖上培养板以避光，然后在 37 °C 条件下孵育 18 小时，且不提供二氧化碳。

用 PBS 洗涤细胞两次。使用光学显微镜观察并计数蓝色染色细胞的数量，再除以同一视野中的细胞总数。

以阳性细胞的百分比表示结果。在诱导氧化应激后，与对照组相比，tBHP 处理显著降低了黑素细胞的增殖。处理组细胞在第9天时仅达到1.4个累积群体倍增数（cPDL），而对照组则达到3.1个cPDL。

到第15天时，经处理的细胞增殖水平稳定在1.9 cPDL，而对照组细胞则扩增至5.1 cPDL。与对照组相比，在所有检测时间点，经tBHP处理的黑素细胞均表现出细胞表面积增加，且细胞增大现象持续至第15天，这与衰老细胞的体积增大和扁平化形态特征一致。tBHP处理的黑素细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-半乳糖苷酶）活性升高，阳性细胞占32%，而对照组仅为3%。

SA-β-半乳糖苷酶阳性率的升高与衰老表型一致。免疫荧光分析显示，与对照组相比，tBHP处理的黑素细胞中γ-H2AX水平升高。处理组细胞的γ-H2AX信号强于对照组。

实时定量聚合酶链式反应分析显示，衰老相关分泌表型因子的表达增加，其中白细胞介素-8的表达增幅最大，而白细胞介素-6和基质金属蛋白酶-1的表达呈中等程度上升。Western印迹分析证实了细胞衰老的诱导。

与对照组相比，tBHP处理的黑素细胞中Lamin B1显著减少。与对照组相比，tBHP处理的黑素细胞中磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白水平降低。tBHP处理可上调黑素细胞中p16和p21的转录表达。

该模型可使研究人员研究衰老的黑色素细胞如何通过SASP炎症因子影响色素沉着并与周围细胞进行通讯。本实验方案的难点在于精确控制时间，tBHP需每天处理两次，且两次处理之间至少间隔四小时。

按照本实验方案，可利用衰老相关β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光、RT-qPCR以及对已确立的衰老标志物进行蛋白质印迹（Western blotting）来表征细胞衰老。