Name: 潜在抗结核候选物的鉴定：哺乳动物细胞合成、MIC鉴定及细胞毒性评估的逐步指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习抗结核候选药物的表型筛选方法，通过化合物合成、REMA法MIC测定及MTT和NRU细胞毒性检测，评估Mycobacterium tuberculosis的抗菌活性与哺乳动物细胞安全性，计算选择性指数以筛选潜在药物。

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本工作由结核病国家科学与技术研究所（MCTI/CNPq/SECTICS/MS/CAPES/FAPERGS，资助号：404838/2024-0）及CNPq/MCTI N&#176; 44/2024 – 通用（资助编号 N&#176; 420934/2025-1）和FAPERGS 06/2025 – PqG（资助编号 N&#176; 25/2551-00002734-9)。C.V.B（CNPq，资助号：311949/2019-3）、L.A.B.（CNPq，资助号：303499/2021-4）和 P.M.（CNPq，资助号：310888/2022-0）为CNPq研究职业奖获得者。本研究部分由Coordenac&#808;&#227;o de Aperfeic&#808;巴西高等教育人员培训协调机构（CAPES），资助代码 001

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作者未报告任何潜在的利益冲突。

一种&#160;表型筛选&#160;方法，依赖于全细胞活性而非分离的酶，是鉴定抗M. tuberculosis活性化合物的有效策略。本文描述了该方法的初始步骤，包括候选化合物的化学合成、通过最低抑菌浓度（MIC）测定评估其抑制活性，以及利用MTT和NRU实验在哺乳动物细胞（Vero和HepG2）中评估其细胞毒性。
合成路线包含三个主要步骤（图1），通过操作简便的转化反应，可获得高纯度的目标化合物。已确定若干关键步骤对反应的可重复性和效率具有决定性作用。初始缩合反应需要精确的化学计量控制和持续回流，以确保中间体完全生成。在热环化反应前若溶剂去除不完全，可能对环合效率产生不利影响。环化步骤本身需要严格控制温度，因为加热不足会导致芳构化不完全，而过度或长时间加热则可能促进副产物的生成。在氯化过程中，建议严格控制反应温度并缓慢加入三氯氧磷，以尽量减少副反应并确保在4位点的选择性活化。在方法优化过程中，微小的实验操作调整提高了方法的稳健性。若环化后出现沉淀不完全的情况，采用逐步冷却而非快速淬灭可提高固体产物的回收率。若亲核取代步骤中观察到产率降低，延长反应时间或验证胺的纯度均被证明有益。
该方法的主要局限性在于需要高温环化以及使用三氯氧磷等腐蚀性氯化试剂，因而对实验室基础设施和安全防护有特定要求。取代基的电子效应可能需要针对不同的苯胺或胺类化合物重新优化反应条件，从而限制了在不进行调整的情况下实现广泛骨架多样化的能力。然而，与使用强氧化剂的Skraup类合成法或依赖过渡金属催化的反应（需专用催化剂和惰性气氛）相比，Conrad–Limpach方法在操作上更为简便。这种无金属策略能够高效地生成适用于药物化学的官能团化喹啉中间体。
用于测定 MIC 的方案是一种依赖目视检查的比色法。该方法可能存在的一个挑战是颜色变化不完全，导致孔中呈现紫色，而非明确的蓝色（抑制）或粉色（生长）。若出现此情况，应解释为未能抑制分枝杆菌的生长。此外，由于化合物通过连续稀释进行评估，最高可测试浓度受限于化合物的溶解度。因此，在某些情况下，若在最高可溶浓度下未观察到抑制作用，则结果可能无法得出明确结论。另外，需要认识到其他实验室可能会根据其特定条件对方案中的某些步骤进行调整，这可能导致所得结果存在差异。为了提高通量，该方案可进行自动化改造。采用液体处理系统进行 96 孔板的制备将减少移液误差，从而提高准确性和可重复性。
细胞毒性评价方案采用两种不同的哺乳动物细胞系（Vero 和 HepG2）以及两种互补的活力检测方法（MTT 和 NRU）。该方案中的多个步骤对于确保数据的可重复性和准确性至关重要，各实验室应自行进行验证。例如，初始细胞接种密度必须仔细优化，因为细胞过度融合可能导致接触抑制和代谢状态改变，从而干扰实验结果；而接种密度过低则可能使细胞更容易受到轻微损伤的影响，导致毒性被高估15。此外，最高测试浓度通常受限于化合物的溶解度，沉淀的产生可能导致结果不准确。同时，建议的板式布局（图 3A）适用于初筛，通过省略技术重复并忽略边缘效应，以增加可检测化合物的数量，后续则通过独立的生物学重复进行验证。
本方案的一个关键优势在于同时平行实施 MTT 和 NRU 两种检测方法。尽管这两种方法均已得到广泛认可，但它们测量的是不同的细胞参数。MTT 检测通过定量线粒体脱氢酶的代谢活性来反映细胞活力，通常与细胞存活率相关16。然而，该检测易受到具有还原性或氧化性化合物的干扰，或受干扰线粒体呼吸过程的物质影响，可能导致假阳性或假阴性结果15。平行进行 NRU 检测有助于识别和排除此类干扰因素。NRU 检测评估的是活细胞维持溶酶体完整性和染料摄取所需 pH 梯度的能力17。MTT 与 NRU 结果之间的差异可揭示特定的毒性机制，例如线粒体功能障碍，提示需要进一步研究。
总之，本方案概述了鉴定潜在抗结核药物候选物的基本步骤。对于表现出良好选择性和效力的化合物，可进一步推进至更复杂的感染模型，例如 在体 研究。

结核病（TB）主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，是一种主要累及肺部的人类传染性呼吸道疾病，尽管也可能出现肺外型结核。结核病通过活动性结核患者释放到空气中的Mtb杆菌传播1。根据疾病进展的不同，感染结核者可能立即发展为活动性结核病。但通常情况下，新感染者会发展为潜伏性结核感染，此时代谢活性较低的Mtb菌在肉芽肿内存活1,2。潜伏性结核感染者最终可能发展为活动性结核病，并出现临床症状3。目前估计，全球约四分之一的人口存在潜伏性结核感染4。
尽管已取得诸多进展，结核病（TB）仍然是全球严重的公共卫生问题。根据最新发布的《全球结核病报告》数据，2024年有1070万人罹患该病。同年，全球共登记结核病死亡病例123万例，使其成为由单一传染病病原体导致死亡的首要原因5。除结核分枝杆菌（Mtb）本身的病理特征和复杂生物学特性外，贫困和营养不良等社会经济因素，以及吸烟、糖尿病和HIV共感染等健康相关因素，进一步加大了疾病防控的难度5。这些因素共同导致结核病长期持续成为全球健康领域的重大挑战。
此外，目前的结核病治疗方案存在一些局限性，使疾病防控工作更加复杂。针对结核分枝杆菌（Mtb）敏感菌株，标准治疗方案采用四种药物联合疗法：异烟肼（INH）、利福平（RIF）、乙胺丁醇（EMB）和吡嗪酰胺（PZA）。这些抗生素需至少使用6个月，且治疗期间必须严格遵从医嘱。尽管该治疗方案对大多数病例有效，治愈率约为85%，但仍面临诸多挑战5,6。其中最主要的问题包括药物副作用和疗程过长，这常常导致患者提前中断治疗。这种中断行为，加上抗生素使用不当，容易促进耐药性Mtb菌株的筛选和传播，而这些耐药菌株需要毒性更强、费用更高且疗程更长的治疗方案7,8。
鉴于这一情况，开发新型高效抗结核药物迫在眉睫。本实验方案概述了利用表型筛选方法研究新药候选物的早期阶段。为说明该方案的应用，我们选择了一种源自LABIO-17的4-氨基喹啉化合物进行评估。LABIO-17此前已被我们的研究团队鉴定为结核分枝杆菌（Mtb）烯酰基-ACP还原酶（InhA）的抑制剂，其作用靶点与异烟肼（INH）相同9,10。InhA参与结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的分枝菌酸生物合成，对该杆菌的存活至关重要，因此是一个极具前景的分子靶点11

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepG2（人肝细胞癌）</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>人肝癌细胞系</td></tr><tr><td>结核分枝杆菌 H37Ra</td><td>ATCC</td><td>25177</td><td></td></tr><tr><td>结核分枝杆菌 H37Rv</td><td>ATCC</td><td>27294</td><td></td></tr><tr><td>Vero（非洲绿猴肾）</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>灵长类动物肾上皮细胞系</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品 &amp;ndash; 合成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(哌啶-1-基)苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TCI：P0887</td><td>化合物5/6的胺类前体</td></tr><tr><td>4-溴苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-67-8</td><td>喹啉合成的起始原料</td></tr><tr><td>乙酸（冰醋酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>合成与流动相制备中的试剂</td></tr><tr><td>乙腈（HPLC 级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967</td><td>高效液相色谱流动相组分及核磁共振溶剂</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>产品提取用溶剂</td></tr><tr><td>DMSO-d6（氘代）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175641</td><td>核磁共振溶剂</td></tr><tr><td>Dowtherm A（传热流体）</td><td>Sigma-Aldrich / Solutia</td><td>待定</td><td>用于热环化的高沸点溶剂（230&amp;ndash;250 &amp;deg;C）；曾用名Dowtherm&amp;reg; A</td></tr><tr><td>乙醇（纯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>康拉德反应溶剂&amp;ndash;林帕赫步法</td></tr><tr><td>乙酸乙酯（HPLC 级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270989</td><td>柱洗脱液组分</td></tr><tr><td>乙酰乙酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E12806</td><td>&amp;beta;用于喹啉环形成的β-酮酯试剂</td></tr><tr><td>甲酸（HPLC 级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td>高效液相色谱和高分辨质谱流动相中0.1%的添加剂</td></tr><tr><td>玻璃珠（1 mm，无菌）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>用于结核分枝杆菌培养物的匀浆处理</td></tr><tr><td>HCl（盐酸，37%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>亲核取代反应中的酸催化剂</td></tr><tr><td>正己烷（HPLC 级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34859</td><td>柱层析用非极性洗脱剂</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td>合成化合物6的反应溶剂</td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO4，无水）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>干燥剂和反应催化剂</td></tr><tr><td>甲醇（HPLC 级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>高效液相色谱流动相及核磁共振溶剂组分</td></tr><tr><td>三氯氧磷（POCl₃）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td>中间体4的氯化试剂</td></tr><tr><td>吡啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>亲核取代反应中的碱性催化剂</td></tr><tr><td>硅胶（35&amp;ndash;用于快速柱层析的70目筛</td><td>Macherey-Nagel</td><td>815349</td><td>快速色谱步骤中的固定相</td></tr><tr><td>硅胶 60 &amp;Aring; (70&amp;ndash;230目）用于柱层析</td><td>Macherey-Nagel</td><td>815381</td><td>柱层析固定相</td></tr><tr><td>硫酸钠（Na2SO4，无水）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>有机相干燥剂</td></tr><tr><td>TLC 硅胶 60 F254 板</td><td>默克</td><td>1.05554</td><td>薄层色谱监测</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>氯化步骤用溶剂</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Millipore / 等效产品</td><td>N/A</td><td>用于流动相配制；此前在文中称为 Milli-Q 水</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备 &amp;和仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>默克密理博 / 任意</td><td>SLGP033RS</td><td>刃天青溶液的灭菌（2.1.4）；MTT工作液的过滤（3.3）；中性红工作液的过滤（3.4）</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>默克密理博 / 任意</td><td>SLHA033SS</td><td>流动相溶液的过滤</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形管（无菌）</td><td>Falcon / 任意</td><td>352097 或同等产品</td><td>胰酶消化后细胞悬液的收集与离心</td></tr><tr><td>96孔板（平底，组织培养处理）</td><td>康宁 / 任意</td><td>3596</td><td>用于细胞毒性和最小抑菌浓度（MIC）测定</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>任何</td><td>&amp;mdash;</td><td>MTT 和 NRU 孵育及振荡步骤中对培养板的避光保护</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>任何</td><td>&amp;mdash;</td><td>培养基灭菌（121 &amp;deg;C，98.07 kPa，10 min</td></tr><tr><td>生物安全柜（II级，经认证）</td><td>任何（BSL-3 认证的）</td><td>&amp;mdash;</td><td>结核分枝杆菌操作所需（生物安全等级3级）</td></tr><tr><td>细胞计数仪（自动）或血细胞计数板</td><td>例如，Bio-Rad TC20 / 计数板</td><td>待定</td><td>用于细胞浓度与活力测定</td></tr><tr><td>离心机（可达到 200 &amp;times; g)</td><td>任何</td><td>&amp;mdash;</td><td>细胞沉淀步骤</td></tr><tr><td>CO2 培养箱（37 &amp;deg;C，5% CO₂，湿润环境）</td><td>任何</td><td>&amp;mdash;</td><td>细胞培养与处理孵育</td></tr><tr><td>加热套</td><td>Fisotom&amp;nbsp;</td><td>12M</td><td>带道和油（Dowtherm）的温控加热套&amp;reg; A</td></tr><tr><td>高效液相色谱系统（Dionex UltiMate 3000）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5035.9200</td><td>双泵，自动进样器，紫外检测器；用于化合物6的纯度分析</td></tr><tr><td>倒置显微镜（或同等设备）</td><td>任何</td><td>&amp;mdash;</td><td>在细胞贴壁时（3.2）、处理过程中的检查点（3.3、3.4）以及检测状态确认时进行细胞的目视观察</td></tr><tr><td>磁力搅拌器/加热板</td><td>任何</td><td>&amp;mdash;</td><td>溶液配制与反应混合</td></tr><tr><td>质谱仪（LTQ Orbitrap Discovery）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;mdash;</td><td>高分辨率轨道阱质谱仪与LTQ XL联用；用于化合物6的高分辨质谱分析</td></tr><tr><td>熔点测定仪</td><td>任意（例如 Stuart SMP10）</td><td>&amp;mdash;</td><td>化合物6的熔点测定</td></tr><tr><td>酶标仪（吸光度）</td><td>任意（例如 BioTek Epoch）</td><td>&amp;mdash;</td><td>在570 nm（MTT法）和540 nm（NRU法）处读取吸光度</td></tr><tr><td>核磁共振波谱仪（Avance III HD，400 MHz）</td><td>布鲁克公司</td><td>N/A</td><td>1H 和 13C NMR 数据采集；位于 PUCRS 设施</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>任何</td><td>&amp;mdash;</td><td>100 转/分钟（MTT 晶体溶解）；150 转/分钟（NRU 提取）</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis / Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>孵育过程中96孔板的密封</td></tr><tr><td>定性滤纸</td><td>联合国驻黎巴嫩临时部队</td><td>50,11,250</td><td>沃特曼滤纸等级，纤维素；11 &amp;micro;m 保留；约 80 g/m&amp;sup2;</td></tr><tr><td>反相C18 HPLC色谱柱（250 &amp;times; 4.6 毫米，5 &amp;micro;m)</td><td>Macherey-Nagel（Nucleodur C18）</td><td>760201.46</td><td>用于高效液相色谱纯度分析的分析柱</td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>IKA</td><td>&amp;mdash;</td><td>减压下蒸发溶剂</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>布拉松</td><td>Model 2510</td><td>用于溶液脱气的超声波清洗槽</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>任何</td><td>&amp;mdash;</td><td>使用玻璃珠均质化细菌培养物</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基 &amp;和补充剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADC（白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶）增菌液</td><td>BD 生物科学</td><td>212352</td><td>7H9肉汤培养基10%补充剂（检测孔）</td></tr><tr><td>两性霉素B溶液（250 &amp;micro;g/mL</td><td>&lt;br/&gt; Gibco/Thermo Fisher</td><td>&lt;br/&gt; 15290026</td><td>完全培养基中的抗真菌添加剂，0.1%</td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）低糖</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>&lt;br/&gt; 31600034</td><td>HepG2 和 Vero 细胞的基础培养基</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>&lt;br/&gt; 12657029</td><td>完全培养基中10%的添加剂</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 肉汤粉末</td><td>BD 生物科学</td><td>271310</td><td>结核分枝杆菌培养的基础培养基</td></tr><tr><td>OADC（油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶）增菌液</td><td>BD 生物科学</td><td>212240</td><td>7H9肉汤（培养）用10%添加剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液（10,000 U/mL）</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>完全培养基中1%</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>DMEM 中每升添加 1.8 克的补充剂；也用于 NaHCO3 饱和溶液</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>&lt;br/&gt; 25200072</td><td>用于细胞从培养瓶中脱离</td></tr><tr><td>Tween-80（聚山梨酯80），10% 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>7H9-OADC 肉汤中 0.05% 的补充剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂 &amp;和检测组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>化合物储备液溶剂</td></tr><tr><td>DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>&lt;br/&gt; D565210X1L</td><td>用于NRU实验中的化合物稀释（3.2）和PBS洗涤（3.4）</td></tr><tr><td>MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td>MTT实验用细胞活力检测试剂</td></tr><tr><td>中性红（NR）染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N2889</td><td>NRU实验用细胞活力试剂</td></tr><tr><td>刃天青钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td>REMA实验比色指示剂</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>通过排除法测定细胞活力</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 6.80 SR11（色谱数据采集）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Build 3160 (183147)</td><td>高效液相色谱数据采集与处理</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0.7（质谱数据分析）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>发布版本 2.0.7</td><td>元素组成测定（Qual Browser 模块）</td></tr></tbody></table>

潜在抗结核候选物的鉴定：合成、最低抑菌浓度测定及哺乳动物细胞毒性评估的逐步指南

Identification of Potential Anti-TB Candidates: A Step-by-Step Guide to Synthesis, MIC Determination, and Cytotoxicity Assessment in Mammalian Cells

结核病（TB）仍然是全球由单一传染性病原体导致死亡的主要原因之一，且耐药率不断上升，使得新型治疗药物的研发成为全球公共卫生的优先事项。本实验方案描述了一种通过三个整合阶段进行潜在抗结核药物候选物筛选的表型筛选方法。首先，通过三步合成法合成一种4-氨基喹啉类化合物，并利用高效液相色谱（HPLC）、核磁共振（NMR）波谱法和高分辨质谱（HRMS）对其进行全面表征。其次，采用比色法刃天青还原微孔板检测（REMA），通过简单的视觉颜色变化读数，评估该化合物对Mycobacterium tuberculosis的抗菌活性，以确定其最低抑菌浓度（MIC）。第三，利用MTT法（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐）和中性红摄取（NRU）法，在两种哺乳动物细胞系Vero（非洲绿猴肾细胞）和HepG2（人肝细胞癌细胞）中评估该化合物的细胞毒性。这两种互补的检测方法可测量不同的细胞参数，从而实现细胞毒性结果的交叉验证。结合MIC和细胞毒性数据，可计算选择性指数（SI），以评估各化合物的治疗潜力。本方案为早期抗结核药物候选物的发现及临床前评价提供了可重复、逐步操作的框架。

合成反应得到目标化合物6，为浅绿色固体（0.53 g，产率67%）。该化合物熔点为227–229 °C，UHPLC纯度为99%（tR = 14.11 min）（图4）。通过核磁共振（NMR）波谱法和高分辨质谱（HRMS）确认了其化学结构。1H NMR谱图（图5）显示，哌啶片段的信号出现在1.50–3.13 ppm之间。2位甲基在2.38 ppm处呈现典型的单峰。3位氢原子在6.56 ppm处表现为单峰。苯环在6.97 ppm和7.17 ppm处显示两个二重峰，耦合常数为8.9 Hz。7位和8位氢原子在7.63–7.75 ppm范围内产生多重峰，而喹啉核心5位氢原子在8.59 ppm处呈现二重峰（J = 2.0 Hz）。氨基氢原子在8.66 ppm处观察到单峰。13C NMR谱图（图6）在23.81 ppm处出现归属于2位甲基的信号，24.85–49.70 ppm之间的信号对应于哌啶片段。3位碳原子出现在100.52 ppm。其余去屏蔽区信号归属于喹啉核心和苯环上的碳原子。HRMS确认了化合物6的分子式，测得[M+H]+离子的m/z为396.1063（C21H23BrN3的计算值：396.1070）。
<img alt="高效液相色谱结果；紫外-可见吸收光谱；峰分析数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig4.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图 4"> 
图 4. 化合物 6 的高效液相色谱图及紫外吸收光谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示化学位移值和峰归属的核磁共振波谱图，用于分子分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig5.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图 5"> 
图 5。 化合物6的1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）谱图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="X射线衍射图谱；晶体结构分析；峰强度数据；材料科学" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig6.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图6"> 
图6。 化合物6的13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）谱图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
通过测定最低抑菌浓度（MIC）来评估该化合物对M. tuberculosis的抑制活性，MIC定义为能够完全抑制细菌可见生长的最低化合物浓度。在REMA实验中，颜色无变化（保持蓝色）表明细菌生长被抑制，而颜色变为粉红色则表明细菌发生生长。异烟肼（INH）和利福平（RIF）作为药物对照。结果如图7所示。每块板均包含一个生长对照（第11列，不含药物）和一个无菌对照（第12列，不含分枝杆菌）。化合物从第10列（最高浓度）至第1列（最低浓度）进行倍比稀释。如图7所示，A行（异烟肼）化合物的MIC值出现在第4列，而B行（利福平）和C行（合成化合物）化合物的MIC值均出现在第5列。在本实验条件下，INH对H37Rv菌株的MIC为0.31 µg/mL，对H37Ra菌株为0.16 µg/mL；RIF对H37Rv菌株的MIC为0.08 µg/mL，对H37Ra菌株为0.01 µg/mL。
<img alt="微量滴定板比色法检测结果；A-C行，1-12列；浓度梯度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig7.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图7"> 
图7．采用刃天青微量滴定板法（REMA）测定结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的最低抑菌浓度（MIC）。A–C行，1–10列：异烟肼（A行）、利福平（B行）及合成化合物（C行）的两倍系列稀释液。第11列：存活率对照（含2.5% DMSO + 细菌的培养基）。第12列：无菌对照（培养基 + 化合物）。蓝色表示细菌生长被抑制，粉红色表示细菌具有活性，原因是刃天青被还原为试卤灵。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
Vero细胞的NRU（上图）和MTT（下图）实验的代表性96孔板如图所示 图3B在MTT平板中，可观察到明显的颜色梯度变化，从高浓度化合物处的透明（无活细胞）逐渐变为低浓度处的深紫色（细胞活力高）。类似地，NRU平板显示出从透明到深粉色的梯度变化，表明中性红染料被活细胞的溶酶体所摄取。
显微镜观察可在孵育48小时后直观确认实验状态（图8）。图8A比较了健康未处理的对照细胞（Vero和HepG2）与经细胞毒性浓度化合物处理的细胞。处理后的细胞呈现圆形、脱落且无活性的形态。图8B在最终溶解步骤前提供了关键的视觉质控点，显示了两种细胞中活细胞内预期形成的深紫色甲臜晶体（MTT实验），以及溶酶体内红色染料的积累（NRU实验）。
原始吸光度数据经溶剂对照归一化后，通过非线性回归分析生成剂量-反应曲线，具体步骤详见方案3.5。对于目标化合物6（源自LABIO-17），在NRU实验中，其在Vero细胞中的CC50为12.2 µM，在HepG2细胞中为18.3 µM；在MTT实验中，两种细胞系的CC50均&gt;20 µM。由此得到的选择性指数（SI）范围为30.5至&gt;50，与先前报道结果一致10。
<img alt="细胞活力检测结果；Vero、HepG2细胞，毒性化合物；MTT、NRU方法，比较图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70693/70693fig8.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图8"> 
图8． Vero和HepG2细胞的细胞毒性检测代表性显微镜图像。所有图像均在100倍放大下拍摄。（A）处理48小时后细胞形态的比较。Vero细胞（上图）和HepG2细胞（下图）的未处理对照孔显示健康、融合的单层细胞。相比之下，经细胞毒性浓度化合物处理的细胞呈现圆形、皱缩，并从培养板表面脱落。（B）试剂添加后、溶解前的关键视觉检查点。在MTT检测中（每种细胞系的左侧面板），活细胞内可见深紫色的甲臜晶体。在NRU检测中（每种细胞系的右侧面板），活细胞中完整的溶酶体内有红色染料的积累。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70693/70693fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种通过表型筛选鉴定潜在抗结核药物候选物的实验方案，包括4-氨基喹啉类化合物的化学合成、其对结核分枝杆菌最低抑菌浓度的测定，以及在哺乳动物细胞系中对其细胞毒性的评估。

结核病（TB）仍然是全球由单一传染性病原体导致死亡的主要原因之一，且耐药率不断上升，使得……

本研究的重点是开发和验证新型抗结核药物候选物，旨在推进治疗策略。预防性表型筛选流程可用于寻找针对结核分枝杆菌菌株的新药。首先，收集所需试剂，并按照所示比例配制反应混合物。在85摄氏度下搅拌反应混合物16小时。使用旋转蒸发仪除去溶剂。向残留物中加入约20毫升饱和碳酸氢钠溶液。使用11微米的纤维素定性滤纸过滤此悬浮液，以收集残留的固体。将残留的固体溶解于50毫升氯仿中。使用分液漏斗，每次用15毫升水洗涤氯仿溶液，共洗涤三次。每次均除去水层。向有机相中加入无水硫酸钠以去除残留水分并进行干燥。蒸发溶剂后，用约50摄氏度的10毫升正己烷将所得绿色固体洗涤四次。取1毫克化合物6，加入1毫升乙腈与甲醇1:1的混合溶液，配制储备液。将储备液稀释至0.5毫克/毫升，并在分析前过滤。将样品注入高效液相色谱（HPLC）系统中。使用色谱数据采集软件来采集和处理数据。设定色谱方法采用规格为250 mm × 4.6 mm、粒径为5 µm的反相C18色谱柱。设定流速为1.5 mL/min，并在254 nm处进行紫外检测。按照预设的流动相组成变化建立梯度。取约15至20毫克化合物6，转移至核磁共振（NMR）管中。用适量体积的DMSO-d6溶解。设定好采集参数后，使用标准脉冲序列采集质子核磁共振谱。调整采集参数，开始采集质子和碳-13核磁共振谱，并以百万分之一（ppm）为单位报告化学位移。利用实验获得的自由感应衰减文件对核磁共振数据进行可视化处理。对于化合物6的基于色谱的纯化，使用硅胶装填色谱柱。将粗产物化合物6上样至色谱柱中。洗脱化合物并收集组分。使用薄层色谱法监测各组分，并合并含有纯化产物的组分。向96孔板的第12列加入100 µL添加了10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）的7H9培养基。然后向第11列加入含10% ADC和5% DMSO的7H9肉汤100微升，并依次从第9列到第1列进行相同操作。接着向第10列加入200微升化合物溶液，每种化合物分配一行。用移液器将浓度为最高测试浓度两倍的化合物溶液100微升加入96孔板的第12列。从第10列转移100微升至第9列，通过反复移液充分混匀，开始进行两倍倍比稀释。按顺序继续倍比稀释至第1列。将结核分枝杆菌菌液依次从第11列到第1列每孔加入100微升，并覆盖培养板。用封口膜密封培养板，在37摄氏度下孵育七天。随后，向培养板的每孔中加入60微升0.01%刃天青溶液，并覆盖培养板。用封口膜密封培养板，在37摄氏度下孵育48小时。然后观察颜色是否由蓝色变为粉红色。用无血清DMEM配制0.5毫克/毫升的MTT工作液。获取经化合物6处理48小时的Vero和HEPG2细胞，并进行观察以评估处理效果。从培养板中吸除培养基，在低环境光条件下，向每孔加入50微升MTT工作液。经过3小时孵育后，在低环境光条件下，向每孔加入100微升DMSO以溶解甲臜结晶。将培养板置于100 RPM的摇床上振荡15分钟，期间避光。检查对照孔，确认晶体完全溶解。将培养板放入酶标仪中。设定参考波长为630至690纳米，并检测570纳米处的吸光度。用无血清DMEM配制40微克/毫升的中性红工作液。然后按体积比配制含1%冰醋酸、49%乙醇和50%超纯水的中性红脱吸附溶液。在评估化合物6对Vero和HEPG2细胞的作用后，移除培养基，并向每个孔中加入100微升过滤后的中性红工作液。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时。移除中性红工作液后，用150微升无菌PBS将每孔冲洗一次。向每个孔中加入 150 µL 中性红脱色液。将培养板置于 150 RPM 的摇床上振荡 15 分钟，以提取染料。检查对照孔，确认染料已完全提取。使用酶标仪在540纳米处读取吸光度。高效液相色谱图显示，化合物6的保留时间为14.11分钟，纯度为99%。氢核磁共振谱在1.50至3.13百万分之一（ppm）范围内显示出哌啶片段的特征信号，在2.38百万分之一（ppm）处有一个甲基单峰。芳香信号包括在6.97和7.17 ppm处的双峰，以及在7.63至7.75 ppm范围内的多重峰。碳-13核磁共振谱显示甲基碳信号位于23.81 ppm，哌啶相关信号位于24.85至49.70 ppm之间。MTT板显示化合物浓度之间存在明显的颜色梯度，表明在高浓度化合物条件下细胞毒性最强，孔呈半透明；而在低浓度化合物条件下细胞毒性最低，孔呈深紫色。中性红摄取实验板显示化合物浓度之间存在明显的颜色梯度，表明在高浓度化合物条件下细胞毒性最强，孔内呈半透明状态；而在低浓度化合物条件下细胞毒性最低，孔内呈深粉红色。本方案代表了一种基于表型筛选的抗结核药物候选物开发流程。在应用该方案时，需充分考虑并评估所合成化合物的低溶解度问题。这项研究可作为未来生物利用度、巨噬细胞感染以及体内研究的基础。

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