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本研究获得了加拿大卫生研究院（CIHR）研究卓越、多样性与独立性早期职业转型奖 202305ED8-509143-244657（授予 F.B.K.）以及美国国立卫生研究院癌症研究所 R35 CA242447-01A1（授予 V.M.W.）的资助。K.J. 是达蒙·鲁尼恩癌症研究基金会（Damon Runyon Cancer Research Foundation）洛伊丝·A·奇内利研究员（DRG-2547-25）。

1. 基于PA的ECM水凝胶的制备
<ol>
	<li>用于PA凝胶粘附的玻璃表面功能化 
	注意：所有步骤均需在室温下于旋转摇床中进行。每步之间用高质量水充分冲洗。
	<ol>
		<li>使用10%次氯酸钠溶液在耐化学腐蚀的容器（例如聚苯乙烯容器）中清洗玻璃表面3小时。使用足够体积的溶液完全覆盖玻璃，确保无气泡滞留或干燥区域。 
		警告：次氯酸钠具有强腐蚀性和高反应性。请遵循制造商的安全说明。</li>
		<li>将盖玻片在0.2 M盐酸（HCl）中孵育16小时，同时在摇床上轻柔振荡。 
		警告：HCl具有强腐蚀性，可导致皮肤灼伤。请穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>加入0.1 M氢氧化钠（NaOH），孵育1小时。 
		警告：NaOH溶液具有腐蚀性，可导致皮肤灼伤。请穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>将盖玻片在含有0.5% APTES的高质量水中孵育30分钟。 
		警告：APTES有毒。操作APTES时应在通风橱内并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>用大量水冲洗盖玻片，以去除残留的APTES。 
		注意：冲洗不彻底会导致APTES与下一步中的戊二醛发生反应，产生白色沉淀物，从而影响玻璃表面的活化效果。</li>
		<li>将盖玻片在含0.5%戊二醛的PBS溶液中孵育1小时。 
		警告：戊二醛有毒。操作戊二醛时应在通风橱内并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>将盖玻片置于吸水材料（例如纸巾）上过夜干燥。将盖玻片储存于洁净、密封的容器中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PA水凝胶溶液的制备与凝胶浇铸 
	注意：获得指定弹性模量水凝胶所需的配方见表1。不同实验应用推荐的凝胶体积和玻璃尺寸见表3。
	<ol>
		<li>在1.7 mL微量离心管中混合PA水凝胶组分，但不包括过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）。 
		注意：不要配制大量溶液，因为较高刚度的凝胶会快速聚合，可能在浇铸完成前即已硬化。</li>
		<li>将PA凝胶混合物、APS和TEMED的离心管置于25 mmHg真空环境中脱气30分钟。</li>
		<li>通过棉签在洁净的盖玻片上涂覆疏水涂层，制备疏水性上层盖玻片。确保盖玻片无污迹，以维持凝胶聚合的一致性。</li>
		<li>向脱气后的溶液中加入APS和TEMED，然后轻轻吹打混合，将混合物滴加至已活化的盖玻片上。</li>
		<li>将疏水性盖玻片覆盖于溶液上方，形成均匀的薄层水凝胶。在室温下让凝胶聚合35分钟。确保盖玻片间无气泡滞留，且溶液不溢出边缘。 
		注意：请遵循推荐的凝胶浇铸体积以确保合适的厚度；过薄的凝胶会使细胞感知到底层玻璃15。在拆卸凝胶夹心结构前，检查微量离心管中残留的混合物以确认是否已完成聚合。</li>
		<li>将水凝胶夹心结构浸入PBS中以分离各层。确保水凝胶仍附着于已活化的底层盖玻片，而疏水性上层盖玻片可轻松脱离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>水凝胶与ECM配体的功能化修饰 
	注意：本节所有步骤均需在生物安全柜内无菌条件下进行。
	<ol>
		<li>将水凝胶浸入70%乙醇中进行灭菌，随后转移至含有无菌PBS的组织培养塑料器皿中。 
		注意：不要将水凝胶长时间留在乙醇中，否则会导致凝胶脱水，影响ECM的偶联效果。</li>
		<li>配制功能化主混合液，包含水、乙醇、HEPES和双丙烯酰胺（表4）。 
		警告：双丙烯酰胺在吸入或摄入时具有毒性。</li>
		<li>配制紫外光引发剂和四丙烯酸酯的稀释溶液。两种试剂均溶于乙醇（表4）。 
		注意：每次均需进行四丙烯酸酯的系列稀释，过量可能导致过度聚合并形成可见的黑色表面沉积物（见图3A）。</li>
		<li>使用分析天平称取所需量的NHS-丙烯酸酯。在使用前立即用50%乙醇/50%水重悬NHS-丙烯酸酯。 
		注意：NHS-丙烯酸酯过量将导致可见的黑色表面沉积物形成，并可能导致ECM包被不均（图3B）。</li>
		<li>将紫外光引发剂、四丙烯酸酯和NHS-丙烯酸酯溶液加入步骤1.3.2中配制的功能化主混合液中。吸除PBS后，将主混合液加入凝胶中，确保完全覆盖凝胶表面。</li>
		<li>将水凝胶（不加盖组织培养皿盖）暴露于紫外光下照射400秒（紫外光源波长小于365 nm）。 
		警告：使用紫外光时请佩戴适当的眼部防护装备。</li>
		<li>取出凝胶并置于冰上。吸除功能化溶液后，用预冷的无菌25 mM HEPES（pH 6.0）洗涤三次，随后用预冷的无菌0.9% NaCl洗涤三次。</li>
		<li>在预冷的无菌100 mM HEPES（pH 8.0）缓冲液中加入100 mM NaCl，并加入所选的ECM配体，在4 °C下于旋转摇床上过夜孵育。 
		注意：ECM配体浓度可由使用者自行选择；但关键在于，同一批次中不同刚度基底上的配体浓度必须保持一致。</li>
		<li>16小时后小心吸除ECM配体溶液。用PBS洗涤水凝胶三次&#160;，然后加入无血清基础培养基（或PBS）以保持水合状态。将凝胶在组织培养孵箱中孵育过夜，以在接种细胞前验证无菌性。 
		注意：若存在污染，基础培养基在37 °C孵育过夜后将呈现浑浊状态。</li>
		<li>立即用于细胞接种，或在基础培养基中于4 °C保存，保存时间不超过3周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 生成机械性能可调的硅胶基细胞外基质基底
<ol>
	<li>用于硅胶涂层的玻璃盖玻片制备
	<ol>
		<li>用 3 M NaOH 清洗玻璃盖玻片 20 分钟。</li>
		<li>用高质量水彻底清洗五次，最后抽去水分。让其自然风干，并用氮气气流吹除任何残留液滴或碎屑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>硅胶的制备
	<ol>
		<li>使用分析天平，按照 表 2 中规定的质量比称取双组分硅橡胶的组分 A 和组分 B。使用剪切过的移液器吸头吸取粘稠溶液。</li>
		<li>使用移液器吸头充分混合组分 A 和组分 B，确保完全融合。</li>
		<li>将混合物置于 25 mmHg 真空环境中脱气 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在玻璃盖玻片上浇铸凝胶
	<ol>
		<li>将盖玻片放置在旋涂仪上的橡胶垫上，确保其居中。 
		注意：橡胶垫可确保良好的真空密封。若密封不充分，盖玻片可能移位并破裂。居中不当可能导致涂层不均匀。</li>
		<li>启动真空以固定盖玻片。</li>
		<li>在盖玻片中心加入 100 µL 凝胶混合物。以 500 rpm 旋涂 10 秒，随后以 8,000 rpm 旋涂 60 秒。</li>
		<li>将涂覆后的盖玻片在 80 °C 下烘烤 2 小时。冷却至室温。 
		注意：可在室温下储存最多一个月后再使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 ECM 配体对硅胶进行功能化修饰
	<ol>
		<li>将涂有硅胶的盖玻片在 11 W 功率下暴露于氧气等离子体中 5 分钟。 
		注意：过长时间或过高功率的氧气等离子体处理可能导致凝胶开裂。最佳功率与时间组合可能需根据所用设备进行测试。</li>
		<li>配制含有 95% 乙醇、0.5% APTES 和 4.5% dH2O 的硅烷化溶液。 
		注意：后续所有步骤均需在生物安全柜内的无菌条件下进行。 
		警告：APTES 具有毒性。操作 APTES 时应在通风橱中并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>将涂有凝胶的盖玻片与硅烷化溶液孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 PBS 彻底清洗五次。</li>
		<li>配制含有 100 µg/mL EDC 和所需浓度 PBS 中 ECM 的溶液。 
		注意：EDC 在溶液中不稳定且对湿气敏感。使用前需新鲜配制，并密封保存于阴凉干燥处，避免湿气和直射阳光。 
		警告：EDC 吞咽有害，吸入有毒。应佩戴适当的个人防护装备并在通风橱中操作。</li>
		<li>将盖玻片与 ECM 溶液在 37 °C 下孵育 1 小时，或在 4 °C 下过夜。</li>
		<li>用 PBS 清洗盖玻片五次。用基础培养基冲洗后接种细胞。 
		注意：最佳细胞密度取决于特定细胞系和实验目的（例如，亚融合状态用于形态学研究，单层状态用于细胞间黏附研究）。例如，成纤维细胞常用密度为 0.1 x 106 细胞/cm2，可在 48 小时内达到约 50% 融合度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 免疫染色和成像用细胞外基质底物的制备
<ol>
	<li>基于聚丙烯酰胺（PA）基底的免疫染色与成像 
	注意：18毫米的PA水凝胶通常可提供足够的可成像区域用于定量分析。对于成像应用，应在由15 mL离心管制备的“橙色腔室”中浇铸水凝胶并进行免疫染色。只要结构完整，橙色腔室可重复用于多轮凝胶浇铸和染色。
	<ol>
		<li>使用外径18 mm、内孔14 mm的打孔器从聚碳酸酯膜和硅橡胶膜上打孔，制备垫片和密封圈。</li>
		<li>用剪刀在15 mL离心管盖中心剪出一个开口，以创建用于凝胶浇铸和染色的腔室。</li>
		<li>在14 mL刻度处锯断离心管。用手术刀修整不平整的边缘，并锉平管盖边缘，确保其能适配标准的12孔板。</li>
		<li>组装水凝胶-盖玻片夹层结构（如第1节所述），将垫片环放置在活化的盖玻片上。</li>
		<li>待凝胶完全聚合后，拆开夹层结构。</li>
		<li>将18 mm水凝胶灭菌，并转移至含无菌PBS的12孔组织培养板中。</li>
		<li>按照第&#160;1节所述方法进行细胞外基质（ECM）配体功能化。</li>
		<li>接种细胞并用4%甲醛固定。 
		注意：避免使用基于酒精的固定剂，因其会使凝胶脱水并破坏其结构完整性。 
		警告：甲醛具有毒性，必须始终在通风橱内操作。</li>
		<li>（可选）将样品重新组装到离心管盖腔室上。使用硅胶密封圈密封腔室。 
		注意：染色前需用PBS进行数小时的渗漏测试。尽管此方法看似更繁琐，但有助于实现均匀染色并减少抗体消耗。</li>
		<li>根据用户偏好的实验方案进行免疫荧光染色。</li>
		<li>染色后，将样品保存在含50%甘油的PBS中。应尽快成像。 
		注意：避免使用会硬化的常规封片剂，因其可能随时间推移导致水凝胶开裂并损坏样品。荧光强度会随时间减弱；为获得最佳信号质量，建议在一周内完成成像。</li>
		<li>在组织培养皿的玻璃底表面滴加少量PBS（或封片剂）。小心地将染色后的水凝胶倒置覆盖在液滴上，使细胞面向盖玻片，随后进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于硅胶的细胞外基质（ECM）基底的免疫染色与成像
	<ol>
		<li>使用4%甲醛固定样品，并在玻璃底培养皿上直接按照标准免疫荧光方案进行染色。避免使用基于酒精的固定剂，因其会导致ECM基底开裂。</li>
		<li>使用传统荧光显微镜直接对样品进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从接种于细胞外基质基底的细胞中收获蛋白质和RNA
<ol>
	<li>用镊子小心地将凝胶从培养皿中取出，并浸入无菌 PBS 中，以冲洗掉残留的培养基和血清。 
	注意：请轻柔操作盖玻片，因其极为脆弱，容易破裂。</li>
	<li>用低绒擦拭纸轻轻蘸去水凝胶边缘多余的 PBS。</li>
	<li>向组织培养皿的盖子中加入适量的 RNA 提取缓冲液。 
	注意：基于苯酚-胍的试剂适用于从 PA 凝胶中提取 RNA。可根据实验需求使用蛋白裂解缓冲液。在裂解缓冲液孵育后，通过显微镜观察样品，以确保细胞完全破裂。</li>
	<li>将盖玻片（凝胶面朝下）放入裂解液中。轻轻提起并放下水凝胶数次，以确保所有细胞均匀裂解。</li>
	<li>轻轻刮擦凝胶表面，以释放裂解物。 
	&#8203;注意：请勿使用市售的塑料细胞刮刀，因为其坚硬的塑料可能会损坏柔软的水凝胶，并导致凝胶碎片污染裂解物。制作间隔片所用的软质塑料（见步骤 3.1.1）适用于此目的，可重新利用以制作定制刮刀。</li>
	<li>将 RNA 或蛋白裂解物储存于 -80 °C，待后续使用常规生化方法处理，或立即使用。</li>
</ol>
5. 单层球状体培养物的制备
<ol>
	<li>在18 mm盖玻片上制备75 Pa的PA水凝胶，并用基底膜提取物（BME）或其他合适的细胞外基质（ECM）配体对表面进行功能化处理，以促进细胞黏附。</li>
	<li>将细胞以所需密度接种到ECM包被的水凝胶或硅胶上。</li>
	<li>2小时后，轻轻去除未贴壁的细胞，并在预冷的基础培养基中加入稀释的BME覆盖层。 
	注意：BME在温度升高时会发生聚合。移液前应预先冷却枪头。所添加BME的百分比取决于所需三维支架的机械完整性和稳定性。</li>
	<li>将培养物置于37 °C的组织培养箱中孵育1.5小时，以使BME完成聚合。</li>
	<li>轻柔地加入细胞培养基，完全覆盖三维凝胶。</li>
	<li>在标准条件下维持培养。细胞将随时间推移持续生长并自组装形成三维球状体，直至达到预期的实验终点。</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述的细胞外基质（ECM）制备方案提供了一种可重复、可扩展且成本效益高的工作流程，可轻松在大多数实验室中实施。尽管传统的玻璃和塑料培养器皿使用方便，并能实现快速数据采集，但这些合成基底无法模拟生理相关的组织硬度。其他可机械调节的替代基底，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）或甲基丙烯酰化明胶（GelMA），虽然更易于制备，但通常难以达到亚千帕（sub-kilopascal）范围的硬度值，限制了其在脑、肺等软组织建模中的适用性19,20。相比之下，PA水凝胶和硅胶基底能够提供覆盖广泛组织力学特性的硬度范围，支持简便的配体偶联，同时与多种基于细胞的检测方法兼容。此外，该方法比目前昂贵但便捷的Sulfo-SANPAH方法更具成本优势。
尽管这些模拟细胞外基质（ECM）的支架能够精确调控ECM刚度，但仍存在若干重要局限性。首先，基于肽自组装（PA）和硅胶的基底均不可降解，无法重现动态的ECM重塑过程 体内 由于细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用高度依赖于...

细胞外基质（ECM）是一种基本的结构和生化支架，决定了组织的力学特性并支持其生物学功能。例如，肺和动脉等弹性组织富含以胶原蛋白和弹性蛋白为基础的ECM，为呼吸过程中反复的伸展-回缩循环提供了所需的机械弹性。相比之下，中枢神经系统含有富含糖胺聚糖的ECM，形成高度顺应性的微环境，有利于神经元的分化与信号传导1。在机体不同组织中，组织刚度跨越多个数量级，从脑和肺等软组织的数百帕斯卡，到肌腱和骨组织分别达到兆帕和吉帕级别的刚度2,3。这些力学差异不仅具有结构性意义，还在调控细胞行为方面发挥关键作用4,5。例如，间充质干细胞会根据基质刚度决定其谱系分化：在柔软基质上倾向于向神经元样细胞分化，在中等刚度基质上向肌源性细胞分化，而在刚硬基质上则向成骨细胞分化6。ECM刚度的病理性改变也可引发异常的细胞反应，促进疾病的发生与发展7,8,9。同样，细胞周围ECM特性的变化也会改变细胞器功能及多种细胞行为10,11。尽管ECM在调控信号传导、细胞器功能和疾病发病机制中的重要性已被广泛认识，但细胞感知并将ECM信号转化为生化信号的具体机制仍尚未完全阐明。
由于目前缺乏能够精确调控细胞外基质（ECM）特性，同时又与常规生化检测和成像工作流程完全兼容的实验平台，人们对细胞-ECM相互作用机制的理解进展在一定程度上受到限制。此外，研究细胞-ECM相互作用通常被认为在技术上具有挑战性，因为它需要涵盖材料科学、细胞生物学和生物工程学等多学科的专业知识。本方法旨在解决这些难题，提供逐步操作方案，用于在大多数湿实验环境中便捷地制备具有明确力学特性的聚丙烯酰胺（PA）和硅胶基细胞外基质基底。
具有可调刚度的聚丙烯酰胺（PA）凝胶是力学生物学研究中的常用材料；然而，其应用常受到细胞外基质（ECM）偶联试剂成本高昂、表面功能化不一致以及与大规模生化实验流程兼容性差等因素的限制。此外，目前尚缺乏针对不同刚度基底的样本收获与成像的实用且标准化的操作方法。上述瓶颈可通过本文所述的PA凝胶平台得以解决，该平台具有四项关键技术改进：（i）显著降低成本，（ii）可重复的功能化化学反应，（iii）通过可重复使用的硬件实现规模化生产，以及（iv）与多种常规细胞生物学和生化检测方法无缝整合。该方法通过调节丙烯酰胺与双丙烯酰胺的不同比例，制备出具有不同力学特性的水凝胶 （表1）。PA凝胶本身呈惰性，无法直接与ECM蛋白偶联。因此，采用紫外光引发的自由基聚合反应，在PA凝胶表面接合一层由四丙烯酸四（三羟甲基丙烷）酯、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-丙烯酸酯）和双丙烯酰胺组成的交联网络 （图1）。该网络为ECM蛋白提供了双重作用的粘附表面：其中NHS-丙烯酸酯可实现ECM蛋白的稳定共价锚定，而四丙烯酸酯则促进ECM蛋白的均匀吸附12。此外，我们还提供了从这些基底中收获蛋白质和核酸（如RNA）的方法，所得样品可兼容后续细胞生物学分析，如蛋白质印迹（western blotting）和逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）。进一步地，所制备的柔性PA基底还支持类球体（spheroid）的形成，并使其位于一致的焦平面内，从而实现对三维细胞行为的系统性分析13。
相比之下，PA水凝胶的光学局限性限制了其在先进成像模式中的应用，特别是全内反射荧光（TIRF）显微镜14。为解决这一限制，我们开发了机械性能可调的硅胶基细胞外基质（ECM）基底，专为TIRF成像优化。这些材料具有与玻璃高度匹配的折射率，同时可在较宽范围内调节其刚度(图2A)。在进行ECM偶联之前，将不同组分比例的薄层硅胶通过旋涂法涂覆于盖玻片上(图2B&#160;和表2)。然而，硅胶固有的疏水性和化学惰性阻碍了ECM的直接偶联。因此，我们采用表面修饰策略以实现ECM配体的共价连接。氧气等离子体处理在硅胶表面引入羟基(图2C)。随后，(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）将这些羟基转化为反应性氨基。1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）作为一种零长度碳二亚胺交联剂，可促进凝胶表面的氨基与ECM蛋白上的羧基之间形成共价酰胺键。
总体而言，这些细胞外基质（ECM）平台为研究ECM刚度依赖性信号机制提供了经济高效、可重复且可扩展的系统。其灵活性允许与生物化学检测、高分辨率成像以及高通量工作流程无缝整合，从而能够探究ECM刚度如何影响细胞行为并驱动疾病进展。

<table><tbody><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES)</td><td>919-30-2</td><td>-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>-</td><td>LMCT1.7B</td><td>FroggaBio</td></tr><tr><td>12孔细胞培养处理板</td><td>-</td><td>83.3921</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>15 mL 离心管（用于橙色腔室）</td><td>-</td><td>CLS430790</td><td>Corning</td></tr><tr><td>2-羟基-4&amp;prime;-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮（Irgacure）</td><td>106797-53-9</td><td>-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺溶液</td><td>110-26-9</td><td>-</td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>3-(3-二甲基氨基丙基)-1-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）</td><td>25952-53-8</td><td>-</td><td>Chem Impex International</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐</td><td>28718-90-3</td><td>-</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>-</td><td>D1306</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺溶液</td><td>01/06/1979</td><td>-</td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>50% 戊二醛</td><td>111-30-8</td><td>-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>6 cm 细胞培养处理培养皿</td><td>-</td><td>83.3901</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>A549 细胞</td><td>-</td><td>CCL-185</td><td>ATCC</td></tr><tr><td>丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯</td><td>38862-24-7</td><td>-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔抗体</td><td>-</td><td>A11008</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 NHS 酯（三（三乙基铵盐））</td><td>-</td><td>A37572</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>7727-54-0</td><td>-</td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>透明抗冲击聚碳酸酯薄膜（0.005 英寸；间隔层）</td><td>-</td><td>85585K72</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>CY 52-276 硅胶，组分 A 和 B</td><td>2624028</td><td>-</td><td>Dow</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>-</td><td>11995-065</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>64-17-5</td><td>-</td><td>Greenfield Canada</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>-</td><td>4385612</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>-</td><td>A52567-01</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>-</td><td>356008</td><td>Corning</td></tr><tr><td>甲醛（16%）</td><td>-</td><td>28908</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>7365-45-9</td><td>-</td><td>BioShop</td></tr><tr><td>高温硅橡胶片（0.020 英寸；垫圈）</td><td>-</td><td>86435K452</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>7647-01-0</td><td>-</td><td>BioShop</td></tr><tr><td>大型空心打孔工具组</td><td>-</td><td>66000</td><td>Mayhew Pro</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>-</td><td>356234</td><td>Corning</td></tr><tr><td>培养基储存用硼硅酸盐玻璃瓶，250 mL</td><td>-</td><td>CLS1395250</td><td>Corning</td></tr><tr><td>培养基储存用硼硅酸盐玻璃瓶，500 mL</td><td>-</td><td>CLS1395500</td><td>Corning</td></tr><tr><td>MicroAmp 快速光学 96 孔反应板</td><td>-</td><td>4346906</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>显微镜载玻片盖玻片，18 mm 直径</td><td>-</td><td>72222-01</td><td>Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>显微镜载玻片盖玻片，50 mm 直径</td><td>-</td><td>1.84E+16</td><td>eBay</td></tr><tr><td>PBS（1&amp;times;）</td><td>-</td><td>14190144</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PBS（10&amp;times;）</td><td>-</td><td>70011044</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>17466-45-4</td><td>-</td><td>Biotium</td></tr><tr><td>磷酸化 FAK（Tyr397）抗体</td><td>-</td><td>85567</td><td>Cell Signaling Technology</td></tr><tr><td>磷酸化 MLC（Ser19）抗体</td><td>-</td><td>3671</td><td>Cell Signaling Technology</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>-</td><td>PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td></tr><tr><td>qPCR 引物（正向和反向）</td><td>-</td><td>N/A</td><td>Integrated DNA Technologies</td></tr><tr><td>qScript cDNA 合成试剂盒</td><td>-</td><td>95047</td><td>QuantaBio</td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>-</td><td>-</td><td>Rain-X</td></tr><tr><td>螺口管，锥底，15 mL</td><td>-</td><td>62.554.101</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>螺口管，锥底，50 mL</td><td>-</td><td>62.547.205</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>血清移液管，10 mL</td><td>-</td><td>170356N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>血清移液管，25 mL</td><td>-</td><td>170357N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>血清移液管，5 mL</td><td>-</td><td>170355N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>血清移液管，50 mL</td><td>-</td><td>170358N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>1310-73-2</td><td>-</td><td>BioShop</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby 蛋白凝胶染色剂</td><td>-</td><td>S12000</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>110-18-9</td><td>-</td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>-</td><td>15596026</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>紫外光腔室</td><td>-</td><td>165-5031</td><td>Bio-Rad</td></tr></tbody></table>

用于细胞生物学研究的具有确定刚度的聚丙烯酰胺和硅胶细胞外基质基底的制备

Generation of Polyacrylamide and Silicone Extracellular Matrix Substrates with Defined Stiffness for Cell Biology Applications

细胞外基质（ECM）是调控细胞行为的关键因素，其中ECM的刚度作为一种重要的力学信号，调控着细胞的信号转导、形态及命运。然而，对刚度依赖性细胞反应的实验研究常常受限于缺乏可重复、成本低廉且易于获取、同时具备精确可调力学性能的培养平台。本实验方案描述了基于聚丙烯酰胺（PA）和硅胶的制备方法，用于构建刚度可调的ECM基底。该流程详细说明了基底制备、表面功能化以及ECM蛋白偶联步骤，以确保在生理相关刚度范围内实现稳定的细胞黏附。基于PA的基底适用于后续多种生化检测，包括蛋白质和RNA提取，以及高分辨率荧光成像。基于硅胶的基底则优化用于全内反射荧光（TIRF）显微镜，可实现对细胞-ECM在基底膜界面相互作用的可视化观察。此外，柔软基底还可改造用于支持类球体培养，并将其固定在一致的成像平面上，便于实现稳定的图像采集。这些方法提供了可靠、经济且可重复的实验平台，可用于系统性探究ECM刚度如何调控细胞过程，从而推动在生理和疾病背景下对细胞-ECM相互作用机制的深入理解。

使用表1中的配方制备的PA凝胶硬度通过流变仪进行了实验测定。选取了名义硬度分别为0.4 kPa、6 kPa和60 kPa、跨越三个数量级的凝胶。实测硬度值分别为：400 Pa凝胶为363 ± 76 Pa，6 kPa凝胶为6.41 ± 0.50 kPa，60 kPa凝胶为36 ± 8 kPa（图4A）。为评估细胞外基质（ECM）在PA凝胶上的均匀附着情况，将荧光标记的纤连蛋白共价连接至凝胶表面。每种凝胶随机选取五个视野进行成像，并量化平均荧光强度。与未标记纤连蛋白包被的凝胶相比，荧光标记纤连蛋白包被的0.4 kPa和6 kPa凝胶显示出更高的荧光强度。每种凝胶五个不同区域的荧光强度一致，表明表面共价连接均匀（图4B）。
为评估细胞对基质刚度的响应，将 A549 肺腺癌细胞培养在纤维连接蛋白包被的聚丙烯酰胺（PA）凝胶上，其刚度范围从 0.4 kPa（正常）到 13.8 kPa（病理状态）。这些数值分别代表健康的肺组织和病理性纤维化肺组织的刚度特征1...

尽管细胞外基质（ECM）硬度是调控细胞行为的关键因素，但其潜在的感知与信号转导机制仍不明确。为解决这一问题，我们提供了可调节硬度的聚丙烯酰胺和硅胶基底的制备方案，以促进对细胞-ECM相互作用机制的理解。

细胞外基质（ECM）是细胞行为的关键调控因子，其中ECM刚度作为一种重要的力学信号，调控着细胞的多种生物学行为。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生成具有明确刚度的聚丙烯酰胺和硅基胞外基质底物，用于细胞生物学应用

基底硬度对细胞功能的影响可被模拟 体外...

利用基于丙烯酰胺的水凝胶研究基质刚度对细胞功能的影响

我们介绍一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基-PAAm，可实现细胞外基质蛋白的直接结合，且成本低廉、操作简便。将羟基-PAAm水凝胶与微接触印刷技术结合，可独立调控天然细胞微环境中的多种信号，从而用于研究细胞力学转导。...

用于解耦机械转导信号影响的羟基-PAAm水凝胶的制备

本实验室开发了DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶，这是一种动态水凝胶系统，旨在更深入地理解调控组织刚度对细胞功能的影响。本文提供了制备此类水凝胶的示意图、说明及操作方案。...

DNA交联聚丙烯酰胺凝胶的制备

本文介绍了一种可在多孔板中快速、高效且低成本制备聚丙烯酰胺凝胶的方法。该方法无需任何专用设备，任何研究实验室均可轻松采用。该方法在致力于研究刚度依赖性细胞反应的研究中尤为有用。...

基于聚丙烯酰胺的简易多孔硬度检测法用于研究细胞对基质硬度的依赖性反应

本实验方案介绍了一种制备具有不同刚度的聚乙烯醇-共-衣康酸水凝胶的方法，该水凝胶可选择性地接枝或不接枝寡肽，用于研究生物材料刚度对干细胞分化与增殖的影响。通过调节交联时间来控制水凝胶的刚度。...

无饲养层条件下于不同硬度的聚乙烯醇-共-衣康酸水凝胶上培养人多能干细胞

我们开发了一种基于多孔板格式的聚丙烯酰胺检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测方法可与流式细胞术、免疫染色以及牵引力显微镜兼容，能够对细胞、其细胞外基质与致病菌之间的生物力学相互作用进行定量测量。...

一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

本文介绍了一种用于制备具有不同杨氏模量或厚度的聚合物薄膜复合结构的制造工艺。所制备的薄膜可用于高级细胞培养研究或作为皮肤粘合剂。...

用于细胞培养和皮肤应用的薄膜复合硅胶弹性体：制造与表征

刚度在千帕范围内的基底可用于研究细胞对生理相关微环境刚度的响应。仅使用宽场荧光显微镜，即可通过使用合适微球进行压痕实验来测定软硅胶的杨氏模量。...

使用宽场荧光显微镜测量用于力学生物学研究的软硅胶基底的刚度

该方法旨在阐明细胞外基质信号（如基质刚度、蛋白质组成和细胞形态）调控施万细胞（SC）表型的机制。...

可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化

细胞培养技术的建立彻底改变了基础细胞与分子生物学研究中的假设验证方式。该技术已成为……的标准方法。...

生物微机电系统与细胞生物学：展望与应用

University of Calgary.  尽管细胞外基质（ECM）刚性是细胞行为的关键调控因子，但其潜在的感应和转导机制仍不明确。为此，我们提供了构建具有可调节刚度的聚丙烯酰胺和硅基基底的方案，以推进对细胞-ECM串扰的理解。

用于细胞生物学研究的具有确定刚度的聚丙烯酰胺和硅胶细胞外基质基底的制备

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