Name: 一种将 Euglena gracilis 适应木薯基质以实现异养栽培的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 学习将Euglena gracilis适应木薯基质进行异养栽培的方法，通过多阶段梯度暴露策略建立耐受株系。该方案支持农业废弃物资源化利用和可持续生物加工应用。

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作者感谢&#160;Psaltry&#160;International Company Ltd. 提供木薯来源材料，并对与工业木薯加工相关的应用研究&#160;目标&#160;的确定做出了贡献。&#160;
作者&#160;感谢&#160;Resourced Global Inc.（洛克菲勒基金会支持的 NFAL 项目牵头单位）。&#160;
作者&#160;感谢通用标准检测公司（Société Générale de Surveillance, SGS）采用&#160;燃烧法（杜马斯法，Dumas）&#160;进行外部粗蛋白分析。&#160;额外的&#160;实验室支持与方法学反馈由特伦特大学研究团队成员提供。&#160;
本工作部分由合作伙伴支持的应用研究计划资助。&#160;

作者声明不存在竞争性&#160;经济利益&#160;或利益冲突。&#160;

影响本方案成功的关键因素是在木薯底物浓度与异养培养过程中生理稳定性之间的平衡&#160;E.&#160;gracilis.&#160;木薯来源的材料会引入物理异质性、残留颗粒物以及不稳定的营养释放动力学，这些因素直接影响细胞的生长行为和培养体系的稳定性2,3.&#160;在实验方案的步骤中，底物制备与浓度&#160;选择&#160;因此代表最敏感的控制点。作为&#160;已证明&#160;根据代表性结果，中间底物浓度能够可靠地支持持续生长，且复孔间差异有限。&#160;而&#160;较低浓度限制生物量积累，而较高浓度则增加时间变异性及瞬时应激反应。这些结果表明，底物最大加载量并不必然产生&#160;最佳的&#160;或在使用异质性农工材料时的稳定培养性能。&#160;所选的预处理步骤和底物浓度范围旨在逐步增加挑战性 E. gracilis 在化学和微生物复杂性逐渐增加的条件下，这些环境中观察到的生长稳定性和存活率差异支持了该分阶段方法的有效性，并证实中间底物浓度在营养可利用性与生理应激之间提供了平衡。
异养生长期间的培养操作会进一步影响适应性进化结果。在完全黑暗条件下保持持续而轻柔的混匀至关重要&#160;维持&#160;接触&#160;E.&#160;gracilis&#160;细胞和悬浮基质材料，同时避免过高的剪切应力。混合不足会导致沉降和局部营养梯度，干扰生长和活力测定，尤其在未经过高压灭菌的培养基中更为显著12.&#160;这些观察结果与&#160;上一步&#160;有研究报告指出，空间异质性和底物暴露不均可能掩盖微生物培养系统中的生理响应。因此，本方案强调采用常规倒置而非持续振荡，以此作为均匀性与培养完整性之间的一种实用折中策略。&#160;
为了应对木薯基底物固有的变异性，本方案包含了多种故障排除措施和灵活调整的环节。对发酵木薯培养基进行高压灭菌可降低微生物载量并改变底物结构，尤其在早期适应阶段，有助于提高短期一致性。相比之下，在成功适应后，只要接种密度和混合程度足够以维持稳定的生长，未经过高压灭菌的培养基&#160;可&#160;有&#160;效&#160;使&#160;用。这种分阶段的方法与先前的研究一致，这些研究&#160;表&#160;明，逐步施加的选择压力可使微生物群落随时间推移逐渐耐受日益复杂的环境13,14。在此背景下，长期监测至关重要，因为生长或活力的暂时性下降&#160;常&#160;在&#160;后&#160;续传代过程中恢复，且不会影响整体适应的成功。&#160;
活力测定和形态学监测在整个适应过程中作为快速诊断工具。台盼蓝排斥法提供了生理强健性的定量指标，而基于显微镜的运动性和&#160;包囊&#160;评估则可对底物过载或适应延迟等非理想条件发出早期预警15。重要的是，该方案强调随时间变化的趋势而非单点测量值，因为活力或形态的短期波动并不总能预测长期培养失败。&#160;这种纵向观察视角对于区分短暂的应激反应与持续的生理衰退至关重要。&#160;在培养过程中检测到的氰化物水平降低表明，在所述条件下木薯来源底物的部分脱毒作用正在发生。这种降低可能源于与发酵相关的降解、挥发以及微生物活动的共同作用。尽管本研究未直接探究氰化物去除的具体生化机制和动力学过程，但这些观察结果支持将氰化物监测作为评估底物转化和培养可行性的一个实用指标。
该方法存在若干局限性，应予以承认。首先，仅以粗蛋白百分比无法全面反映营养价值或功能性蛋白质质量，解释结果时必须结合生物量总量与组成指标进行综合考量16&#160;。其次，使用加工最少且成分不均一的底物&#160;会引入&#160;无法完全消除的变异性，即使采用标准化制备流程亦难以避免。这一挑战在农业工业生物加工领域已被广泛认知17&#160;，反映的是实际应用中的现实限制，而非实验设计本身的缺陷。第三，尽管本方案已&#160;优化&#160;适用于实验室规模和中试规模的培养，但若进一步放大至超过台式规模的体积，则需加强对混合动力学、氧气传递和固相处理的控制，并需考虑反应器构型及流体动力学条件，这一点已在其他微藻和原生生物系统中得到证实18。
与依赖精制糖或严格控制的光养系统的现有&#160;E.&#160;gracilis&#160;培养方法相比，本方案通过在低成本木薯来源底物上实现完全异养条件下的生长，提供了显著的方法学优势。该方法避免了对纯化碳源的依赖19,20&#160;，且无需专用的照明设施，从而提高了&#160;E.&#160;gracilis&#160;培养的操作灵活性。这对于关注资源利用效率、废弃物高值化利用以及在木薯生产地区开展分布式生产的应用尤为重要。&#160;
该方法的更广泛意义在于其适用于微生物适应性、可持续生物加工和生物质高值化利用等研究领域。通过将逐步增加底物暴露与简单、低成本的监测工具相结合，该方案为将非传统底物整合到微生物培养流程中提供了一个可重复的框架。尽管本方案是为&#160;E.&#160;gracilis开发的，但其中分阶段适应、长期性能评估以及基于形态学的决策等核心原则，可广泛适用于其他正在探索用于循环生物经济应用的微藻和原生生物系统21,22。因此，该方案不仅是一种培养方法，更是一个可在现实底物限制条件下进行应用型微生物适应研究的通用框架。&#160;本方法在设计时以可及性为主要目标，因此最适合具备基础微生物学设施并可获得关键生物资源（特别是Euglena gracilis培养物和木薯来源底物）的实验室或应用研究环境。此外，该系统具有时间上的灵活性，基于木薯的培养基可全年制备和发酵，不受季节限制。尽管该方案是在实验室规模下开发和验证的，但其使用低成本木薯来源底物且加工需求极少的特点，支持其未来向更大规模培养系统的潜在扩展。
尽管本方案为适应性培养建立了可重复的框架，但对生长动力学、生物量生产率和底物转化效率进行进一步的定量分析，对于优化其在规模化或工业应用中的性能仍具有重要意义。

木薯（Manihot esculenta）是西非地区重要的粮食作物和工业作物，可产生多种加工副产品，如木薯粉、干浆、果皮和颗粒饲料1。
木薯来源的底物主要由可发酵碳水化合物和残余营养物质组成，同时含有少量蛋白质和纤维成分，但其具体组成会因加工条件和原料来源的不同而有所变化2,3。由于其成分异质、含有氰苷类物质，以及在传统加工和发酵过程中产生的复杂微生物群落，这些底物至今仍未能得到充分利用4。这些特性给直接进行微生物培养带来了挑战，并限制了木薯副产物在标准化生物加工流程中的整合应用。尽管木薯副产物资源丰富，目前仍缺乏可在这些化学成分复杂且微生物活性高的底物上稳定培养微生物系统的可重复且具有生物可持续性的方法。若能建立一种可在上述条件下稳定运行、兼具富集或解毒功能的培养系统，将有助于实现更可持续的木薯加工流程和资源的循环利用。
Euglena gracilis 是一种属于眼虫门的单细胞鞭毛生物5 因其在营养物质可利用性、渗透压和化学成分发生显著波动时，具有柔韧的表膜、动态的形态变化以及可逆的包囊能力而著称6其代谢适应性还使其能够合成储存性多糖副淀粉6 并通过有机酸代谢调节细胞pH。这些代谢特征，尤其是淀粉样多糖（paramylon）的积累，可能增强能量储存和抗逆性，从而在木薯衍生底物所特有的多变营养和化学条件下支持生物体的存活与适应。这些特征使得 E. gracilis 在化学性质多变的淡水环境中具有持续生存能力，使其成为在异质性非精炼基质上培养的有前景候选物种7.
当暴露于化学成分复杂或具有微生物活性的底物时，未适应的E. gracilis培养物常表现出应激反应，例如包囊化增加和运动能力下降，而已适应的种群则可能保持更稳定的形态和代谢活性8。与相关微生物群落的相互作用可能进一步影响其在长期接触复杂底物期间的生理表现。这些特性凸显了在利用木薯来源材料培养E. gracilis时，基于适应性策略的重要性9。
为应对这些挑战，本方法采用分阶段适应策略，旨在逐步使E. gracilis适应木薯来源的底物。该方法通过逐步增加底物复杂性和微生物活性的可控暴露，筛选出能够在异质培养条件下维持存活和生长的种群。该设计使E. gracilis能够与相关微生物群相互作用，并可能从中获益，同时适应逐渐提高的培养基浓度。
经过适应后，该方案将对已适应和未适应的样本进行比较评估 E. gracilis 多个木薯衍生产品中的谱系。该比较框架可用于评估在接近田间条件的基质环境中，生长一致性、形态稳定性及生理响应，因为适应过程在逐步进行 E. gracilis 以应对木薯副产物中典型的营养成分变异、化学应激因子及微生物活性。
该方法在培养过程中对pH和氰化物水平进行标准化监测10，并对收获的生物量通过总氮含量测定进行下游蛋白质分析的前处理11，从而实现不同底物和菌株之间营养潜力的比较。这些检测指标共同支持对基于木薯的培养过程中代谢稳定性、底物相互作用以及生物量特征的评估，并证明适应后的E. gracilis品系能够在多种木薯副产物中稳定且持续地生长。
该方法最适合具备基本微生物学基础设施以及可获取木薯来源底物的实验室或应用研究环境。实际考虑因素包括需要一致地处理非均质培养基、具备显微镜以监测培养物状态，以及在培养过程中精确控制混匀条件以避免剪切应力。

<table><tbody><tr><td>高压灭菌器 -&lt;br/&gt; 533LS 蒸汽&lt;br/&gt; 灭菌器</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>用于木薯培养基的蒸汽灭菌。&lt;br/&gt; 使用液体循环程序对培养基进行灭菌。</td></tr><tr><td>Bright-Line&amp;trade;&lt;br/&gt; 血细胞计数板&lt;br/&gt; 替换用&lt;br/&gt; 盖玻片</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015-&lt;br/&gt; 100EA</td><td>专为血细胞计数板设计的加厚盖玻片。</td></tr><tr><td>干燥木薯&lt;br/&gt; 粉浆</td><td>Psaltry&lt;br/&gt; International</td><td>N/A</td><td>提供的木薯底物</td></tr><tr><td>木薯颗粒</td><td>Psaltry&lt;br/&gt; International</td><td>N/A</td><td>提供的木薯底物</td></tr><tr><td>木薯皮</td><td>Psaltry&lt;br/&gt; International</td><td>N/A</td><td>提供的木薯底物</td></tr><tr><td>木薯&lt;br/&gt; 底物（加里）</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>来源于木薯的加里&lt;br/&gt; 原料，作为碳&lt;br/&gt; 源使用；用&lt;br/&gt; 去离子水配制。</td></tr><tr><td>离心机&lt;br/&gt; Thermo&lt;br/&gt; Scientific Sorvall&lt;br/&gt; ST16 离心机</td><td>Thermo&lt;br/&gt; Scientific Sorvall&lt;br/&gt; ST16 离心机</td><td>75004241</td><td>可达到 &amp;ge;3,500 &amp;times; g，用于收获生物量。</td></tr><tr><td>离心管&lt;br/&gt; 例如 Axygen（A&lt;br/&gt; Corning 品牌）</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>无菌，最小容积 1.5 mL</td></tr><tr><td>洁净水&lt;br/&gt; 例如 UltraPure&amp;trade;&lt;br/&gt; DNase/RNase-&lt;br/&gt; 无蒸馏&lt;br/&gt; 水</td><td>ThermoFisher&lt;br/&gt; Scientific</td><td>10977035</td><td>去离子或蒸馏水，用于培养基配制</td></tr><tr><td>复合光学&lt;br/&gt; 显微镜</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>标准的复式显微镜，适用于常规细胞观察与计数。</td></tr><tr><td>氰化物检测&lt;br/&gt; 试纸条，&lt;br/&gt; 比色法。&lt;br/&gt; CN&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt; 10–30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>半定量氰化物检测。作为危险废物处理。</td></tr><tr><td>无菌标准&lt;br/&gt; 称量皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>用于称量木薯底物和干生物量。</td></tr><tr><td>Euglena gracilis&lt;br/&gt; （适应性&lt;br/&gt; 菌株）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本研究中构建的木薯适应性菌株</td></tr><tr><td>Euglena gracilis&lt;br/&gt; （野生型）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>非适应性对照菌株。维持相同的标准培养条件。</td></tr><tr><td>裸藻生长&lt;br/&gt; 培养基&lt;br/&gt; 组分</td><td>多种</td><td>N/A</td><td>根据实验室标准配方配制的基础裸藻培养基。</td></tr><tr><td>FreeZone 6 升&lt;br/&gt; 控制台式冻&lt;br/&gt; 干机</td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>用于生物量脱水</td></tr><tr><td>血细胞计数板&lt;br/&gt; 带标准&lt;br/&gt; 刻度</td><td>Weber&lt;br/&gt; Scientific</td><td>NC1587539</td><td>用于手动细胞计数。</td></tr><tr><td>磁力搅拌器&lt;br/&gt; 带加热板</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>可选；在培养基配制和底物悬浮过程中提高一致性。</td></tr><tr><td>移液器&lt;br/&gt; （P20, P200,&lt;br/&gt; P1000）</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>可调体积移液器，用于无菌液体转移。</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>可选；有助于在收获生物量时快速沉淀。</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>在无通气盖时用于临时密封烧瓶或培养皿。</td></tr><tr><td>pH 指示&lt;br/&gt; 试纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>作为 pH 计的替代方法，用于快速定性评估培养基 pH。</td></tr><tr><td>pH 计带&lt;br/&gt; 探头&lt;br/&gt; Thermo&lt;br/&gt; Scientific Orion&lt;br/&gt; Star A211&lt;br/&gt; 台式 pH&lt;br/&gt; 计</td><td>Thermo&lt;br/&gt; Scientific Orion&lt;br/&gt; Star A211&lt;br/&gt; 台式 pH&lt;br/&gt; 计</td><td>13-645-519</td><td>使用前需校准。用于测量培养上清液的 pH 值。</td></tr><tr><td>冷藏&lt;br/&gt; 储存（4&amp;deg;C）</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>培养基的短期储存</td></tr><tr><td>摇床&lt;br/&gt; 培养箱（避光）</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>可进行轨道振荡的培养箱，转速范围 100&amp;ndash;150 RPM，温度范围 24&amp;ndash;28 &amp;deg;C；在避光条件下使用，以支持异养型裸藻的生长。</td></tr><tr><td>喷雾瓶&lt;br/&gt; （32 盎司）</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>用于台面消毒和常规无菌操作（70% 乙醇溶液）</td></tr><tr><td>电子表格&lt;br/&gt; 软件</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>数据采集、整理与分析</td></tr><tr><td>无菌移液&lt;br/&gt; 吸头</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>无菌、一次性吸头，适用于 P20、P200 和 P1000 移液器。</td></tr><tr><td>无菌&lt;br/&gt; 血清学&lt;br/&gt; 移液管（5, 10,&lt;br/&gt; 25 mL）</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>独立包装的无菌移液管，用于培养物转移和取样。</td></tr><tr><td>台盼蓝&lt;br/&gt; 溶液&lt;br/&gt; 0.4%，液体，&lt;br/&gt; 经无菌过滤，&lt;br/&gt; 适用于细胞&lt;br/&gt; 培养</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>活体染料，用于通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。</td></tr><tr><td>样品收集&lt;br/&gt; 用管（50&lt;br/&gt; mL）</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>用于 pH 和氰化物取样</td></tr><tr><td>通气盖&lt;br/&gt; 锥形瓶（250&lt;br/&gt; 至 500&amp;ndash;500&lt;br/&gt; mL）</td><td>Corning&amp;reg; 250 mL 聚碳酸酯带通气盖锥形瓶</td><td>431144</td><td>带通气盖的聚碳酸酯锥形瓶；可高压灭菌；用于无菌和非无菌液体培养。</td></tr><tr><td>废液容器</td><td>多种 — 符合实验室设定标准</td><td>N/A</td><td>高压灭菌袋以及锐器或玻璃废料容器，用于符合生物安全要求的废弃物处置。</td></tr></tbody></table>

一种用于将 euglena gracilis 适应于木薯基底物以进行异养培养的方法

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

木薯加工会产生富含营养的副产品，但由于其成分多变、含有生氰化合物以及活跃的微生物群落，这些副产品仍未能得到充分利用。本实验方案介绍了一种多阶段适应性策略，用于建立可在木薯来源培养基中进行异养培养的耐木薯型Euglena gracilis藻株。该方法首先将裸藻培养物同时暴露于经高压灭菌和未经高压灭菌的木薯培养基中，并置于10–30 g/L的加里（garri）浓度梯度下，以评估其对微生物复杂性和底物负荷的耐受性。随后，将培养物置于更高浓度梯度（30–50 g/L）中，以评估其在更浓稠底物中的生长表现。将获得的适应性藻株与未适应的野生型菌株在五种木薯产品——加里、干木薯浆、颗粒料、木薯皮和动物饲料中进行比较，以评估其在实际应用场景材料中的生长稳定性。本方案包括pH变化的测定、使用比色试纸检测氰化物含量，以及通过总氮定量法测定蛋白质含量前的干生物质制备。上述步骤共同构建了一个可重复的框架，用于使Euglena gracilis适应木薯来源的底物，并评估藻株在多种木薯产品中的生长性能。该方法可推动耐性强的微藻品系的开发，服务于以木薯为核心的生物加工和废弃物高值化利用应用。

以下代表性结果展示了成功应用所述实验方案后预期得到的结果，以及在非最佳条件下观察到的结果范围。与这些结果相对应的代表性数据如图所示 图1, 图2, 图3, 图4, 图5, 图6, 图7综上所述，这些结果为解读适应过程中的生长动态、存活率、形态学特征及蛋白质表达结果提供了实用指导 E. gracilis 在异养、完全黑暗的培养条件下，丝状绿藻可适应以木薯为基础的培养基。此外，这些结果验证了该实验方案的关键生物学结果，包括成功适应、持续生长、高存活率、形态稳定、在不同培养基上表现一致以及可测量的蛋白质生产。
在全部实验过程中，每种处理（所有类型的木薯培养基）均设置三个重复。我们承认，重复数目的设定取决于任何遵循上述方案的团队根据自身判断及实际操作条件而定。成功应用本方案可实现E. gracilis在以木薯渣为基础的培养基中、完全黑暗条件下的持续异养生长。成功的实验结果表现为平滑的S型生长曲线、重复组间差异较小以及稳定维持的后期细胞密度。在已适应的种群中，表现出细胞呈圆形、细胞膜增厚等形态学特征，这些特征可作为积极结果的标志且被持续观察到。相比之下，不健康或塌陷的细胞通常呈现不规则、碎片化或结构受损的形态，常伴随活力下降，可与适应性培养中观察到的完整圆形或半包囊形态相区分。作为参考，文中提供了野生型E. gracilis典型细长形态的代表性图像（图8），以便将基础细胞结构与已适应或发生改变的形态区分开来。在30 g L-1木薯渣培养基中培养的细胞，其综合生长表现更高，以生长曲线下的面积（AUC）衡量，优于较低浓度组，表明对木薯底物的利用效率更高，并实现了成功的生理适应（图1）。
在较低的木薯粉浓度（10–20 g L-1）下，通常观察到次优结果，此时可检测到生长，但生长幅度降低，且在重复实验间变异较大。在较高浓度（40–50 g L-1）下，培养物可能达到较高的峰值细胞密度；然而，这些条件常表现出延迟的稳定化过程或更大的时间变异性（图2）。
在成功的实验中，细胞活力在整个培养期间保持较高水平，仅在实验中期出现轻微波动。台盼蓝排斥实验表明，在所采集的时间点中，维持在 30 g L-1 加里浓度下的培养物中，活细胞（未染色）的比例显著高于死细胞（蓝色染色）（图 3）。若出现与此模式偏离的情况，例如染色细胞比例增加、运动能力下降，或形态向圆形或塌陷状转变，则可能提示培养条件不理想，并可作为启动故障排查的早期信号。细胞活力与形态学评估基于一致的观察标准，包括细胞完整性、定向运动能力，以及细长形态与圆形或塌陷形态的相对比例。
次优结果表现为存活率出现短暂下降，这种情况最常在较高木薯粉浓度下观察到。在后续时间点可能观察到部分恢复；然而，这些条件下在整个培养期间的存活率表现出更大的变异性（图4）。这些生长模式表明，中等底物浓度（例如，30 g L-1）在营养供应与胁迫之间达到平衡，从而实现更稳定的生长。这些趋势反映了预处理条件和分阶段适应对培养性能的影响，因为逐步暴露于复杂性递增的底物有助于提高生理稳定性并获得可重复的生长行为。较低浓度会限制生物量的产生，而较高浓度则导致更大的变异性以及稳定化过程的延迟。
形态学评估可提供适应状态的定性指标。积极结果包括出现并持续存在运动能力降低的圆形或半包囊状细胞，且在多次连续传代培养中保持完整（图5）。
相比之下，次优培养条件下的菌体（通常与野生型菌株或早期适应阶段相关）会表现出从细长、可运动的细胞形态突然转变为不规则或塌陷的形态，且伴随着生长稳定性的降低。
当该方案应用于其他木薯来源的底物（包括果 pulp、颗粒和果皮）时，经适应的E. gracilis培养物在多种底物类型上均表现出可重复的生长。与野生型培养物相比，成功的实验结果表现为生长曲线更早趋于稳定，且后期衰退程度降低（图6）。
次优结果包括生长启动延迟或重复实验间的变异性增加，尤其是在物理异质性较大的底物中。
成功实施该方案可获得具有可测粗蛋白含量的E. gracilis生物量，该含量由外部实验室采用燃烧法（杜马斯法）测定。适应性培养物中的蛋白质百分比与野生型培养物中测得的结果相当，总蛋白产量的增加与生物量积累的提升相对应（图7）。
培养基化学性质的监测支持了适应过程中培养物与底物之间的相互作用，并验证了将pH和氰化物检测纳入实验方案的合理性。pH值随时间呈现逐渐变化的趋势，表明存在代谢活性和底物利用，其中适应后的培养物表现出更稳定的变化趋势。氰化物检测结果进一步支持了这一结论，因为适应后的培养物中可检测到的氰化物水平降低，而野生型培养物则波动较大。综合来看，这些结果表明，这些监测步骤能够有效捕捉与适应相关的培养基化学变化，并有助于对培养物性能的解读。尽管本研究未探讨其潜在机制，但这代表了一个重要的未来研究方向，特别是在工业规模应用方面。
长期维持与传代流程支持了适应性Euglena gracilis品系在延长培养周期中的持续存活。通过反复传代维持的培养物在多次维持周期中始终保持着运动能力、典型的形态特征以及稳定的生长行为。尽管未对长期性能进行定量评估，但这些观察结果提供了代表性证据，表明该适应性品系可在指定条件下被可靠地维持。
综上所述，这些结果证实，该适应性培养方案能够支持E. gracilis在以木薯为基础的培养基上实现稳定的生长、良好的存活率和生物量积累，且随着时间推移，其表现稳定，并能持续降低氰化物水平。
所有图和表均以单独文件提供，未嵌入稿件正文中。图和表的放置位置偏好在稿件文本中通过括号内的标注予以说明（例如，(图 1)）。除非另有说明，所有图和表将在最终出版物中位于“代表性结果”部分的下方。
所有图均以单独文件提交，多图组合的图应提供为单个合并图像。显微镜图像需在每个图中包含比例尺。数据图需标注坐标轴并明确定义测量单位，误差线应在相应的图注中予以说明。
所有表格均以单独的 .xls 或 .xlsx 文件提交，包含原始或汇总的数值数据，且无装饰性格式。
<img alt="眼虫生长动态图表；细胞密度与天数；灭菌与非灭菌培养物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig1.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图1"> 
图1：在10、20和30 gL-1 木薯粉条件下，E. gracilis 在完全黑暗环境中的生长动态。 显示了各底物浓度下随时间变化的平均细胞密度。误差条表示生物学重复之间的标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞密度与时间关系图；不同木薯粉浓度下的生长分析；数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 2"> 
图 2：E. gracilis 在较高木薯粉浓度（30–50 g L-1）下的生长表现。 细胞密度变化轨迹显示了在较高底物浓度下，峰值密度、稳定时间以及变异性的差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在Euglena品系筛选中，经高压灭菌的琼脂细胞活力图，显示随天数变化的活力情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig3.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图3"> 
图3：通过台盼蓝排斥法测定的斜生栅藻（E. gracilis）在30 gL-1 加里培养基中的细胞活力变化趋势。图中显示了在不同取样时间点的活细胞比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同木薯粉浓度下的细胞活力动态；显示随时间变化的应激与恢复的折线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig4.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 4"> 
图 4：在较高木薯粉浓度下培养的 E. gracilis 的活力波动。 实验期间细胞活力的瞬时变化如图所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示样本分析中线虫不同阶段的寄生虫检查显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig5.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 5"> 
图 5：适应后 E. gracilis 种群的代表性形态。代表性倒置光学显微镜图像显示了适应后观察到的圆形及半包囊状细胞。比例尺 = XX µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生长趋势图；细胞密度与日历天数；GA/WT菌株；统计分析；GAM品系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig6.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图6"> 
图6：适应菌株与野生型 E. gracilis 在木薯来源底物上的生长表现。 图中显示了适应菌株与野生型菌株在多种木薯制品上培养的生长轨迹。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质浓度分析；总蛋白量与条件的关系图；数据比较；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig7.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图7"> 
图7：木薯培养的E. gracilis生物量中的粗蛋白含量和总蛋白产量。 蛋白质含量通过SGS燃烧法（杜马斯法）的外部分析进行定量。总蛋白产量与生物量积累一并展示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="浮游生物的显微镜图像；细胞结构；光学研究；水生生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig8.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图8"> 
图8：标准条件下野生型 E. gracilis 的代表性形态（40倍放大）。 在光学显微镜下观察到的健康、未适应状态的 Euglena gracilis 的代表性图像，显示其典型的细长形态。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了逐步适应的方法&#160;眼虫&#160;gracilis&#160;木薯基底物&#160;随后的&#160;在异养培养条件下对多种木薯产品的生长、存活率及生物量生产的评估

一种用于将 Euglena gracilis 适应于木薯基底物以进行异养培养的方法

木薯加工会产生富含营养的副产品，但由于其成分不稳定、含有生氰化合物以及存在活跃的微生物……

我们的研究重点是将新培养的纤细裸藻（Euglena gracilis）适应于木薯废料，并研究其生长情况、氰化物降解能力以及富含蛋白质的生物量生产。该方案可应用于可持续的木薯加工、农业废弃物高值化利用、饲料生产以及低成本生物技术系统。首先，用底物类型“garri”标记无菌的500毫升带通气盖的锥形瓶。在烧瓶上标记相应的目标浓度。用重复编号以及计划的灭菌条件（高压灭菌或非高压灭菌）标记烧瓶。将称量舟置于分析天平上。按下归零后，称取木薯粉以匹配最终工作体积。将称好的木薯粉无菌加入含有300毫升去离子水或蒸馏水的无菌500毫升锥形瓶中。将带通气孔的瓶盖重新盖回每个锥形瓶上。将每种悬浮液混合3分钟，直至混合物均匀。若使用磁力搅拌，将烧瓶置于搅拌台上，调节转速至200G，形成浅漩涡且不产生飞溅。在25°C下静置悬浮液，静置水化10分钟。在发酵前立即拧紧通气盖，并用手轻轻摇晃烧瓶五次，以轻柔地混匀混合物并重新悬浮已沉降的物质。如需制备更多木薯产物培养基，请参照之前的方法标记烧瓶并称量底物，根据工作体积使底物浓度达到每升30克。将称量好的底物无菌操作加入含有300毫升去离子水或蒸馏水的无菌烧瓶中。将通气盖重新安装到每个烧瓶上。按照之前演示的方法进行水合并混匀悬浮液。确认烧瓶已装上无菌透气通气盖，以允许气体交换同时尽量减少环境污染物的进入。将锥形瓶直立放置于25摄氏度的指定区域，避免阳光直射和高流量气流干扰，静置培养至少72小时。记录每个锥形瓶及对应条件的发酵起始日期和时间。确认每个500毫升锥形瓶在发酵后液体体积不超过300毫升，以防止灭菌过程中发生沸腾溢出。将通气盖松开至手指拧紧的位置后，在烧瓶上贴上高压灭菌指示胶带。将烧瓶放入可耐受高压灭菌的托盘中，再将托盘放入高压灭菌器内，选择P13液体循环程序。设置灭菌参数为121摄氏度，持续30分钟，以进行液体灭菌。启动高压灭菌程序。待程序结束后，使高压灭菌室压力恢复至大气压，然后缓慢打开高压灭菌锅门。使用耐热手套取出锥形瓶，并使其冷却至室温。将冷却后的锥形瓶在接种前于室温下放置过夜。直接使用发酵后的木薯培养基，无需高压灭菌，以保留原有的微生物群落。在72小时发酵期结束后，立即对未高压灭菌的培养基进行接种，以尽量减少意外的环境污染物侵入。通过在所有底物条件下使用相同类型的500毫升通气盖烧瓶、相同的工作体积和相同的发酵时间，确保各重复组之间操作的一致性。将纤细裸藻接种至新鲜的异养培养基中。将培养物置于完全黑暗条件下，在28°C以120G持续振荡培养，直至培养物进入对数生长中期。使用明场模式的复式光学显微镜，在100×至400×总放大倍数下观察培养物，确认其具有活跃的运动性、细长的细胞形态以及较低的附着水平。在适应性实验前，排除那些出现大量细胞碎片、形态异常或附着水平升高的培养物。通过拧紧通气盖轻轻均质化起始培养物后，手动旋转锥形瓶15秒，以确保细胞均匀分布，同时避免产生剪切应力。使用血细胞计数板（Neubauer 血球计数板）测定细胞密度。将培养物轻轻摇动锥形瓶 15 秒使其混匀后，用移液器吸取 1 毫升培养液至无菌的 1.5 毫升微量离心管中。用 70% 乙醇清洁血细胞计数板和盖玻片，并将其置于空气中自然晾干。用移液器将10微升培养液滴加到血细胞计数板的两个计数区域上，然后将盖玻片覆盖在湿润的样品上。使用10倍物镜的明场显微镜观察，聚焦于计数网格，按照标准边界规则，计数大网格中特定区域内的细胞数。在第二个计数室重复细胞计数，计算每毫升的平均细胞数及细胞密度。调整接种体积，使所有实验培养基中的最终接种量均为5%（体积比）。针对每种处理条件分别制备接种物，以保持各实验组之间初始细胞密度一致。将制备好的E.gracilis接种物加入已灭菌和未灭菌的木薯培养基中，培养基终浓度分别为每升10、20和30克的加里粉（garri）。在所有处理条件下使用相等的接种体积，以标准化初始细胞密度。拧紧通气盖后，轻轻以圆形晃动锥形瓶15秒，使细胞均匀分布。将培养物置于完全黑暗、25摄氏度条件下培养，以启动异养生长。尽量减少对未高压灭菌培养基的搅动，以保持原有的微生物群落结构和底物分层。每天用手轻轻旋转混匀所有培养物一次，持续15秒，以维持伊乐藻细胞与悬浮木薯材料之间的接触。每48小时，使用无菌移液器吸头，从每个培养物中无菌采集1毫升样品。拧紧通气盖，在取样前轻轻旋转培养瓶15秒，以确保细胞和悬浮物均匀分布。将一定量的培养物转移至无菌的1.5毫升微量离心管后，根据需要用水稀释样品，以改善单个细胞的观察效果。取10微升稀释后的样品，用移液器将其加到干净的载玻片上，盖上盖玻片，制备湿封显微镜片。使用复合光学显微镜在明场模式下以100倍至400倍的总放大倍数观察样品，评估细胞运动性、形态特征以及坚持频率，作为适应状态的指标。每隔七天，无菌条件下将每种培养物按体积的20%转接至新配制的木薯培养基中，木薯粉（garri）浓度和灭菌条件保持相同。各传代之间的转接体积应保持一致，并持续进行连续传代，直至培养物在每升含30克木薯粉的培养基中表现出稳定的生长、持续的运动性以及较低的坚持频率。在高浓度木薯适应性培养及比较生长分析后，使用比色试纸检测氰化物水平并观察显色情况。离心后收集生物量用于后续分析。在完全避光培养条件下，以每升30克加里（garri）浓度培养的菌株其综合生长表现优于较低浓度组。10至20克/升的较低木薯粉浓度显示出可检测到的生长，但生长水平降低且变异性更大。40至50克/升的较高浓度达到较高的峰值细胞密度，但稳定化时间延迟，且变异性更大。台盼蓝排斥实验表明，在30克/升木薯粉浓度下培养的细胞在各个取样时间点均保持较高的存活率。较高浓度的木薯粉显示出细胞活力短暂下降，随后随着时间推移出现部分恢复，但变异性增加。阳性结果包括细胞呈圆形或半贴壁状态，运动性降低，并在多次传代培养中保持完整。适应后的 E. gracilis 菌株在多种底物上均表现出可重复的生长特性，且相较于野生型菌株更早达到稳定状态，晚期活力下降程度减轻。成功实施该方案后，通过外部实验室采用燃烧杜马斯法进行定量分析，获得了具有可测粗蛋白含量的纤细裸藻（E. gracilis）生物量。在适应性培养物中观察到的蛋白质百分比与野生型培养物中测得的结果相当，且总蛋白产量的增加与生物量积累的提升相对应。本方案使研究人员能够在不同木薯基环境中研究裸藻的生长、氰化物降解、生物量生产及营养潜力。本方案的关键挑战在于维持稳定的温度、一致的培养条件以及适合眼虫生长的平衡微生物群落。未来的研究可进一步优化并扩大本方案的规模，提高蛋白质产量，并利用不同类型的木薯废料在大规模条件下测试多种工业应用。

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科研

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生物学

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一种用于将 Euglena gracilis 适应于木薯基底物以进行异养培养的方法

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