使用LysoTracker进行溶酶体分析，定量评估人类成纤维细胞衰老

我们研究细胞衰老及其特征，重点关注溶酶体变化等特征如何作为衰老标志。传统的衰老标志通常是基于终点的二元，而活细胞成像则可以将衰老信号作为跨病症的连续定量信号读取。首先，将IMR-90成纤维细胞播种在24孔的培养皿中，并在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中孵育，直到形成亚合流单分子层。

记录每个实验的播种密度以及从装甲到溶酶体染色之间的时间。将整个培养基加热至37摄氏度。在培养基中准备75纳摩尔的LysoTracker深红工作液，并保护其免受光照。

用轻柔倒置法混合工作溶液。选定匹配的前衰老和衰老IMR-90成纤维细胞队列，采用定义的衰老诱导方法制备。通过监测生长特征和形态来确认衰老表型。

从每个井中抽取用过的介质。在每个井壁上轻轻添加LysoTracker工作液，避免扰动单层。用LysoTracker在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中孵育细胞30分钟。

在LysoTracker孵育的最后10分钟内，将Hoechst 33342直接加入厂家推荐的工作浓度，并轻轻摇晃板子混合。培养结束时取出染色介质，并用预热的PBS冲洗一次细胞，以减少背景荧光。冲洗后立即加入预热的酚类无红培养基。

直接进入活细胞成像，保持从缓冲区交换到数据采集的时间在所有孔间保持一致。标记培养板上的平行孔，用于β-半乳糖苷酶染色，以比较高度衰老细胞与前衰老对照细胞。在固定前进行完整的活细胞成像以验证井。

在实时成像时记录阶段坐标，以便固定后重新定位相同的场。将含有2%甲醛和0.2%戊二醛的衰老β-半乳糖苷染色套件中的固定溶液加入细胞中。盖上盖子，在室温下孵育10到15分钟。

去除固定液，用PBS冲洗两次井口。然后在每个孔中加入含有x加仑底物pH值6的β-半乳糖苷酶染色溶液。用防腐剂密封培养板以减少孵化过程中的蒸发，并将培养板放入37摄氏度的无二氧化碳干式培养箱中，浸泡12至16小时。

固定和染色后，将板片放置在显微台上，并利用记录的台坐标重新定位相同的成像场。在明场显微镜下检查孔洞，记录染色图案。为每种病症拍摄代表性图像，并确定每孔中衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例。

衰老细胞表现出明亮、空间扩展的核旁溶酶体富集区，而衰老前对照组则整体信号较低，且具有离散的点状结构。衰老状态显示β-gal阳性细胞比例高于衰老前对照组。研究发现，复制孔中LysoTracker强度与衰老相关β-gal阳性面积之间存在强烈相关性。

阳性面罩中LysoTracker的平均强度在衰老培养中高于衰老前培养，使其成为两者之间最强有力的现场识别因子。在代表性田中，衰老培养的集成LysoTracker每核强度也更高。该方案使研究人员能够测量活细胞中的溶酶体重塑，提供单细胞衰老负荷和进展的可量化读数。

保持所有孔的染色和成像设置一致非常重要，因为强度比较仅在一次会话内有效。未来的研究有望将该程序扩展到三维模型、更多细胞类型以及不同显微镜系统和工作流程的验证。