利用CRISPR/Cas9介导的内源性荧光标记技术标记生殖系特异性基因 秀丽隐杆线虫

我们利用基于CRISPR的内源性标记技术研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖系蛋白的定位与动态。传统的转基因可能会影响生殖系的表达，而本方案在内源位点、天然调控条件下对蛋白进行标记。首先，利用公共数据库和已发表的文献，鉴定在性腺或生殖细胞中主要表达的候选基因。

打开目标蛋白的 UniProt 条目后，点击“结构”以评估结构特征和蛋白结构域，并确定合适的荧光标记位点。向下滚动并打开 AlphaFold DB 条目以验证模型置信度值。点击“结构域”以获取具体的结构分类信息。

接下来，在 WormBase 中打开目标基因页面。向下滚动并点击“Sequences”模块中的主要转录本链接，以打开转录本页面。继续向下滚动至“Sequences”部分，点击特定选项以显示所选转录本的拼接序列。

在 IDT CRISPR-Cas9 向导 RNA 设计工具网页中，从 WormBase 页面复制目标基因的第一外显子序列，并在物种下拉菜单中选择 C. elegans，以进行向导 RNA（gRNA）设计。点击 DESIGN 按钮，获取并查看系统推荐的最佳 gRNA 序列及其对应的 PAM 序列。在 SnapGene 中，选择 Sequence 以确定 CeU6 启动子与 gRNA 骨架区域之间的克隆位点。

从 IDT 工具页面复制 gRNA 序列，将其粘贴到插入对话框中，然后单击“插入”以将间隔序列整合到 CRISPR 表达质粒中。为确认 gRNA 插入的准确性，选择序列并单击“显示比对”，将 Sanger 测序结果与预期序列进行逐碱基比对。为构建供体质粒，从 WormBase 复制同源臂的基因组序列。

在 SnapGene 中，粘贴序列并点击插入。接着，右键单击插入位点以打开“设置 DNA 颜色”窗口，并将其更改为橙色以标记连接处。复制绿色荧光蛋白或 GFP 插入序列，并直接粘贴到标记位置。

然后点击“添加元件”。将该元件命名为GFP，将其显示颜色更改为绿色，然后点击“确定”以完成体外模拟供体质粒的构建。

为了在整合后防止 Cas9 再次切割，需在供体质粒模板中引入一个同义替换。从表达载体中复制 19 个核苷酸的 gRNA 间隔序列。在供体质粒标签页中，将该序列粘贴至“查找 DNA 序列”搜索栏以定位靶位点，并选择特定的核苷酸位置进行突变。在“替换碱基”中输入新的核苷酸，然后点击“插入”。

右键单击修饰后的碱基，使用“设置 DNA 颜色”将其颜色更改为红色。将供体质粒的 Sanger 测序结果与预期序列比对，以确认其完整性。通过将 CRISPR 表达质粒、供体质粒和共注射标记物加入无菌双蒸水中，配制注射混合液，最终体积为 10 µL，浓度如所示。

然后以 10,000 g 离心 10 至 20 分钟，使颗粒物质沉淀，防止微注射毛细管堵塞。使用拉针仪从玻璃毛细管拉制微注射针，使其具有适合性腺注射的长锥形和尖锐尖端，并根据经验优化极性设置。加热微量毛细移液管，折断成两段，制成加样工具。

将橡胶吸球连接到截短的微毛细移液管的宽端。用加样器吸取约一微升注射混合液。将加样器插入注射针的后端，并轻轻排出注射混合液。

将装样后的针头水平放置10分钟，以形成连续的液柱，并使溶液沉降至针尖。将针头安装到显微注射镜上，使用明场光学系统对准针尖并调至清晰。在卤代烃油中，通过针尖与盖玻片边缘轻轻接触以打开针尖，随后确认液体流动通畅。

为了培养用于注射的线虫，将N2野生型线虫维持在接种了OP50细菌的培养基平板上。从生长良好的平板中挑选处于L4阶段的雌雄同体线虫，在20摄氏度下孵育10小时，以获得生殖系发育良好的年轻成虫。将线虫转移至未接种细菌的平板，以减少细菌的携带污染。

在玻璃载玻片上制备一块干燥的2%琼脂糖垫。滴加一滴卤代烃油。使用睫毛挑取工具将线虫转移至琼脂糖垫上并使其固定。

使用低倍物镜定位性腺以进行注射。利用显微操作仪控制装置，将注射针置于与线虫成20至40度角的位置。使用高倍镜聚焦于远端生殖系。

将线虫推进至针尖，并将针尖置于性腺合胞体内。注入溶液直至性腺膨胀。撤出针头，重新定位以进行后续注射。

加入 M9 缓冲液以软化并部分破坏琼脂糖垫，从而释放线虫。将每只线虫转移至单独的恢复平板中。随后对 20 到 25 只线虫重复进行注射。

通过共注射标记物筛选F1代子代，并挑选标记物阳性的个体。将每条F1线虫转移至单独的培养板，静置一至两天以产卵。用蛋白酶K缓冲液裂解每条F1线虫，制备PCR模板。

使用一个位于同源臂外侧的基因组引物和一个内部标签引物进行连接PCR。保留PCR阳性F1个体对应的培养板。将PCR阳性F1品系的F2后代分离至单独的培养板，以获得子代。

裂解成虫用于基因分型。使用跨越同源臂的引物进行PCR，通过扩增产物大小区分野生型和敲入等位基因。使用SnapGene工具将Sanger测序结果与预期的编辑后基因组序列比对，以验证左右插入位点处的正确整合。

使用荧光显微镜验证生殖系表达及定位。扩增已确认的纯合品系。保种并冷冻保存经验证的品系以长期储存。

对F1代子代进行基于PCR的筛选，通过使用一个侧翼基因组引物和一个GFP内部引物扩增出1,550个碱基对的连接区PCR产物，鉴定出成功的基因敲入事件。大多数F1动物中未检测到1,550碱基对的条带，表明无目标位点整合，符合非整合性DNA传递而非同源定向修复的特征。通过对连接区PCR阳性品系的F2代子代进行纯合度鉴定，可根据条带大小区分等位基因：1,345个碱基对为野生型等位基因，2,344个碱基对为敲入等位基因。

杂合子显示两条条带。纯合敲入样本缺少野生型大小的条带，而整合失败的样本仅显示野生型大小的产物。对纯合GFP敲入品系的进一步验证通过共聚焦显微成像完成，观察到生殖系细胞中GFP荧光信号在生精区域富集。

该方案可实现对秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖系中蛋白质定位和动态的活体分析。精确的标签设计和充分的验证对于保持蛋白质功能并最大限度减少假阳性候选结果至关重要。未来的研究可利用此工作流程追踪蛋白质定位，并探索生殖系发育过程中的潜在相互作用。