潜在抗结核候选物的鉴定：合成、最低抑菌浓度测定及哺乳动物细胞毒性评估的逐步指南

本研究的重点是开发和验证新型抗结核药物候选物，旨在推进治疗策略。预防性表型筛选流程可用于寻找针对结核分枝杆菌菌株的新药。首先，收集所需试剂，并按照所示比例配制反应混合物。

在85摄氏度下搅拌反应混合物16小时。使用旋转蒸发仪除去溶剂。向残留物中加入约20毫升饱和碳酸氢钠溶液。

使用11微米的纤维素定性滤纸过滤此悬浮液，以收集残留的固体。将残留的固体溶解于50毫升氯仿中。使用分液漏斗，每次用15毫升水洗涤氯仿溶液，共洗涤三次。

每次均除去水层。向有机相中加入无水硫酸钠以去除残留水分并进行干燥。蒸发溶剂后，用约50摄氏度的10毫升正己烷将所得绿色固体洗涤四次。

取1毫克化合物6，加入1毫升乙腈与甲醇1:1的混合溶液，配制储备液。将储备液稀释至0.5毫克/毫升，并在分析前过滤。将样品注入高效液相色谱（HPLC）系统中。

使用色谱数据采集软件来采集和处理数据。设定色谱方法采用规格为250 mm × 4.6 mm、粒径为5 µm的反相C18色谱柱。设定流速为1.5 mL/min，并在254 nm处进行紫外检测。

按照预设的流动相组成变化建立梯度。取约15至20毫克化合物6，转移至核磁共振（NMR）管中。用适量体积的DMSO-d6溶解。

设定好采集参数后，使用标准脉冲序列采集质子核磁共振谱。调整采集参数，开始采集质子和碳-13核磁共振谱，并以百万分之一（ppm）为单位报告化学位移。

利用实验获得的自由感应衰减文件对核磁共振数据进行可视化处理。对于化合物6的基于色谱的纯化，使用硅胶装填色谱柱。将粗产物化合物6上样至色谱柱中。

洗脱化合物并收集组分。使用薄层色谱法监测各组分，并合并含有纯化产物的组分。向96孔板的第12列加入100 µL添加了10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）的7H9培养基。

然后向第11列加入含10% ADC和5% DMSO的7H9肉汤100微升，并依次从第9列到第1列进行相同操作。接着向第10列加入200微升化合物溶液，每种化合物分配一行。

用移液器将浓度为最高测试浓度两倍的化合物溶液100微升加入96孔板的第12列。从第10列转移100微升至第9列，通过反复移液充分混匀，开始进行两倍倍比稀释。按顺序继续倍比稀释至第1列。

将结核分枝杆菌菌液依次从第11列到第1列每孔加入100微升，并覆盖培养板。用封口膜密封培养板，在37摄氏度下孵育七天。随后，向培养板的每孔中加入60微升0.01%刃天青溶液，并覆盖培养板。

用封口膜密封培养板，在37摄氏度下孵育48小时。然后观察颜色是否由蓝色变为粉红色。用无血清DMEM配制0.5毫克/毫升的MTT工作液。

获取经化合物6处理48小时的Vero和HEPG2细胞，并进行观察以评估处理效果。从培养板中吸除培养基，在低环境光条件下，向每孔加入50微升MTT工作液。经过3小时孵育后，在低环境光条件下，向每孔加入100微升DMSO以溶解甲臜结晶。

将培养板置于100 RPM的摇床上振荡15分钟，期间避光。检查对照孔，确认晶体完全溶解。将培养板放入酶标仪中。

设定参考波长为630至690纳米，并检测570纳米处的吸光度。用无血清DMEM配制40微克/毫升的中性红工作液。然后按体积比配制含1%冰醋酸、49%乙醇和50%超纯水的中性红脱吸附溶液。

在评估化合物6对Vero和HEPG2细胞的作用后，移除培养基，并向每个孔中加入100微升过滤后的中性红工作液。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时。移除中性红工作液后，用150微升无菌PBS将每孔冲洗一次。

向每个孔中加入 150 µL 中性红脱色液。将培养板置于 150 RPM 的摇床上振荡 15 分钟，以提取染料。检查对照孔，确认染料已完全提取。

使用酶标仪在540纳米处读取吸光度。高效液相色谱图显示，化合物6的保留时间为14.11分钟，纯度为99%。氢核磁共振谱在1.50至3.13百万分之一（ppm）范围内显示出哌啶片段的特征信号，在2.38百万分之一（ppm）处有一个甲基单峰。

芳香信号包括在6.97和7.17 ppm处的双峰，以及在7.63至7.75 ppm范围内的多重峰。碳-13核磁共振谱显示甲基碳信号位于23.81 ppm，哌啶相关信号位于24.85至49.70 ppm之间。MTT板显示化合物浓度之间存在明显的颜色梯度，表明在高浓度化合物条件下细胞毒性最强，孔呈半透明；而在低浓度化合物条件下细胞毒性最低，孔呈深紫色。

中性红摄取实验板显示化合物浓度之间存在明显的颜色梯度，表明在高浓度化合物条件下细胞毒性最强，孔内呈半透明状态；而在低浓度化合物条件下细胞毒性最低，孔内呈深粉红色。本方案代表了一种基于表型筛选的抗结核药物候选物开发流程。在应用该方案时，需充分考虑并评估所合成化合物的低溶解度问题。

这项研究可作为未来生物利用度、巨噬细胞感染以及体内研究的基础。