Name: 用于禾本科植物-微生物互作研究的植物无菌培养系统组装与使用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习组装GNOVA无菌培养系统用于禾本科植物与微生物互作研究。该系统支持小麦和玉米长期生长，实现灌溉管理，发芽率达100%，显著促进植株发育，为农业微生物研究提供可靠平台。

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本研究由诺和诺德基金会（INTERACT，资助编号：NNF19SA0059360）和美国农业部国家食品与农业研究所（资助编号：2022-67013-36672）资助。

注意：底座的3D打印文件可在补充材料中找到，并已在Dryad平台公开提供（https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc）。为提高速度并降低成本，建议在当地商业3D打印服务机构批量打印。
1. 无菌系统组装
<ol>
	<li>开始组装培养皿（在重复实验使用前仅执行一次）。
	<ol>
		<li>将不锈钢丝网圆片置于聚碳酸酯管的一端，用软管夹固定，以封闭罐底。图1A).</li>
		<li>在聚碳酸酯管开放端顶部边缘下方1.5 cm处，钻一个直径为1/4英寸（6.35 mm）的灌溉孔。在距离第一个孔3 cm处，钻两个直径为1/8英寸（3.18 mm）的狭缝，其中一个狭缝距边缘1 cm，另一个距上方狭缝2 cm。 
		注意：如有需要，可按照相同步骤在盆的上边缘增加额外的管路。</li>
		<li>通过1/4英寸的开口插入一段短硅胶管来安装灌流管路。</li>
		<li>通过将扎带穿过两个位置来固定管路 &#8539; 英寸插槽 (图1B）。将接头1的公鲁尔接头插入罐外延伸的硅胶管中（图1C). 
		注意：接头1的软管接头应外露。</li>
		<li>用玻璃棉填充一支空的注射器筒，并用一小片铝箔封住末端，以制备注射器筒图1C).</li>
		<li>将一段短的硅胶管连接到注射器筒的鲁尔锁端（图1C).</li>
		<li>准备两个相同的注射器筒体。将其中一个准备好的注射器筒体连接到从容器中引出的管路的接头1露出的软管接头上图1D).</li>
		<li>暂停：组装好的培养皿可储存以供后续实验使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig1.jpg" /> 
图 1：花盆组装示意图。 A) 花盆底部用金属网和软管夹封闭。(B) 花盆顶部边缘的灌溉口。(C) 灌溉管末端为接头 1 的裸露软管接头，并连接已准备好的注射器筒。(D) 组装完成的花盆，灌溉管已封闭&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>实验用盆的准备（每次新实验前执行）
	<ol>
		<li>用两个预先裁剪好的玻璃纤维管包裹圆片铺满盆底（图 2A）。</li>
		<li>将两份黏土与一份沙子混合，制备土壤基质。向盆中加入 840 mL 基质。</li>
		<li>用塑料盖盖住盆口，并用胶带固定（图 2B）。</li>
		<li>将装好基质的盆在121 °C条件下干循环高压灭菌30分钟。盖上塑料盖，过夜冷却。再次在121 °C条件下干循环高压灭菌30分钟。待其完全冷却。保持盆口用塑料盖覆盖。 
		注意：可使用其他类型的土壤基质，但每盆所需用量应预先优化。GNOVA系统也已测试使用800 mL纯黏土和1 L纯沙的条件。其他土壤基质可能需要更多次高压灭菌或调整参数以实现完全灭菌。 
		注意：从高压灭菌器中取出盆时需小心操作，材料温度较高，且软管夹可能松动。待冷却后，应确保软管夹已用手拧紧，再移动盆体。</li>
		<li>将冷却后的盆插入3D打印底座中。将装有土壤的盆放入3D打印底座内。操作时应握住盆的底部，而非开口处的支柱，因为后者是最脆弱的部分。</li>
		<li>将灌溉管通过3D打印底座的一个下部开口穿入（图 2C）。 
		注意：请勿对3D打印的支撑底座进行高压灭菌，以免高温导致部件熔化。若实验需在60 °C以上进行，可能需要选用耐高温的打印材料（参见材料表）。</li>
		<li>高压灭菌后，将盆置于室温环境中保存，在最终实验设置完成前，不得移除塑料盖或预装好的注射器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig2.jpg" /> 
图2：制备好的花盆示意图。&#160;（A）花盆底部衬有玻璃纤维管包裹材料。 （B）花盆顶部用塑料盖封闭。 （C）空花盆安装在最终的3D打印底座设计内部。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>玻璃管准备（每次新实验前进行）
	<ol>
		<li>用预先裁剪好的DW4滤膜封住玻璃管的一端，并用乙烯基胶带固定（图3A）。</li>
		<li>将玻璃管翻转，使另一端开口朝上，在距管口14 cm处将一个棉环固定于管内，使用医用胶带固定棉环（图3B）。</li>
		<li>用灭菌包装材料封住玻璃管底端，并用两根橡胶圈固定（图3B）。</li>
		<li>使用前，将准备好的玻璃管在121 °C条件下干热灭菌30分钟。灭菌后，将无菌玻璃管在室温下保存备用，不要拆除包装材料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig3.jpg" /> 
图3：玻璃圆筒组件。&#160;（A）玻璃圆筒顶端，用 DW4 滤膜和乙烯基胶带封闭。（B）玻璃圆筒底端，装配棉环，并用灭菌包装材料和橡皮筋封闭。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>灌溉滤器的制备（每次浇水前均需执行此步骤，但步骤1.4.4–1.4.6仅需进行一次）
	<ol>
		<li>将PES滤膜（图4A.4）置于滤器底座（图4A.5）与滤片（图4A.3）之间，组装滤器底座。</li>
		<li>将滤膜光滑面朝向流出方向，确保其面向滤器上盖（图4A.1）。</li>
		<li>将O型圈（图4A.2）嵌入滤器上盖（图4A.1）中，然后将滤器上盖连接至滤器底座，仅用手拧紧即可。</li>
		<li>安装接头。将接头2的公端滑入滤器上端口。</li>
		<li>将一段短硅胶管连接至滤器上的软管接头端（图4B）。将接头1的公鲁尔接头插入步骤1.1.6中准备好的另一支注射器筒末端（图4B）。</li>
		<li>将滤器连接至已准备好的注射器筒上的软管接头。</li>
		<li>将组装好的滤器在121 °C条件下干循环高压灭菌30分钟。待滤器冷却后，在使用前再次拧紧。 
		注意：建议一次性准备好所需全部滤器，并将其放入密闭的聚丙烯盒中进行高压灭菌。灭菌后，只要不从注射器筒上拆下，灌溉滤器可在室温下保持无菌状态直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig4.jpg" /> 
图 4：滤膜夹具组件。&#160;（A）拆解状态的滤膜夹具部件：1. 滤膜夹具上部，2. O型圈，3. 滤盘，4. 滤膜，以及5. 滤膜夹具本体。（B）组装完成的滤膜夹具及配套的已准备好的注射器筒体。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 实验设置
<ol>
	<li>至少在实验开始前一天准备好所有溶液和材料，并进行灭菌处理。
	<ol>
		<li>根据制造商说明配制 0.5X Murashige 和 Skoog 植物生长培养基。将培养基在液体循环模式下于 121 °C 高压灭菌 30 分钟。</li>
		<li>将拆卸后的瓶口分液器在干燥循环模式下于 121 °C 高压灭菌 30 分钟。将 1 L 去离子水在液体循环模式下于 121 °C 高压灭菌 30 分钟。</li>
		<li>提前一天将玻璃培养皿、500 mL 烧杯、茶漏和镊子在干燥循环模式下于 121 °C 高压灭菌 30 分钟。 
		注：除非另有说明，以下所有步骤均应在超净工作台中使用无菌操作技术进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对种子进行表面灭菌。 
	注：种子表面灭菌方案取决于所使用的植物种类。该已知菌群系统已通过小麦和玉米的种子灭菌方案进行测试。 
	注意：操作次氯酸钠和漂白剂时应穿戴实验服、手套和护目镜，因为这些化学品可能对皮肤和眼睛产生刺激或腐蚀作用。乙醇易燃，切勿在明火附近使用。
	<ol>
		<li>小麦种子灭菌25
		<ol>
			<li>用两个烧杯各装 150 mL 95% v/v 乙醇，一个烧杯装 150 mL 未稀释家用漂白剂，另两个烧杯各装 150 mL 水。</li>
			<li>将小麦种子放入茶漏中，将装有种子的茶漏轻轻浸入其中一个含 95% v/v 乙醇的烧杯中，轻轻搅动 1 分钟。</li>
			<li>将种子转移至新的茶漏中，将装有种子的茶漏在漂白剂中轻轻搅动 10 分钟。</li>
			<li>将种子转移至另一个新的茶漏中，将装有种子的茶漏在另一杯 95% v/v 乙醇中轻轻搅动。</li>
			<li>将装有种子的茶漏在无菌去离子水中轻轻搅动 30 秒，再在另一杯无菌去离子水中轻轻搅动 2 分钟。将灭菌后的种子置于无菌空培养皿中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>玉米种子灭菌26
		<ol>
			<li>将玉米种子放入 50 mL 锥形离心管中，加入 70% v/v 乙醇至充满。轻轻倒置混匀 3 分钟。</li>
			<li>倾去 70% 乙醇，加入含种子的 2% v/v 次氯酸钠溶液至充满。轻轻倒置混匀 3 分钟。</li>
			<li>倾去 2% 次氯酸钠溶液，用无菌去离子水冲洗种子。倒去水后，再用无菌去离子水重复冲洗四次。将玉米种子转移至无菌培养皿中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如适用，在培养基中加入微生物接种物。 
	注：在已知菌群系统的优化及无菌性测试过程中未添加任何微生物接种物。</li>
	<li>组装瓶口分液器，并将其连接至培养基瓶上。 
	注：由于这是一个开放式系统，建议准备一个容器以收集流出的培养基。我们发现使用烤盘效果良好且便于移动，但需频繁清空。</li>
	<li>取下花盆上的塑料盖，向花盆中加入 378 mL 培养基。 
	注：这相当于约 70% 的水分填充孔隙度（WFPS），当使用其他土壤基质时应相应调整。黏土使用 360 mL，沙土使用 358 mL。
	<ol>
		<li>使用无菌镊子将灭菌后的种子播种至适当深度。</li>
		<li>小麦播种深度为 ½ 英寸，玉米为 1 英寸。也可将无菌预萌发的幼苗移栽至 GNOVA 系统中。进行玉米生长测试时建议使用预萌发种子。</li>
		<li>将塑料盖重新盖回花盆上方。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 最终组装与实验操作
<ol>
	<li>将培养罐和玻璃圆筒转移至生长室。用手握住玻璃圆筒，使其底部朝下靠近培养罐。</li>
	<li>迅速取下培养罐的塑料盖以及玻璃圆筒的灭菌包装，将玻璃圆筒向下放置在顶部，使其固定在3D打印底座的凸缘上。 
	注意：在生长系统最终组装过程中，可在培养罐旁放置火焰源（如便携式本生灯），以进一步降低污染风险。 
	警告：使用明火时，务必确保周围无其他易燃物品。注意火焰相对于身体的位置，以防烧伤。</li>
	<li>根据植物种类，采用特定物种的生长条件，培养植物4至17周。</li>
	<li>小麦的昼夜培养温度设为22 °C/16 °C，玉米设为27 °C/23 °C。两种植物的光周期均为仅使用荧光灯照明的12小时光照。</li>
</ol>
4. 灌溉
<ol>
	<li>将一根长硅胶管连接到瓶口分配器上。</li>
	<li>使用便携式火焰在浇灌过程中保持无菌。若无法使用便携式火焰，则采用次氯酸钠溶液进行浇灌以维持无菌状态。</li>
	<li>使用便携式火焰进行浇灌。 
	注意：操作时需小心明火，以防人身伤害和设施损坏。
	<ol>
		<li>将火焰置于浇灌管路附近。从浇灌管路和滤器支架上取下注射器筒。保持所有管路末端处于火焰区域之内。</li>
		<li>将滤器支架连接至浇灌管路。将两个注射器筒相互连接。将瓶口分配器上的另一段长硅胶管连接至滤器支架的底部接口。</li>
		<li>分配150 mL的0.5×Murashige和Skoog培养基。将两个注射器筒分开。</li>
		<li>从滤器支架上拆下硅胶管，并替换为一个注射器筒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用10%次氯酸钠溶液进行浇灌 
	注意：建议在大规模实验（n &gt; 50）中采用此浇灌策略，以提高浇水通量。 
	注意：处理次氯酸钠时应穿戴实验服、手套和护目镜。
	<ol>
		<li>将10% (v/v) 次氯酸钠溶液分装至两个小型塑料烧杯中，并将其放置在浇灌管路附近。从浇灌管路和滤器支架上取下注射器筒。</li>
		<li>将所有管路末端浸入10%次氯酸钠溶液中，直至使用前。使用前甩去多余溶液。将滤器支架连接至花盆的浇灌管路。</li>
		<li>将瓶口分配器的另一段长硅胶管连接至滤器支架的底部接口。</li>
		<li>分配150 mL的0.5×Murashige和Skoog培养基。从滤器支架上拆下硅胶管。 
		注意：砂土基质的浇灌量为120 mL，黏土基质为360 mL。</li>
		<li>甩去多余次氯酸钠后，用注射器筒替换浇灌管路中的滤器。 
		注意：若浇灌体积发生变化，需额外预留约20 mL培养基用于润洗浇灌管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每周浇灌花盆一次。根据实验目的和所用土壤基质调整浇灌体积和频率。若使用100%砂土，则需将浇灌频率提高至每周两次。</li>
</ol>
5. 收获
注意：本收获方案是在无菌系统测试与优化期间所遵循的流程。应根据具体的研究目标及待处理样本的数量对收获方案进行相应调整。
<ol>
	<li>至少在收获前一天准备好所有溶液和材料并进行灭菌。
	<ol>
		<li>提前一天，将4 L去离子水和500 mL 0.145 M NaCl在液体循环中于121 °C下高压灭菌30分钟。</li>
		<li>提前一天，将剪刀和镊子在干燥循环中于121 °C下高压灭菌30分钟。 
		注意：除非另有说明，以下所有步骤均应在超净工作台中采用无菌技术进行。如果样品采集无需保持无菌，这些步骤也可在超净工作台外完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将无菌系统从生长室转移至实验室，并将其放置在超净工作台附近。</li>
	<li>从花盆中取出玻璃圆筒，并迅速将花盆放入超净工作台中，然后将花盆从3D打印的底座中取出。</li>
	<li>用手握住植株基部，将土壤基质倒入容器中。轻轻抖动根部以去除较大的土壤团块。 
	注意：在此收获步骤中，可根据具体研究目的收集和处理土壤基质样品。此处简要描述的方案用于检测土壤的无菌性。</li>
	<li>采用单板连续稀释点样法27进行土壤细菌计数的土壤采集28。
	<ol>
		<li>在96孔板的各孔中加入270 µL 0.145 M NaCl，第一行留空。将1 g土壤基质加入含有9 mL 0.145 M NaCl的15 mL锥形管中。</li>
		<li>以最大速度涡旋振荡5分钟。将30 µL样品转移至96孔板中的一个空孔中。</li>
		<li>通过将每个样品的30 µL移液至下方含有270 µL NaCl溶液的孔中，制备每个样品的七次连续稀释液。</li>
		<li>每次转移后，通过反复吹打充分混匀。</li>
		<li>通过将每个连续稀释液的10 µL点样于单个R2A平板上，制备每个样品的单板连续稀释点样。</li>
		<li>倾斜平板使液滴铺展均匀。将平板在室温下培养。</li>
		<li>计数菌落形成单位（CFU），并计算每克土壤中的CFU数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌剪刀将地上部分与根部分离。记录地上部分鲜重。</li>
	<li>将根部在盛有去离子水的烧杯中轻轻晃动以清洗干净。用吸水纸吸干根部并记录鲜重。 
	注意：此时可收集地上和地下部分材料，并根据最适合后续分析的方法进行处理。</li>
</ol>

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所有作者均声明无利益冲突。

本文介绍的植物无菌体系GNOVA，为研究谷类作物与微生物的相互作用提供了一种易于使用且多功能的工具。该体系的主要特点包括增强的生长能力以及内置灌溉系统，可在无菌条件下将谷类作物的生长延续至幼苗期之后。该体系的性能与EcoFAB 3.0相当，是一种易于获取的植物无菌体系替代方案。GNOVA由市售组件构建而成，组件的选择兼顾成本、操作简便性以及与中型高压灭菌器的兼容性，便于在不同实验室中推广应用。其组装和操作过程简单，无需特殊设备，从而降低了使用门槛。由于GNOVA可兼容多种土壤基质、种子灭菌方案、微生物接种物（无菌状态、合成群落或天然微生物群落）以及多样的下游分析方法，因此可根据不同的研究目标进行灵活调整。
在植物无菌体系实验中，最大限度减少污染至关重要，以确保观察到的效应可归因于目标微生物而非污染物。GNOVA 的操作简便，有助于降低污染风险。严格遵守无菌操作技术并遵循以下关键建议，可确保体系无菌状态的维持。在实验设置过程中，建议在接种不同微生物之间对超净工作台进行消毒，以最大限度减少处理间的交叉污染。接种处理的顺序也可影响交叉污染的程度，优先接种无菌处理，再进行任何活体微生物接种，是理想的操作顺序。外源微生物还可能通过种子引入。因此，应针对不同植物种类或种子来源优化种子表面灭菌方案，以平衡灭菌效果与种子萌发率26。对于高粱24、大麦29、柳枝稷和燕麦23等非模式禾本科作物，其灭菌方案可直接在 GNOVA 系统中实施。若灭菌处理对萌发产生不利影响，可改用预先萌发的种子。在无菌体系中，灌溉是主要的污染来源之一。该过程中最关键的步骤是将过滤器连接至灌溉管路。此操作过程中，灌溉管路和过滤器的管口末端必须始终保持无菌状态。火焰灭菌需要较高的操作技巧，且在大规模实验（n &#62;50）中较为耗时费力。因此，对于大规模实验或无法实施火焰灭菌的情况，推荐采用基于次氯酸钠的替代方法。建议在灌溉过程中额外准备无菌过滤器，并备有次氯酸钠或乙醇，以应对操作过程中可能发生的污染。此外，强烈建议设置污染对照单元（即不种植植物、不接种微生物，但正常接受灌溉），用于监测体系无菌状态并识别污染物。
为避免灌溉污染的风险，早期的植物无菌体系完全封闭且不具备灌溉能力，这限制了实验的持续时间。玉米在无菌条件下于袋子19,30、玻璃管和培养皿15中生长，持续时间为两到四周。为了在植物生长期间补充水分和养分，出现了诸如EcoFAB23、FlowPot和GnotoPot21等替代系统，这些系统可在超净工作台内通过部分拆卸实现灌溉。但此类设计限制了系统的尺寸及其与较大植株的兼容性。由于GNOVA系统的灌溉管线可在外部直接接触，因此无需拆卸，也不受超净工作台尺寸的限制。这不仅实现了营养物质和水分的持续供应，还增加了可用的生长空间。地上部分空间不足会降低光合作用能力，并可能导致植株矮小24；根系体积受限则可能引起根系缠绕，减少水分和养分的吸收31。袋式系统中生长空间狭小且无法灌溉的特点，可以解释为何玉米和小麦的生物量较低且物候发育停滞，与GNOVA系统相比表现较差。新系统使玉米的无菌生长持续时间达到了与高粱在EcoFAB 3.0系统中相当的水平24。此外，在更接近真实土壤环境的系统中，该系统实现了比水培系统中持续四周的小麦无菌生长更为优越的表现（20）。除了物理限制外，无菌系统通常依赖受限的空气流通来维持无菌状态。空气流通受限可能导致温度和湿度升高，气体交换速率降低，从而影响植物生理过程32。已有研究表明，在通风条件改善的系统中植物生长表现更佳，例如配备HEPA过滤器的Magenta盒33，其工作原理与GNOVA中使用的DW4过滤器类似。同样，EcoFAB 3.0系统也存在温度和相对湿度升高的问题，但仍被视为支持高粱无菌生长的可靠平台24。这表明，尽管无菌系统仍存在物理和环境上的限制，但本文所介绍的系统设计改进仍提供了更优的生长条件，能更有效地支持谷类作物的无菌生长。
易于修改是GNOVA的另一关键特性。其模块化设计使用户能够针对个体组件进行调整，以更好地满足研究需求和预算限制。该系统可兼容任何土壤基质，包括天然土壤。装置的体积、营养液浓度以及灌溉量和频率的调整应基于土壤的理化性质，因为这些因素直接影响养分和水分的有效性及分布34。可通过监测整个GNOVA系统的重量并采用重量法测定土壤含水量来诱导干旱处理35。根系分泌物可通过将收获的植物在超纯水中孵育进行破坏性收集36，或通过冲洗系统获得非无菌淋出液37。若需要无菌分泌物，可对GNOVA的培养皿及3D打印支撑底座进行改造，集成类似EcoFAB 3.0设计中的内置分泌物收集装置24。对于希望研究微生物群落构建中优先效应38的科研人员，可在培养皿周围加装额外的灌溉管线，从而实现后续微生物接种物的施加，同时保持主灌溉线路的无菌状态。环境条件可通过在GNOVA内部放置已消毒的无线温度和相对湿度传感器进行监测。或者，将玻璃圆筒替换为聚碳酸酯培养室，并钻设取样口24，可实现对环境的监测及气体取样。这使得能够定量检测可能影响植物生长表现的气体和挥发性化合物，如CO2、O2和乙烯33。此外，通过移除玻璃圆筒中的棉塞环，还可增加系统内的气流。然而，上述任何修改均可能增加污染风险，目前尚未在GNOVA系统中经过验证或优化。
尽管GNOVA具有诸多优势和广泛适用性，但仍需考虑一些局限性。需要注意的是，该系统最适合在可控的生长培养箱内使用，因为在温室或田间等非受控条件下，其性能可能会受到影响。尽管小麦在该系统中能够生长17周，但在约12周时已观察到胁迫迹象。因此，小麦的培养时间不应超过12周。此外，无菌状态的维持仅在为期四周、每周一次的四次灌溉过程中得到验证；更长时间的实验会增加污染风险。尽管GNOVA已提高了根系体积容量，但仍可能存在根系受限的情况，对根系形态进行时间序列评估有助于确定最佳生长时间，以最大限度减少根系缠绕。另外，系统的一些改进，例如用聚碳酸酯圆筒替代玻璃圆筒，可能导致每个单元的搭建成本超过100美元。目前，GNOVA仅支持终点破坏性取样，这会增加对微生物动态、根系分泌模式或无菌状态监测等时间序列研究所需的劳动投入和重复实验数量。最后，在系统搭建、灌溉和收获过程中维持无菌状态耗时较长，即使像GNOVA这样的简化系统也需要投入大量人力，从而增加整体运行成本。综上所述，在采用该系统时应充分考虑这些局限性。此外，在实验设计和结果解读过程中，还需考虑由已知菌群生长环境带来的生态限制，因为这些因素可能影响植物生理状态，进而影响其相关的微生物组。
GNOVA 提供了一个适用于谷类作物的多功能无菌生物平台。该系统能够回收几乎完整的根系，适用于 RhizoVision Explorer39 和 ARIA40 等根系构型分析工具，可用于表征根系形态对不同微生物接种物和环境条件的响应。当与合成菌群（SynComs）和多组学分析相结合时，GNOVA 有助于揭示微生物效应因子与植物响应之间的机制联系。将较大的合成菌群（&#62;100 个成员）与宏基因组41,42,43 分析相结合，可用于研究不同条件下微生物的共现模式，并鉴定具有生态学意义的微生物5,44。相比之下，较小的合成菌群（&#60;50 株）结合宏转录组45,46、宏蛋白质组19,47,48 和代谢组49,50,51 分析，可实现对植物和微生物功能响应的详细表征44。这些能力共同使 GNOVA 成为识别关键微生物性状的有力工具，从而加速新型生物接种剂的开发，提升农业系统的可持续性。

基于微生物的农业处理方法在过去几十年中引起了广泛关注，因其具有通过促进植物生长和增强对环境胁迫的抗性来提高作物生产力的潜力。然而，这些生物刺激剂的作用分子机制仍不清楚，这可能导致其在不同土壤、地理位置和环境条件下的效果不一致1,2。要提高现有基于微生物的处理方法的有效性并推动新技术的开发，就需要更深入地理解植物–微生物相互作用的分子机制3,4。然而，由于天然微生物群落的复杂性，解析这些机制仍然具有挑战性5,6。为了鉴定驱动植物获益的微生物效应因子及其相互作用，我们可以通过在可控环境条件和微生物群落的培养系统中使用合成微生物群落（SynComs），以降低天然系统的复杂性。无菌生物学（gnotobiology）是研究与已知微生物群落相关联的宿主的学科7，它使研究人员能够比较无菌宿主与定植了特定微生物群落的宿主，从而将微生物功能与植物表型联系起来8。
早期的无菌生物系统采用玻璃试管9,10,11,12和广口瓶13构建。此后，用于植物无菌研究的新系统迅速发展。目前最常用的系统包括培养皿14、试管15,16、玻璃罐17、Magenta盒18、密封袋19、水培系统20、FlowPot和GnotoPot21、微流控系统22以及EcoFABs23。尽管取得了这些进展，大多数系统要么针对成像优化22，要么针对分泌物收集17,20，或专为小型模式物种设计14,18,21。许多系统为封闭式，限制了灌溉控制和实验持续时间。这些限制对研究需要更多空间、空气流通和水分管理的大型农作物（如谷类作物）构成了挑战。
鉴于需要一种能够容纳更大植株并支持长期研究的系统，研究人员近期开发了EcoFAB 3.0，以将已知菌群栽培体系扩展至更大尺寸的植物24。EcoFAB 3.0提供了更大的根部空间和顶空体积，可支持高粱（Sorghum bicolor）生长达4周，并支持根系分泌物收集和根部成像24。尽管该新系统是将已知菌群系统拓展应用于农作物的有前景范例，但仍亟需一种易于获取且多功能的平台，能够被不同实验室广泛采用，并兼容多种实验流程。为此，我们开发了GNOVA（GNotobiotic system for Versatile plant Applications，适用于多种植物应用的已知菌群系统），该系统专为在已知菌群条件下培养谷类作物而设计。本文提供了GNOVA系统的详细组装与操作方案，并将其性能与本实验室常规使用的已知菌群袋系统进行比较。通过该新系统的开发，我们改进了小麦和玉米在无菌条件下的培养能力，相较于早期封闭系统，提供了更大的生长空间和内置灌溉功能。GNOVA的性能与EcoFAB 3.0相当，从而拓展了研究非模式谷类作物—微生物组互作的工具库。此外，由于GNOVA结构简单、采用商业化材料制造，并提供可获取的3D模型文件，研究人员可根据自身研究需求和预算灵活更换材料与设计，进一步增强了植物已知菌群技术的通用性与适应性。

<table><tbody><tr><td>Powerconnect 无线电钻 &amp;和 100 件套工具包</td><td>Black+Decker</td><td>BDC120VA100</td><td>1/4&quot; 和 1/8&quot; 所需钻头。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙烯基胶带，黄色，1&quot; 宽 x 36 码&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>471</td><td>耗材</td></tr><tr><td>#32 号斯特林橡皮筋&amp;nbsp; （每套系统2根橡皮筋）</td><td>亚马逊</td><td>B001I1QO00</td><td>耗材&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小麦种子</td><td></td><td></td><td>本实验所用品种：Catawba</td></tr><tr><td>玻璃纤维管壳保温材料，3 &quot; widex 1/2 &quot; 厚&amp;nbsp; （每套系统2个预先切割的圆片）</td><td>Lowe's</td><td>28930</td><td>切成 2 7/8 &quot; 直径为7.3 cm的圆片。耗材。为实现高通量制备圆形片，可将保温卷材铺开，将坩埚边缘置于保温包裹材料上，通过施加压力并旋转坩埚，利用坩埚开口边缘切割出圆形。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DW4 滤膜介质，预切割为 15&quot; x 75 码&amp;nbsp; （每个系统1个切割圆）</td><td>Class Biological Clean, Ltd</td><td>NA</td><td>切成6.3 &quot; 直径（16.02 厘米）的圆片。如需要，也可购买 CBC 其他预切割尺寸或标准卷材。&amp;nbsp; 耗材。用硬纸板剪出一个圆形模板，用它在DW4培养基区域上画出多个圆，并用剪刀剪下。</td></tr><tr><td>硅胶管，Versilon SPX-50 高强度，1/8&quot; ID x 1/4&quot; OD × 1/16&quot; 壁厚</td><td>Saint-Gobain</td><td>ABX00007</td><td>切成两段长条（16&quot; // 40.64 厘米）和三段短管（2.5&quot; 6.35 厘米&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5% 有效氯的次氯酸钠水溶液</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>稀释至2%（v/v），用于玉米消毒方案</td></tr><tr><td>穆拉希吉 &amp;amp; Skoog 培养基，微量元素和大量元素。25 L</td><td>研究产品国际公司</td><td>M10200-25.0</td><td>稀释至0.5倍浓度</td></tr><tr><td>乙醇，100%，Deacon Labs</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td>稀释至95%（v/v）</td></tr><tr><td>3 mL 注射器，鲁尔锁扣，非无菌&amp;nbsp; （每系统2个）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-117</td><td>弃去活塞，仅保留管筒，填充玻璃棉，并用箔纸封口。</td></tr><tr><td>250 mL 玻璃烧杯&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>470191-150</td><td>小麦种子消毒需要五个</td></tr><tr><td>玉米种子</td><td></td><td></td><td>本实验所用基因型：Mexico 21&amp;ndash;22 B73XMo17</td></tr><tr><td>铝制烤盘 18&quot; × 26&quot;&amp;nbsp;</td><td>亚马逊</td><td>B01FIK54LQ</td><td>确保其尺寸适合您的超净工作台</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>配制 0.145 M 溶液。</td></tr><tr><td>3D打印底座，使用聚乳酸（PLA）细丝（每套系统1根）</td><td>Protolabs</td><td>NA</td><td>补充材料中可获取打印和可编辑的文件。文件可在 Dryad.org 获取，DOI：https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc。若使用 PLA 作为线材打印底座，则禁止高压灭菌。PLA 在高于 150 °C 时会熔化 &amp;deg;C，且在60℃以上可能发生变形 &amp;deg;C. 建议对PLA 3D打印底座的完整性进行测试，若其将在40℃以上温度条件下使用 &amp;deg;C. 对于耐热性更高的材料，可改用 PETG（聚对苯二甲酸乙二醇酯）或 PC（聚碳酸酯）；但这会增加部件成本，且仍可能无法进行高压灭菌。基础原型的 3D 打印是在一台成型体积为 256 的个人打印机上完成的 &amp;times; 256 &amp;times; 256 毫米（长度） &amp;times; 宽度 &amp;times; 高度）。为提高速度并降低成本，建议在当地商业3D打印服务机构批量打印。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>雄性鲁尔接头转1/8英寸软管接头 &quot; ID，无动物源性聚丙烯&amp;nbsp; （每系统2个）</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-50114-69</td><td>参照方案中的拟合1</td></tr><tr><td>公型快接鲁尔接头转1/8英寸软管接头 &quot; ID，无动物源性聚丙烯&amp;nbsp; （每套系统1个）</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-50114-63</td><td>参照方案中的拟合2</td></tr><tr><td>201 不锈钢蜗杆软管夹，1 1/2&quot; -3 1/2&quot; 夹紧直径（每系统1个）</td><td>格雷格纳</td><td>5CZF2</td><td>在方案中称为软管夹</td></tr><tr><td>Airstream Gen 3 层流罩，带简易开关，尺寸为 24 1/4&quot; × 47 &quot; × 28 1/4 &quot;&amp;nbsp;</td><td>ESCO 生命科学</td><td>2120707</td><td>在方案中称为层流罩。任何尺寸相似的层流罩均可使用。在较小的层流罩中可能需要进行适当调整。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Play sand, Quikrete Premium. 50 lb</td><td>家得宝</td><td>1001709466</td><td>在方案中称为沙子</td></tr><tr><td>304 不锈钢编织丝网，120 目（每套系统 1 个）</td><td>亚马逊</td><td>B09KRS5F7T</td><td>文中称为不锈钢丝网。剪成4.7&quot; 直径为 11.9 cm 的圆。为实现高通量或大量制备圆形，可用硬纸板制作圆形模板，将其用于编织网的整个网面区域描画圆形，然后用剪刀裁剪。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>膨润土（蒙脱石），OIL-DRI 疏松吸附剂，50 磅重量，无香味</td><td>格雷格纳</td><td>44Z111</td><td>在方案中称为黏土。耗材。</td></tr><tr><td>无底透明飓风蜡烛罩烟囱管 4&quot; OD × 30&quot; 长度（每个系统1个）</td><td>WCG International</td><td>HST0430</td><td>在方案中称为玻璃圆筒</td></tr><tr><td>透明塑料帽，3 个&quot; 直径（7.6 cm）&amp;nbsp; （每套系统1个）</td><td>ClearTec 包装</td><td>PCC3.000</td><td>在方案中称为塑料盖</td></tr><tr><td>透明聚碳酸酯管，3 根&quot; OD × 2 7/8&quot; 内径 × 1/16 英寸壁厚 × 12&quot; 长度&amp;nbsp; （每套系统1个）</td><td>ePlastics</td><td>PCTUB3.000X2.875</td><td>在方案中简称为 pot。可要求公司切割成其他所需长度。</td></tr><tr><td>洁净室灭菌包装，6&quot; × 6&quot; （每套系统1个）</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-101-102</td><td>在方案中称为灭菌包装材料。消耗性材料。</td></tr><tr><td>中号锯齿尖解剖镊，4 1/2&quot; 长度</td><td>VWR</td><td>82027-398</td><td>在方案中称为镊子。</td></tr><tr><td>茶漏</td><td>亚马逊</td><td>B0FRMRZWZY</td><td>小麦种子消毒需要三个步骤</td></tr><tr><td>含5.7%有效氯的Clorox漂白剂</td><td>家得宝</td><td>1005131978</td><td>小麦灭菌方案中使用未稀释液；灌溉方案中稀释至10%（v/v）</td></tr><tr><td>编织棉卷 3/8&quot; 直径 × 6&quot; 长度（每个系统2个）</td><td>里士满牙科与医疗用品公司</td><td>201208</td><td>使用微孔胶带将两根编织卷固定在一起，并剪成10又3/4英寸长&quot; （27.31 厘米）长。将其弯成环状，并使用微孔胶带封闭。耗材。</td></tr><tr><td>96孔板，平底，未处理，无菌</td><td>VWR</td><td>10861-562</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶分液器，5 - 60 mL</td><td>VWR</td><td>76319-590</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 锥形离心管，15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆锥形离心管，50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>600 mL 玻璃烧杯</td><td>VWR</td><td>470191-152</td><td></td></tr><tr><td>5 L 玻璃储存瓶</td><td>VWR</td><td>10754-824</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC386062500</td><td></td></tr><tr><td>重型铝箔</td><td>亚马逊</td><td>B093X4M4QF</td><td></td></tr><tr><td>微孔手术胶带，1&quot; 宽视野</td><td>3M</td><td>1530</td><td></td></tr><tr><td>尼龙扎带，6 个&quot; × 0.1&quot;&amp;nbsp; （每套系统1个）</td><td>亚马逊</td><td>B09H5LHW78</td><td></td></tr><tr><td>PES 0.22 微米滤膜，47 毫米，非无菌&amp;nbsp; （每套系统1个）</td><td>Tisch Scientific</td><td>SF15021</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 塑料烧杯</td><td>VWR</td><td>470332-662</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 滤膜用聚丙烯滤器&amp;nbsp; （每套系统1个）</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06623-52</td><td></td></tr><tr><td>便携式本生灯</td><td>VWR</td><td>470343-152</td><td></td></tr><tr><td>R2A 琼脂，BD</td><td>VWR</td><td>90000-994</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 数字混匀仪，230/240 V</td><td>VWR</td><td>78496-568</td><td></td></tr></tbody></table>

用于禾本科植物-微生物互作研究的植物无菌培养系统组装与使用

Assembly and Use of a Plant Gnotobiotic Growth System for Plant&#8211;Microbe Interaction Studies in Cereals

开发在田间条件下能够稳定发挥作用的微生物类农业改良剂，需要深入理解植物与微生物相互作用的分子机制。研究这些相互作用的内在机制，要求能够在环境可控且无菌（即与植物相互作用的所有微生物均为已知，无论是无菌状态、定义明确的微生物群落，还是天然群落）的条件下培养植物。目前可用的植物无菌培养系统并不适用于研究具有重要农业价值的大型植物，例如谷类作物。此外，大多数现有系统缺乏灌溉管理能力。本文介绍一种新型无菌培养系统GNOVA，该系统专为谷类作物设计，并具备灌溉管理功能。该新系统是一个易于获取的平台，由3D打印底座和市售材料组成。本实验方案提供了系统组装及实验设置的逐步操作指南。此外，我们还对GNOVA系统与传统的无菌袋系统进行了性能比较。在GNOVA系统中，小麦的植株生长期从袋系统中的两周延长至17周，玉米则从袋系统中的四周延长。两种作物在GNOVA系统中的发芽率也显著提高：小麦从66%提升至100%，玉米从75%提升至100%。在GNOVA系统中生长的小麦能够产生分蘖，而在相同生长期的袋系统植株中则未观察到分蘖现象。在GNOVA系统中生长的玉米鲜重比袋系统高出594%。此外，玉米的地上部分高度和根系长度在GNOVA系统中分别比袋系统高出89%和57%。GNOVA系统通过提供更大的生长空间和灌溉管理能力，扩展了科学家可用于研究谷类作物在苗期之后植物–微生物群相互作用的工具箱。

我们开发了GNOVA，一种新型的植物无菌体系，可提供研究植物–微生物互作所必需的无菌且可控的环境。该系统为地上部分提供了24.4英寸（62 cm）的垂直生长空间，并配备一个1.3 L的种植盆，可兼容多种土壤基质。系统完全组装后高度约为3英尺（92.4 cm），宽度为4.57英寸（11.6 cm）（图5A–C）。与其他系统相比，GNOVA具有最高的地上部分垂直生长空间，根室容积位居第二（补充表1）。GNOVA在培养室中仅需占用0.0135 m2的表面积，因此结构紧凑且便于操作。该系统适用于垂直净空为1.22 m的步入式培养室。除3D打印底座外，该系统所有组件均可高压灭菌，兼容尺寸为24英寸 × 24英寸 × 36英寸（宽 × 长 × 高；61 cm × 61 cm × 91 cm）的高压灭菌器，从而避免了对各个部件进行手动灭菌，简化了实验准备流程。此外，该系统的大多数组件可重复使用，在初始搭建成本为每套54美元的基础上，每次实验的使用成本约为6美元（补充表2）。我们通过连续三天监测系统内一株一周龄玉米植株周围的温度和相对湿度，测定了GNOVA内部的环境条件。结果显示，GNOVA内部的平均温度比培养室高1.3 °C（补充图1）。在光照周期中，系统与培养室之间的温差更大（平均高出2.5 °C），而在黑暗周期中温差较小（平均高出0.4 °C）。GNOVA内部的平均相对湿度为63%，而培养室内的相对湿度为34%。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig5.jpg" /> 
图5：GNOVA系统的示意图。&#160;（A）支撑底座最终设计的三维模型；（B）支撑底座三维模型的截面图；（C）完全组装后的GNOVA三维模型截面图&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为确保系统内的无菌状态，我们进行了为期四周的无植物试验，比较了非灌溉系统与灌溉系统。通过直接拭子涂布法对棉环上方和下方的玻璃圆筒表面取样，以确定是否存在污染。在非灌溉（n=4）和灌溉（n=6）条件下，棉环上方均未检测到超过三个菌落的微生物生长（即每三分之一取样表面积中不超过一个菌落）（补充图2A）。在棉环下方，仅在一个非灌溉重复样本中观察到微生物生长，而在灌溉系统中未检测到任何生长（补充图2B）。这表明玻璃圆筒带来的污染风险较低，因为仅在少数位于棉环下方的重复样本中发现微生物生长，而该区域并不与植物接触。通过将系列稀释液点样至R2A培养基平板上，评估了土壤污染情况（补充图2C）。在两种条件下均未检测到显著的微生物生长，仅有一个灌溉重复样本在系列稀释中出现无法计数的菌落形成单位（即 &#60; 30 个菌落）。除无菌性测试外，我们还比较了在GNOVA系统中与传统已知菌群（gnotobiotic）袋式培养体系（培养两周）19 中生长的小麦和玉米的生长表现。为探究较小尺寸和缺乏灌溉对植物生长表现的影响，我们将袋式系统的培养时间延长至与GNOVA系统相同。尽管两种系统在建立时所用的初始土壤含水量一致，但GNOVA系统每周接受一次营养液灌溉，而袋式系统则未进行灌溉。在所有比较中，我们均以袋式系统作为参照，因为这是本实验室最初采用的已知菌群培养体系。在GNOVA系统中，小麦和玉米的发芽率均达到100%，而在袋式系统中，小麦仅为67%（n = 3），玉米为75%（n = 8）（图6）。
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig6.jpg" /> 
图6：小麦（n = 3）和玉米（n = 8）在GNOVA（紫色）和袋系统（绿色）中的萌发情况。&#160;每个重复实验的萌发结果以y轴上的点表示，分为“未萌发”或“已萌发”，对应每种无菌体系。柱状图表示不同系统中各植物物种的萌发率（%）。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
还进行了小麦和玉米的生长试验，以确定在GNOVA系统中的最长可存活生长期以及植物生长表现。尽管我们的标准袋培养方案仅要求生长两周，但为了更好地比较两种系统，我们在袋中将生长期延长至超过两周。两周后，GNOVA系统中培养的小麦（n=3）已达到Zadock生长阶段（GS）13（图7A），而在袋系统中仍停留在GS11。到第五周时，GNOVA系统中的植株已进入GS21阶段，表现为分蘖的出现（图7B）。相比之下，袋系统中未见分蘖，植株仍处于GS13阶段。这种袋系统中的生长受阻以及缺乏物候期变化导致该系统中的植株在第六周时被终止培养。小麦在GNOVA系统中继续生长了额外五周，期间观察到叶片数量和生物量的增加（图7C）。尽管在GNOVA中生长12周后小麦生物量在视觉上有所增加，但植株也开始表现出更多黄化叶片，且玻璃圆筒内的空间已被植物生物量填满（图7D）。此后，小麦又继续生长了两周（图7E、F）。然而，生物量未见明显增加，因此在生长17周后终止了生长试验。玉米的生长也在GNOVA系统中进行了为期四周的评估，并与袋系统中培养的玉米进行了比较（图8A、B）。在本实验中，玉米种子在播种前进行了表面灭菌并预萌发。两种系统中玉米地上部和根部的鲜重存在显著差异（双样本t检验，p值 &#60; 0.05，补充表3）。在GNOVA系统中生长的玉米地上部和根部鲜重平均分别为11.2 g和5.7 g（图8C、D）。相比之下，袋系统中生长的玉米地上部和根部鲜重分别为1.29 g和1.15 g。总体而言，与袋系统相比，GNOVA系统中生长的玉米鲜重生物量提高了593%。此外，GNOVA系统中玉米地上部和根部长度分别比袋系统显著增加了89%和57%（图8E、F）。
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig7.jpg" /> 
图7GNOVA 原型中小麦的生长情况&#160;(A) 小麦在Zadock生长阶段（GS）13的两周龄。B) 袋中与GNOVA中生长五周后的小麦比较。GNOVA中的小麦（GS21）已产生分蘖，而袋中的小麦（GS13）未产生分蘖。C) 小麦生长10周后生物量的增加。D) 小麦生长13周后生物量增加，并出现叶片黄化现象。E) 小麦在生长15周时生物量进一步增加。F) 小麦生物量在生长17周时占据了大部分可用生长空间。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70607/70607fig8.jpg" /> 
图8：GNOVA（紫色）原型系统与袋式系统（绿色）中玉米的生长情况对比。&#160;条形图表示平均值 &#177; 标准误（n=4）（A在GNOVA和袋系统中生长四周的玉米。BGNOVA系统与袋装系统中培育的收获植株大小比较。C) 新鲜茎重（平均值&#177;SE）。D) 新鲜根重（平均值&#177;SE）。E) 茎长（平均值&#177;SE）。F）根长（平均值&#177;SE&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/70607fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充图1：GNOVA内（紫色）和生长室（橙色）测得的相对湿度与温度的时间动态变化。 数据以五分钟间隔记录，持续三天。GNOVA内的数据由一株七周大的玉米植株存在时记录。浅蓝色阴影区域对应夜间时段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Figure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：对未种植植物且无灌溉（对照）和有灌溉（灌溉）的GNOVA进行无菌测试后所得的微生物生长情况。 （A）棉环上方玻璃圆筒样品。（B）棉环下方玻璃圆筒样品。（C）土壤样品的单平板连续稀释涂布。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Figure2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：GNOVA 与其他现有植物无菌体系（EcoFAB、magenta 盒、袋子、FlowPot、GnotoPot 和 EcoFAB 3.0）的功能比较。 本表从实验设计相关的关键参数（如植物高度容纳能力、根系体积容纳能力及灌溉控制）对各系统进行了比较。信息来源于已发表文献和可获取的系统描述；若数据未明确报道，则标注为估算值。† 文献中未明确说明时的最佳估算；‡ 系统无需拆卸或移至超净工作台即可完成操作；* 经系统改造后可实现；成本类别定义为：低（&lt; 30 美元/单位）、中（30–100 美元/单位）、高（&gt; 100 美元/单位）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Table1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表2：单个GNOVA装置组装与运行的物料清单（BOM）及预估成本。 材料分为可重复使用部件和一次性使用组件，列出了相应的单价、每个系统所需数量及每个系统的总成本。可重复使用部件构成初始设置成本，一次性使用材料则代表每次实验的耗材成本。* 根据批量采购协议价格计算得出，以实现成本效益；** 所需用量因实验时长、所用土壤基质及研究目标而异；† 以使用黏土与沙混合基质、每周灌溉一次、持续四周的实验为例估算；‡ 未包含营养液和土壤基质的价格，因其将根据实验目标的不同而变化<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表3： 在GNOVA和袋子系统中种植的玉米生长测量变量的双样本t检验所得p值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70607/Supplemental_Table3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种新型植物无菌培养系统的组装与使用方法，该系统专为禾本科作物设计，并已在小麦和玉米中得到验证。该植物无菌培养系统通过提供无菌生长环境、灌溉管理以及与多种土壤基质的兼容性，实现了对植物-微生物互作实验的精确控制。

基于微生物的农业改良剂若要在田间稳定发挥作用，其研发需要深入了解……的分子机制

本研究探讨微生物如何定植于植物根部，并影响植物对胁迫的抗性。该实验方案可用于研究多种植物物种中的植物-微生物互作关系，其应用范围远超传统的小型模式植物。首先，取准备好的实验用花盆，移除其上的塑料盖。向花盆中加入 378 毫升的半浓度 Murashige 和 Skoog 培养基。对于黏土和沙质基质，分别加入 360 毫升和 350 毫升，以达到 70% 的孔隙含水量。使用无菌镊子将灭菌后的种子播种至适当深度：小麦播种深度为 0.5 英寸，玉米为 1 英寸。将塑料盖重新盖回花盆上方，然后将花盆从超净工作台中取出。或者，可将无菌的预萌发幼苗直接播种至 GNOVA 中。将花盆和玻璃圆筒转移至生长室后，手持玻璃圆筒，使其底部朝下靠近花盆，同时握住灭菌包裹材料和塑料盖。迅速一次性取下花盆上的塑料盖以及玻璃圆筒上的灭菌包裹材料。将玻璃圆筒向下放置，套在花盆上方，并使其底部紧贴 3D 打印底座的凸缘处。小麦培养条件为：白天 22 摄氏度，夜间 16 摄氏度，荧光灯下 12 小时光照周期。玉米培养条件为：白天 27 摄氏度，夜间 23 摄氏度，其他条件相同。将一段长的硅胶管连接到瓶顶分液器上。将火焰置于灌注管路附近。从灌注管路和滤器支架上取下注射器筒。保持所有管路末端处于火焰区域中。将滤器支架连接至灌注管路。连接两个注射器筒。然后，将连接在瓶顶分液器上的长段硅胶管接到滤器支架的底部接口。分装150毫升半浓度的Murashige和Skoog培养基。分离两个注射器筒。将硅胶管从滤器支架上拆下，并将滤器支架从灌注管路断开。用一个注射器筒替换之。在包含超过 50 个样本的大规模实验中，采用 10% 次氯酸钠溶液灌溉策略，以提高浇水通量。将 10% 体积比的次氯酸钠溶液分别加入两个小型塑料烧杯中。将烧杯放置在灌溉管线附近，并从灌溉管线取下注射器筒。将管路末端浸入 10% 次氯酸钠溶液中，直至后续使用。从滤器支架上取下注射器筒。将所有管路末端浸入 10% 次氯酸钠溶液中，直至后续使用。轻轻甩去多余的次氯酸钠溶液。将滤器支架连接至花盆的灌溉管线。将连接在瓶顶分液器上的长段管路连接至滤器支架的底部接口。加入 150 毫升半浓度的 Murashige 和 Skoog 培养基。从滤器支架的底部接口断开硅胶长管。在去除多余次氯酸钠溶液后，用注射器筒替换灌溉管线中的滤器。若灌溉体积发生变化，使用约 20 毫升培养基对管路进行预冲洗。根据具体的研究目标和待处理样本的数量调整收获方案。将玻璃圆筒从培养盆中取出。迅速将培养盆放入超净工作台，并从3D打印的底座上取下。握住植株基部，将土壤基质倒入容器中。轻轻去除根部的大块土壤。如有需要，根据具体研究目标采集土壤样品。使用无菌剪刀将地上部分与根部分离。记录地上部分鲜重。将根部在含有去离子水的烧杯中轻轻振荡以清洗。用吸水纸吸干根部。记录根部鲜重，如有需要，根据具体研究目标采集根部样品。在GNOVA系统中，小麦和玉米的发芽率均达到100%，而在袋式系统中，两周时小麦的发芽率为67%，玉米为75%。在GNOVA系统中生长的小麦达到Zadok's生长阶段13，而在袋式系统中生长的小麦仍处于Zadok's生长阶段11。第5周时，GNOVA系统中的小麦达到Zadok's生长阶段21，表现为分蘖出现，而袋式系统中未见分蘖，植株仍处于Zadok's生长阶段13。在GNOVA系统中生长12周后，小麦植株出现更多黄化叶片，且玻璃圆筒内充满植物生物量。当小麦在GNOVA系统中继续生长额外两周时，生物量未见明显增加。玉米在GNOVA系统中的生长情况观察了四周，并与袋式系统中生长的玉米进行比较。在GNOVA系统中培养的玉米鲜重生物量较袋式系统增加了593%。在GNOVA系统中生长的玉米，其地上部分和根系长度均显著大于袋式系统中生长的玉米。本方案可使研究人员在受控条件下研究植物与微生物的相互作用，并建立微生物效应因子与植物响应之间的因果关系。该方案最具挑战性的环节在于对供水管线的谨慎操作，以维持无菌状态。未来的研究可将此系统与合成微生物群落相结合，以鉴定促进植物生长的效应因子，并探究微生物群落组装的机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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本文描述了两种用于评估化合物对人精子Ca2+信号传导和顶体反应影响的中通量检测方法。这些方法可用于快速、简便地筛选大量化合物对人精子Ca2+信号传导和顶体反应的影响。...

中等通量筛选实验用于评估对人精子Ca2+信号传导和顶体反应的影响

本方案通过海藻酸盐的快速物理凝胶化来包封细胞，从而实现细胞的固定化。所获得的微珠能够随时间可控且持续地分泌β-淀粉样蛋白，可用于研究分泌型β-淀粉样蛋白在体外和体内模型中的作用。...

用于阿尔茨海默病建模的β-淀粉样蛋白分泌海藻酸盐微珠的制备

本方案用于通过在卵鞘（卵荚）孵化前进行表面灭菌，以建立和维持无特定病原体的美洲大蠊（Periplaneta...

无菌美洲大蠊（Periplaneta americana）的建立与维持

本文介绍一种利用荧光标记蛋白结合基于BiFC的FRET-FLIM检测技术，可视化三种蛋白质伙伴之间三元复合物形成的方法。该方法对于研究蛋白质-蛋白质相互作用复合物具有重要价值。 体内.

通过BiFC-FRET-FLIM检测法测定MADS-box转录因子两个单体与钙感受蛋白之间的三元相互作用

学习组装GNOVA无菌培养系统用于禾本科植物与微生物互作研究。该系统支持小麦和玉米长期生长，实现灌溉管理，发芽率达100%，显著促进植株发育，为农业微生物研究提供可靠平台。

用于禾本科植物-微生物互作研究的植物无菌培养系统组装与使用

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