Name: 无细胞 体外 mRNA 翻译在 黑腹果蝇 裂解液 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习利用黑腹果蝇胚胎裂解液进行无细胞体外mRNA翻译的技术方法，用于研究蛋白质合成与翻译调控机制。该方案适用于多种果蝇物种，为发育生物学和生物技术研究提供可靠工具。

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N.B-Á 和 G.H. 获得墨西哥国家癌症研究所（Instituto Nacional de Cancerología, INCan）院内资助项目的支持；D.E.V. 是墨西哥科学、人文、技术与创新秘书处（Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación, SECIHTI）“2022 年墨西哥博士后研修项目以培养和巩固墨西哥研究人员”（Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022）的博士后研究员。我们感谢 Fannis Missirlis 和 Bety Osorio（CINVESTAV，墨西哥）提供果蝇。

1) 用于模板质粒构建的 体外 转录
<ol>
	<li>选择含有5′非翻译区（UTR）、报告基因、3′ UTR以及位于T7、T3或SP6 RNA聚合酶启动子下游的poly(A)尾的质粒。确保每个构建体在poly(A)尾正下游含有一个独特的限制性酶切位点，用于转录前质粒的线性化图1). 
	注意：应谨慎选择所用的限制性内切酶位点，确保其识别位点位于转录序列之外，或选择可使线性化DNA以A结尾的酶。此外，该限制性内切酶应在模板的3'端产生平末端或5'突出末端。3'突出末端可能导致异常的转录产物。若使用产生3'突出末端的酶，应在使用前将片段末端补平。</li>
	<li>在将所有构建体用作模板之前，通过测序验证其正确性 体外 转录 
	注意：含有 poly(A) 的萤光素酶（FLuc）报告基因载体71 尾部已被用于此工作流程。FLuc 结构源自 pLUC-cassette12载体和试剂盒信息列于下文 材料表.</li>
</ol>
2) 体外 带帽和加尾的mRNA转录
<ol>
	<li>使用多聚(A)尾下游的单一限制性酶切位点（此处为 KpnI）将每个质粒构建体线性化。</li>
	<li>使用1%琼脂糖凝胶电泳在100 V条件下电泳1小时，分离线性化DNA。</li>
	<li>通过相同的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行凝胶回收，并检测其完整性和正确的线性化状态。 
	注意：线性化DNA无需进行凝胶纯化——若DNA已完全酶切，则柱纯化或酚抽提/乙醇沉淀即可满足要求。</li>
	<li>使用纯化的线性DNA进行转录 体外 根据制造商说明书使用转录试剂盒。在转录反应中加入5´帽类似物，以稳定RNA并促进翻译。 
	注意：功能性帽类似物，例如 m7G(5′)ppp(5′)G RNA 可支持转录本的稳定和翻译的促进。非功能性帽类似物（如 G(5′)ppp(5′)A）可支持转录本稳定，但不能促进翻译。此类翻译抑制剂用于双顺反子转录本翻译实验中，以检测是否存在驱动第二个顺反子翻译的内部核糖体进入位点（IRES）。7为检测 poly(A) 尾的依赖性，可在体外转录前从模板质粒中删除 poly(A) 尾。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用无RN酶的DNase处理所有转录反应，以在转录后去除DNA模板。所有 体外 转录试剂盒提供无RN酶的DN酶。</li>
	<li>根据制造商说明书，通过氯化锂沉淀或基于柱子的RNA纯化方法纯化转录产物。 
	注意：所有 体外 转录试剂盒提供氯化锂试剂。</li>
	<li>通过分光光度法对纯化的转录本进行定量，并通过1%琼脂糖凝胶电泳（100 V，运行1 h）评估mRNA完整性。</li>
	<li>分装mRNA，于-70 °C保存备用。</li>
</ol>
3) 大规模常规维护 黑腹果蝇 培养
<ol>
	<li>使用参考的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）野生型品系 Oregon-R。</li>
	<li>根据已建立的参考中心配方制备果蝇培养基。 
	注：作者采用布卢明顿果蝇保种中心（Bloomington Drosophila Stock Center）的配方37作为食物制备参考。表237中提供了该配方的详细信息。图2展示了从胚胎收集到荧光素酶活性定量的整体实验流程。</li>
	<li>设置一个长约1米、直径约50厘米的立方形或圆柱形亚克力笼子。</li>
	<li>在笼子上部开一个直径约30厘米的孔，并用网纱密封（图3）。</li>
	<li>在网纱上方放置湿纸，为果蝇提供水分，并每天更换湿纸（图3）。</li>
	<li>将笼子前部保持开放并用织物覆盖，以便进入笼内；在塑料果蝇笼的后部用亚克力板完全封闭。</li>
	<li>在收集胚胎前扩增果蝇种群，并将约1,000只年轻果蝇放入笼中。将果蝇饲养在持续22–25 °C的环境中。 
	注：可同时维持多个相同尺寸和果蝇密度的果蝇笼。果蝇产卵约15天，在第20天左右开始死亡。</li>
	<li>每天用含琼脂-果汁的培养板喂养果蝇，并在板上添加一勺含有200 µL乙酸或醋的复水面包酵母。</li>
	<li>为建立下一代果蝇，收集若干块0–12小时龄的胚胎。将胚胎置于装有果蝇培养基、尺寸为22 cm × 17 cm × 10 cm的塑料盒中，培养基深度为3 cm。确保盒子上有一个用网纱密封的孔，以保证空气流通并防止幼虫逃逸（图4）。在培养基表面添加干活性酵母，并将胚胎在25 °C下培养。</li>
	<li>3天后，在盒内放入折叠成5 cm高的纸片，使三龄幼虫能够爬上去化蛹。</li>
	<li>10天后，将含有新羽化成虫的盒子放入笼中，让果蝇从盒子中飞出并在笼内交配2天。</li>
	<li>为获得特定年龄的胚胎用于裂解液制备，小心打开笼子，并在笼内放置琼脂-果汁培养板，供果蝇在所需时间内产卵。</li>
	<li>取出培养板，使用一组筛子收集卵。 
	注：对于0–12小时龄的胚胎裂解液，可在上午8:00将两块琼脂-果汁板放入笼中，并于晚上8:00取出以收集胚胎。
	<ol>
		<li>在成虫羽化后的第3至第10天之间收集用于裂解液制备的胚胎。</li>
		<li>同时，在第2至第4天收集胚胎，并如上所述将其置于含培养基的盒子中，建立新一代果蝇。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4）制备0–12小时龄黑腹果蝇（Drosophila）胚胎的翻译裂解液
注意：本方案不包括微球菌核酸酶处理步骤。省略此步骤是为了避免外源报告 mRNA 在核酸酶未完全失活时可能发生的降解。每次实验应使用无 mRNA 的对照组监测背景翻译水平。 
注意：本方法源自先前已发表的方案7,12,14,15,16,17,22。
<ol>
	<li>按照表2所述配制胚胎裂解缓冲液，并以1 mL分装保存于-20 °C。 
	注意：每份分装液最多可冻融2次，用于立即使用。</li>
	<li>使用筛网收集胚胎。 
	注意：标准方案使用0–12小时龄的胚胎，但其他年龄的胚胎也可能适用于裂解液制备。</li>
	<li>先用自来水充分清洗胚胎，再用含0.9% NaCl和0.03% Triton X-100的胚胎缓冲液洗涤。 
	注意：胚胎在处理前可在4 °C保存最多24小时。</li>
	<li>将胚胎置于50%胚胎缓冲液和50%家用漂白剂（次氯酸钠[NaOCl] 4–6% 和氢氧化钠[NaOH] 0.02–0.1%）中脱绒膜5分钟。 
	警告：操作漂白剂时需佩戴手套和透明塑料护目镜。</li>
	<li>用自来水充分冲洗胚胎，用纸巾吸干后称重。</li>
	<li>将压紧的胚胎转移至冰上的玻璃组织研磨器中，每1 g胚胎加入1 mL胚胎裂解缓冲液，在冰上研磨20次。</li>
	<li>将匀浆液转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以15,900 × g 离心20分钟。</li>
	<li>在冰上将中间相收集为50 µL分装液。用液氮速冻后于-80 °C保存。 
	注意：中间相是位于上层和下层之间的浑浊液体溶液。上层为高度黏稠、不透明的白色脂质层，下层为固体沉淀。 
	警告：避免中间相溶液被相邻相污染。 
	警告：操作液氮时需佩戴手套和透明塑料护目镜。</li>
</ol>
5) 体外 翻译反应
<ol>
	<li>在PCR扩增仪上的96孔板或单个0.2 mL PCR管中设置翻译反应。每种翻译反应的终体积为17 µL，包括5 µL胚胎裂解液以及下文所述的其余反应组分。 表2. 
	注意：胚胎裂解液占反应总体积的30%（体积/体积）。</li>
	<li>如果向翻译反应中添加重组蛋白，需将蛋白在20 mM HEPES-KOH（pH 7.4）中透析。根据样品体积和蛋白大小选择合适的透析盒体积和截留分子量。 
	注意：添加重组蛋白适用于研究翻译抑制因子或与起始因子相关的剂量依赖性实验。切勿将PBS加入翻译反应中使用的重组蛋白。蛋白样品或翻译反应体系中甘油浓度应保持在5%或以下。如有可能，避免在反应体系中添加甘油。</li>
	<li>将 mRNA 变性：在 65 °C 下加热 2 分钟，然后迅速置于冰上冷却 2 分钟，再进行后续操作 体外 翻译反应</li>
	<li>每种 mRNA 的翻译反应进行三个重复。反应体系设置如下：2.7 µL 反应混合液（表2) ＋ 5 µL 胚胎裂解液 ＋ mRNA（30 ng）＋ H2最终体积为0至17 µL。作为基础主混合液，请遵循以下步骤 单个反应的反应混合液 在 表2 并根据要进行的反应数量按比例放大。在25 °C下孵育反应60分钟。 
	注意：ATP 和 GTP 不需单独添加到此处所述的标准反应体系中。在我们的实验条件下，额外补充 ATP/GTP 并未提高萤光素酶（FLuc）的表达水平，反而降低了翻译效率。因此，该反应采用文中所述的能量再生系统进行。 表2 无需额外补充核苷酸。</li>
	<li>将热循环仪程序设置为：先在 4 °C 下孵育 5 分钟，随后在 25 °C 下反应 60 分钟，最后在 4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入20 µL预冷的1×被动裂解缓冲液以终止反应，将反应体系置于冰上继续孵育10分钟。</li>
	<li>将样品在 -20 °C 保存或直接进行荧光素酶定量。 
	注意：此处可暂停本实验方案。</li>
</ol>
6) 合成的荧光素酶的定量
<ol>
	<li>在定量FLuc活性前，将反应体系置于室温下20分钟。</li>
	<li>将每个翻译反应体系取10 µL，以及至少提前2小时准备的50 µL荧光素酶底物，恢复至室温。</li>
	<li>将荧光素酶底物加入翻译反应体系中，使用自动或手动发光仪记录相对光单位。设置发光仪每1秒采集一次读数，共采集10次。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.</li>
	<li>Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.</li>
	<li>Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.</li>
	<li>Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5&#8242;-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.</li>
	<li>Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.</li>
	<li>Zapata JM, Mart&#237;nez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.</li>
	<li>Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.</li>
	<li>Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.</li>
	<li>Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.</li>
	<li>Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5&#8242; and 3&#8242; UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.</li>
	<li>Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.</li>
	<li>V&#225;zquez-Pianzola P, Hern&#225;ndez G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.</li>
	<li>Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.</li>
	<li>Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.</li>
	<li>Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.</li>
	<li>Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.</li>
	<li>Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.</li>
	<li>Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.</li>
	<li>Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.</li>
	<li>Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.</li>
	<li>Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.</li>
	<li>Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.</li>
	<li>Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.</li>
	<li>Kr&#252;ger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.</li>
	<li>Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.</li>
	<li>Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.</li>
	<li>Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.</li>
	<li>Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.</li>
	<li>Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user&#8217;s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.</li>
	<li>Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

果蝇 用于无细胞体系的裂解液 体外 翻译 可获得可重复的结果不同发育时期的胚胎以及缓冲液成分的多种变化已被用于研究蛋白质合成及其合成机制中的一系列基本现象。表1）。在此，我们描述了一种适用于任何发育阶段胚胎的标准方法，可用于以精确且定量的方式开展研究（表1）。当建立某种突变体果蝇的大规模培养时，该方案可用于研究特定蛋白质或基因型的功能。此外，该方法也可用于任何种类的 果蝇 属，并利用其他蝇类或其他昆虫的属进行标准化，以用于比较和进化研究。这一点尤为重要，因为目前许多昆虫的基因组已可获取。
此处所述方法存在一些值得提及的局限性。如图所示， 图6，它比其他系统效率更低，例如兔网织红细胞和小麦胚芽的商业化工业裂解物。比较这些系统会很有趣 果蝇 与其他内部自制系统（如 酿酒酵母 或HeLa。另一方面，向其添加翻译后修饰 <e...

一个多世纪以来， 果蝇 已被证明是一种强大的、遗传上易于操作的模式生物，可用于研究多种生物学现象和分子，包括翻译调控和翻译机制1,2,3,4. 果蝇 无细胞 体外 翻译已成为研究蛋白质合成的有力工具，因为它能够重现许多观察到的事件 体内因此， 果蝇 是发现执行翻译及翻译调控的新功能与新分子的理想系统。早期研究建立了 体外，果蝇相关节肢动物中具有翻译能力的系统 卤虫 salina5 以及后续阶段 Drosophila hydei6.
随后，开发出了对外源mRNA有响应的裂解液 黑腹果蝇. 大多数关于 果蝇体外实验 已在不同年龄的胚胎中进行了翻译，尽管不同的研究团队使用了略有差异的翻译反应缓冲液。为便于比较，下文列出了所研究的不同现象及翻译反应条件。 表1除了胚胎外，无细胞的方案 体外 使用翻译 黑腹果蝇 卵母细胞10,22,23,24,25,26 以及已开发出培养的Schneider或Kc细胞裂解物17,27,28,29,30,31,32. 所需组件的说明 体外 翻译及对不同物种裂解液的比较详见参考文献33,34.
尽管mRNA翻译过程在真核生物中是保守的，但在不同分类群之间，翻译起始阶段存在显著差异，其中多种分子以分类群或物种特异性的方式在发育过程中抑制或促进翻译35,36该方案非常适合研究昆虫在整个发育过程中的mRNA翻译，而系统发育上相距较远的后生动物裂解物（包括小麦或兔来源的商业化裂解物）则无法用于此类研究。事实上，该方案能够重现胚胎发生过程中的翻译事件，而使用卵母细胞裂解物则无法实现这一目标。23迄今为止，尚未有针对胚胎、卵母细胞和培养细胞之间的比较研究 果蝇 系统已进行相关操作。向其添加翻译后修饰 体外 合成蛋白质的产量是本方案当前状态下的一个局限性。此外，与在细菌中表达重组蛋白的方法相比，该方法无法获得制备级别的蛋白产量。
在此，我们描述了常规大规模培养笼具的详细方案 果蝇 果蝇，制备合成mRNA模板，从胚胎制备具有翻译能力的裂解液，以及进行无细胞翻译 体外 翻译实验。该 材料表 显示了整个实验方案所需的试剂。

<table><tbody><tr><td>铝箔片</td><td>雷诺兹</td><td>N/A</td><td>标准家用铝箔；任何同等商用品牌均可接受。</td></tr><tr><td>氨基酸混合物</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>苹果醋</td><td>海因茨</td><td>N/A</td><td>市售苹果醋（5% 酸度）；任何等效品牌均可接受。</td></tr><tr><td>苹果或葡萄果汁</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>市售葡萄汁；或任何其他等效的市售品牌。</td></tr><tr><td>细菌学琼脂&amp;nbsp;</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>硼酸（H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>B6768</td><td>生物试剂，分子生物学级 &amp;ge;99.5%，粉末；用于制备TBE缓冲液。</td></tr><tr><td>加帽：抗反向加帽（ARCA）：3&amp;acute;-O-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;acute;)ppp(5&amp;acute;G型RNA帽结构</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>帽子：m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5')ppp(5')G RNA 帽结构类似物</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>帽：非功能性帽类似物 G(5&amp;acute;)ppp(5&amp;acute;A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>离心管（15 mL）</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>兔肌肉肌酸磷酸激酶</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>磷酸肌酸二钠盐</td><td>默克</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>脱水面包酵母&amp;acute;酵母</td><td>弗莱施曼的</td><td>N/A</td><td>商用活性干酵母；任何等效品牌均可接受。</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯&amp;nbsp;</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>D5758</td><td>97%（NNR）</td></tr><tr><td>DNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>黑腹果蝇野生型品系 Oregon-R</td><td>美国印第安纳州布卢明顿果蝇品系中心</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html；该保种中心还提供黑腹果蝇的突变品系，以及其他果蝇物种（如virilis、pseudoscura、grinshawi、hydei等）的野生型参考品系。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>E9884</td><td>ACS级试剂，99.4–100.6%，粉末；用于制备TBE缓冲液。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99.5%（滴定）</td></tr><tr><td>过氧化氢（H₂O₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>等同</td><td>N/A</td><td>市售（约2.5–3.5%过氧化氢溶液；任何等效品牌均可接受）。</td></tr><tr><td>体外转录 mMessage mMachine T7、T3 或 SP6 试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM1344 和 AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc，也称为 KCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;COO</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>若干</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lb 培养基（Lennox）</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>L3022</td><td>1 kg&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>荧光素酶检测系统</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7、T3 或 SP6 体外转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 和 AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，也称为 Mg(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;COO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>若干</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl（氯化钠）</td><td>J.T Baker&amp;nbsp;</td><td>B17W53</td><td>ACS试剂</td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>任何公司</td><td>N/A</td><td>序列特异性。</td></tr><tr><td>5倍被动裂解缓冲液</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200 微升黄色吸头</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1 ml 蓝色吸头</td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0.5-10 微升透明吸头</td></tr><tr><td>丙酸</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>79-09-04</td><td>ACS试剂级 &amp;ge;99.5%，液体。</td></tr><tr><td>PYREX&amp;reg; 5 mL 玻璃研杵组织研磨器</td><td>&amp;nbsp; PYREX&amp;reg;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprep 旋转质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>兔网织红细胞裂解液（RRL）</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>海肾荧光素酶（RLuc）检测系统</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNeasy minielute RNA 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>87735（然而，这取决于分子量截断值）。</td><td>N/A</td></tr><tr><td>次氯酸钠（漂白剂）</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>市售漂白剂（约5-6% NaOCl）；任何浓度相似的等效市售品牌均可接受。</td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>默克</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>不锈钢筛网</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>任何商业供应商。</td></tr><tr><td>Taq plus 精细 DNA 聚合酶</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>牛肝型tRNA（转运核糖核酸）XI型</td><td>默克/西格玛奥德里奇</td><td>9014-25-9 或 R4752</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris（Tris 碱）</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70145</td><td>分子生物学级粉末；用于制备TBE缓冲液。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SLBX9437</td><td>实验室级别</td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>N/A</td></tr><tr><td>无味明胶粉</td><td>诺克斯</td><td>N/A</td><td>市售无味明胶粉；任何等效品牌均可接受。</td></tr><tr><td>未精制甘蔗糖（piloncillo）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>商用墨西哥未精制全甘蔗糖；任何等效品牌均可接受。</td></tr><tr><td>载体：pBluescript SK 或 KS（+/-）</td><td>Stratagene</td><td>200301</td><td>N/A</td></tr><tr><td>载体：pGEM-T 或 pGEM-T Easy。&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600 和 A1360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>载体：InsTAclone PCR 克隆试剂盒中的 pTZ57 R/T 载体&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K1213 和 K1214</td><td>N/A</td></tr><tr><td>小麦胚芽提取物&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>L4380</td><td>N/A</td></tr><tr><td>XhoI 限制性内切酶&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ZymoPURE 质粒小提试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4212-B</td><td>N/A</td></tr><tr><td>仪器设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>设备名称</td><td>公司</td><td>货号</td><td>评论/描述</td></tr><tr><td>Accuris 分析天平</td><td>Accuris Instruments</td><td>W3100A-120</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Epoch 微孔板分光光度计</td><td>BioTek 仪器</td><td>BT7310043</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Finnpipette F2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>LH63501</td><td>100-1000 微升移液器</td></tr><tr><td>Finnpipette F2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4642080</td><td>20-200 微升移液器</td></tr><tr><td>Finnpipette F2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4642050</td><td>2-20 微升移液器</td></tr><tr><td>Finnpipette F2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4642010</td><td>0.2-2 微升移液器</td></tr><tr><td>Finnpipette F2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4642030</td><td>1-10 微升移液器</td></tr><tr><td>GloMax 20/20 发光仪</td><td>Promega</td><td>E5311</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Heratherm 培养箱 IMC 18</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50126464</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MaxQ 4450 台式轨道摇床</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SHKE4450</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MultiGene OptiMax 梯度PCR仪</td><td>Labnet International</td><td>TC9610</td><td>115V 型号</td></tr><tr><td>Prism R 制冷型微量离心机</td><td>Labnet International</td><td>C2500-R</td><td>配备24孔转子，115V</td></tr><tr><td>UVP MultiDoc-It 成像系统</td><td>UVP</td><td>UVP97019501</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

无细胞 体外 mrna 翻译在 黑腹果蝇 裂解液

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

无细胞 mRNA 体外 翻译在理解真核生物基因表达过程中蛋白质合成机制方面发挥了关键作用。不同体系来源的裂解液被广泛用于体外翻译研究，这对于解析翻译机器中大多数组分的功能以及揭示蛋白质合成过程的多个步骤至关重要。果蝇（Drosophila melanogaster）来源的裂解液已被用于研究翻译及翻译调控的多个方面。本文提供了制备合成 mRNA 模板、大规模培养活体果蝇、从果蝇胚胎中制备具有翻译活性的裂解液以及开展无细胞体外翻译反应的详细实验方案。该方案适用于果蝇属（Drosophila）的任何物种，包括黑腹果蝇（melanogaster）、virilis、pseudoobscura、grimshawi、hydei 等。我们进一步将本方案与其他翻译系统进行比较，并讨论其局限性、关键步骤及常见问题的解决方法。文中还包括代表性实验结果，以帮助评估该方案的性能与可重复性。最后，我们探讨了该技术在生物技术和科研领域的潜在应用。

我们进行了翻译反应，以分析使用0–12小时龄胚胎制备的六份独立裂解液（即生物学重复）之间的翻译效率差异。每个柱状图代表技术重复三次的结果（图5）。尽管存在一定变异，但观察到的翻译效率相似。我们还比较了不同日龄胚胎之间的翻译效率。因此，我们检测了来自0–2小时龄、0–12小时龄和0–18小时龄胚胎的裂解液，并进行了生物学重复，即使用独立制备的裂解液（图6）。我们发现，来自0–2小时龄胚胎的裂解液产生的FLuc活性最低，而来自0–18小时龄胚胎的裂解液产生的FLuc活性最高。最后，我们将黑腹果蝇（Drosophila）0–18小时龄胚胎裂解液的翻译效率与其他物种进行了比较。我们测试了来自兔网织红细胞和小麦胚芽的商用裂解液（图7）。由于兔网织红细胞和小麦胚芽的反应体系中含有70%（v/v）的裂解液，而果蝇体系含有30%（v/v）的裂解液，因此我们对所有样品均测试了含有30%或70%裂解液体积的反应体系，mRNA用量为30 ng，反应时间为1.5小时...

在此，我们提供有关如何制备裂解液并进行后续操作的详细步骤。 体外 使用翻译 果蝇 胚胎

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无细胞mRNA体外翻译在理解基因表达过程中蛋白质合成机制方面发挥了关键作用，贯穿于……

本研究采用果蝇无细胞翻译系统，研究昆虫发育各个阶段的蛋白质合成及翻译调控机制。该方案能够准确重现昆虫发育过程中特有的体内翻译事件，而不同于远缘后生动物的裂解物系统。首先，打开 Benchling 克隆软件。选择一个合适的质粒，用于插入包含5'非翻译区、萤光素酶（firefly luciferase，Fluc）报告基因顺反子、3'非翻译区以及位于T7启动子下游的多聚腺苷酸（polyadenylate或poly(A)）尾的表达框。在poly(A)尾下游紧接的KPN1特异性限制性酶切位点处进行酶切，以线性化各个质粒构建体，用于后续体外转录。在将构建体用作体外转录模板之前，需通过测序验证其序列，确保获得清晰、分辨良好的峰图结果。将线性化的 DNA 在 100 伏电压下通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分离 1 小时。从凝胶中回收线性化 DNA，将其放入微量离心管中，并加入琼脂糖消化缓冲液（ADB）用于 DNA 纯化。将试管置于恒温振荡器中孵育。然后将内容物转移至纯化柱中，离心以回收线性化DNA。根据生产商说明书，使用体外转录试剂盒对线性化DNA进行转录。加载热循环仪并选择合适的程序。转录完成后，用无RNase的DNase处理所有转录反应，以去除DNA模板。按照制造商说明书，使用氯化锂沉淀法纯化转录产物。通过光谱法对纯化的转录产物进行定量。使用1%琼脂糖凝胶电泳在100伏电压下电泳1小时，评估信使RNA（mRNA）的完整性。将mRNA分装后于-80°C保存，直至使用。为了培养参考品系黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）野生型菌株Oregon-R，在上部设置一个长约1米、直径约50厘米的圆柱形丙烯酸笼，笼顶留一个直径约30厘米的开口。用网纱覆盖顶部开口，并用胶带在四边密封固定。在网纱上方放置湿润的纸巾，为果蝇提供水分，并每天更换一次。保持笼子前部敞开并用织物覆盖以方便操作。从扩增的果蝇品系中，将约 1,000 只年轻果蝇放入笼内，在 22 至 25 摄氏度条件下培养。制备饲料时，先在产卵用的果汁平板上加入一勺水合的酿酒酵母，然后均匀地加入 200 µL 醋。小心地将喂养板从笼子的前部开口插入，并密封织物以防止果蝇逃逸。为收集胚胎，需将培养板从笼中取出。配制胚胎裂解缓冲液，并将一毫升分装液储存于负80摄氏度条件下。使用筛子收集胚胎，然后用自来水充分清洗，再用含有0.9%氯化钠和0.03%Triton X100的胚胎缓冲液洗涤。将胚胎置于含50%胚胎缓冲液和50%家用漂白剂的溶液中脱膜处理5分钟。用自来水充分清洗胚胎，然后用纸巾吸干并称重。将收集的胚胎转移至冰上的玻璃组织研磨器中。每克胚胎加入一毫升胚胎裂解缓冲液。在冰上研磨20次，使胚胎充分匀浆。将匀浆转移至1.5毫升微量离心管中。在4°C条件下，以15,900 G离心20分钟。在冰上收集界面层，每份50微升

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

果蝇裂解液中的无细胞体外mRNA翻译

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

本文介绍了从黑腹果蝇（Drosophila）头部提取和纯化mRNA及代谢物的操作步骤。我们正在应用这些技术以更深入地理解神经元变性过程中潜在的细胞紊乱机制。这些方法可轻松进行规模调整，并适用于其他“组学”研究项目。...

转录本和代谢物的纯化 果蝇 头部

本出版物旨在对从黑腹果蝇（Drosophila...

果蝇（Drosophila Melanogaster）中微小RNA种类的增强型Northern印迹检测

蛋白质合成的调控主要发生在翻译起始阶段，该过程的缺陷与多种疾病相关。为了更好地理解这些疾病的病因，本文描述了一种利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞评估在翻译起始因子 eIF4G1 突变体存在条件下 mos...

Xenopus laevis 作为鉴定翻译障碍的模型

翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification,...

稀有细胞群体的核糖体亲和纯化技术（TRAP-rc） 黑腹果蝇 胚胎

本实验方案的目的是提供一种简单且低成本的方法，用于中等规模（0.5–1...

中等规模制备 果蝇 用于蛋白质组学实验的胚胎提取物

本文描述了一种用于回收内源性形成的mRNA-蛋白质复合物的串联RNA分离流程（TRIP）。具体而言，首先在活体（in...

一种基于寡核苷酸的串联RNA分离方法以回收真核生物mRNA-蛋白质复合物

本文介绍了一种利用分子信标、转盘共聚焦显微镜和开源分析软件，在活体黑腹果蝇（Drosophila...

在活细胞中可视化与追踪内源性 mRNA 黑腹果蝇 卵室

本文概述了在果蝇中使用靶向RNA的Cas13D酶（RfxCas13D）的详细实验方案。...

普遍性与组织特异性RNA靶向 黑腹果蝇 使用 CRISPR/CasRx

Drosophila 转基因的胚胎显微注射

学习利用黑腹果蝇胚胎裂解液进行无细胞体外mRNA翻译的技术方法，用于研究蛋白质合成与翻译调控机制。该方案适用于多种果蝇物种，为发育生物学和生物技术研究提供可靠工具。

无细胞体外 mRNA 翻译在黑腹果蝇裂解液

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