用于研究的连续培养毫流体装置 大肠杆菌 在低且波动的营养条件下

我的研究重点是探究细菌在自然环境中典型的低营养和营养波动条件下如何进行生理适应。传统的培养系统难以模拟低动态营养条件，而我们的系统能够实现在这些与环境相关的条件下进行培养。在实验前一天准备过夜培养物。

通过将6微升过夜培养物加入含有6毫升完全丰富的定义培养基（RDM）的试管中，制备预培养物。将混合物等分至两个15毫升的培养管中，并标记为A和B。将两个培养管在37摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养。使用B管监测600纳米处的光密度，待光密度达到约0.5时再进行后续操作。

孵育期间，准备低RDM培养基，并将总体积分装至用于不同时间点的瓶子中。然后用带有三根管路的瓶盖密封每个瓶子。将第三粗的硅胶管连接至0.2微米通气滤器，以实现无菌空气交换。

将每根带有公型鲁尔锁扣接头的蠕动管一端连接到直径较小的硅胶管上。在实验开始前，保持蠕动管另一端游离的公型鲁尔锁扣接头上的铝箔覆盖，以防止污染。将瓶子和蠕动泵放入设定为37摄氏度的培养箱中。

将所有蠕动泵管路固定到同一泵头的通道中，确保所有滤膜的流速一致。按1:10的比例稀释预培养液，即将600微升培养物加入含有5.4毫升低浓度RDM的离心管中。使用1毫升移液器，将1毫升稀释后的培养物分别加入六个0.45微米聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜中。

用经高压灭菌的超纯水冲洗单向止回阀后，将其分别连接到滤器的两端。取下管路接头上的铝箔盖。将每个滤器连接到蠕动泵管路接头上。

将蠕动泵的流速设置为每分钟两毫升。在滤器下方放置废液容器以收集流出液，并启动流体流动。两小时后，拔下连接至一升瓶的一个滤器，拧下单向止回阀，将滤器放入50毫升离心管中，进液口朝下。

在 2,000 G 条件下离心两分钟。使用无菌管切割器，在塑料外壳的出口端施加轻柔压力以打开滤器。取出内筒，并丢弃含有膜的部分。

用收集的培养基冲洗滤器外壳的内壁。使用5毫升血清移液管测量收集到的总体积。从样品中取出三份100微升等分试样，加入戊二醛固定，使其终浓度为1.5%。在后续时间点拔下相应的滤器，并重复收集操作。

根据各自的时间点标记收集的样品。使用荧光DNA染料对样品进行标记，并通过流式细胞术计数细胞。随着时间推移，以10为底的对数转换后的细胞计数呈线性变化趋势，表明在所有条件下细胞均呈指数生长。

0.5%RDM 条件下的生长速率约为每小时 0.88，0.25% 条件下为每小时 0.64，0.01% 条件下为每小时 0.18。细胞数量达到每样本十亿个细胞，表明毫流体连续培养装置（MCCD）在纳摩尔至微摩尔营养浓度下均能支持细胞的指数生长和高生物量产量。在 0.5%RDM 中培养的细胞平均长度大于在 0.01%RDM 中培养的细胞。

低营养培养过程中的主要挑战是维持足够的细胞密度，以防止堵塞、压力积聚和营养耗竭。按照本方案操作后，细胞可被收集用于其他下游分析，包括蛋白质组学、代谢组学及其他组学方法。未来的研究可通过将本方案与定量组学分析相结合，进一步探究微生物对营养限制及其波动的适应机制。