小鼠肾缺血-再灌注损伤期间通过激光散斑对比成像监测微血管灌注

本研究中，我们采用激光散斑对比成像系统监测豚鼠在缺血再灌注过程中的微循环灌注。该技术可应用于与血流变化相关的研究，如实体器官移植、药物疗效评估及缺血相关研究。每次手术前，需先对手术台进行消毒。

将灭菌器械、棉签、纱布、预先稀释的麻醉剂及其他所有所需物品整齐摆放在桌面上。术前30分钟按每公斤体重0.2毫克的剂量皮下注射美洛昔康，以缓解疼痛。将灭菌生理盐水倒入洁净容器中。

使用剪刀在纱布中央剪出一个合适的开口。将麻醉后的小鼠置于加热垫上，并用胶带固定。涂抹脱毛膏以去除腹部毛发。

使用加热垫，在整个手术过程中维持小鼠直肠温度在 37 摄氏度。用棉签先以 75% 酒精、再以碘伏对术区进行消毒，并重复该步骤两次。然后使用镊子夹住小鼠脚趾，以确认无疼痛反应。

使用剪刀做一条腹部正中垂直切口。轻轻将皮肤与腹膜分离，然后切开腹膜以进入腹腔。使用拉钩以改善视野。

用纱布覆盖手术区域，将纱布开口与腹腔对齐。用生理盐水润湿纱布。使用棉签轻轻将肠道推向一侧，以暴露右侧肾脏及周围组织。

将纱布折叠后覆盖在肠管上，然后用生理盐水润湿以防止干燥。接着，使用一把弯头镊子提起右侧输尿管。用两根6-0缝合线分别穿过输尿管并在两个位置进行结扎。

使用显微剪刀在两条结扎线之间横断输尿管。然后用精细镊子夹住经生理盐水润湿的棉球，轻轻将肝脏向上推起。用棉球固定肝脏，以暴露肾脏及右侧血管。

接下来，使用有角度的镊子钝性分离肾周脂肪垫，直至完全暴露肾动脉和肾静脉。小心地将镊子滑至肾动脉和肾静脉下方，以建立一个通道，将6-0编织丝线缝合线绕过两根血管并一起结扎。在靠近肾脏处切断已闭塞的肾动脉和肾静脉。

切除带有附着组织的肾脏，随后移除用于固定肝脏的棉球。打开激光散斑对比成像系统，并启动专用软件。

单击原始图像，然后单击预览以显示原始手术视野图像。重新定位鼠标。在查看原始图像的同时调整相机放大倍数，以获得目标肾脏的清晰视野。

然后单击同步显示以查看实时血流成像。将放大倍数设置为2.5倍，并选择自动血流调节。然后锁定血流参数。

设置记录参数，以每 5,000 毫秒捕获一帧图像。接着，将方形区域大小参数设为 112，并在肾脏图像上均匀放置五个方形区域。点击实时图像配准并开始记录，以启动血流记录。

记录30分钟基线数据后，钝性分离左肾血管周围的脂肪组织。使用止血钳将微型夹夹在靠近肾门处的左肾动脉和静脉上。继续实时监测30分钟。

松开微夹钳以启动再灌注。监测并记录肾脏微血管血流的实时恢复情况。再灌注监测至少60分钟后，停止记录并关闭腹部切口。

通过腹腔注射给予一毫升生理盐水，以防止脱水。将小鼠置于加热垫上，并持续监测直至其恢复意识并能够自主翻身。在最初的30分钟内，肾微血管血流逐渐稳定至基线水平。

在缺血前，不同感兴趣区域的灌注水平存在异质性。在夹闭肾动脉和肾静脉后，血流急剧下降，肾微循环进入无灌注状态。松开夹子后，血流立即迅速上升至峰值，随后下降，最终逐渐恢复至相对稳定水平。

再灌注60分钟期间的微血管灌注远低于缺血前水平。我们可通过激光散斑对比成像系统获取肾脏微循环的血流情况，从而验证缺血与再灌注过程。

为了获得对比度良好且清晰的肾脏样本，我们需要耐心地花时间将肾脏与其周围的组织和资源分离。未来，可引入更多病理生理学指标，并利用该技术监测药物对肾缺血的影响。