Name: 拟南芥核单分子定位显微镜的简化方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-08T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习拟南芥核单分子定位显微镜的简化方案，用于植物细胞生物学研究。该方法利用dSTORM技术实现染色质结构的高分辨率可视化，为研究表观遗传调控和核拓扑学提供可靠的技术基础。

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我们感谢Janelia研究所Lavis实验室和开放化学团队慷慨提供JF和JFX染料。我们还衷心感谢Elizabeth Kracik-Dyer和Célia Baroux分享其实验方案，以及Aline Probst和Guillermo Orsi提供的宝贵建议。光学成像在格勒诺布尔Instruct-ERIC中心（ISBG；UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL）的M4D成像平台完成，该平台隶属于格勒诺布尔结构生物学合作伙伴关系，并得到法国集成结构生物学基础设施（ANR-10-INBS-0005-02）和格勒诺布尔集成结构生物学联盟的支持。 &amp;#38; 细胞生物学实验室卓越计划（Labex），该项目隶属于格勒诺布尔阿尔卑斯大学研究生院（研究型大学学院，CBH-EUR-GS，ANR-17-EURE-0003）。我们感谢代尔夫特理工大学应用科学学院成像物理系（ImPhys）开发的AnalyzeFRC Python软件包，作者为Tip ten Brink。

注意：本实验方案中所用材料与仪器的详细信息可参见 材料表除非另有说明，缓冲液均需通过无热原的0.2 µm滤器过滤除菌。双蒸超纯H2O (ddH₂O)2本方案全程使用 O)。离心步骤均在 1.5 mL 微量离心管中，采用固定角转子进行。
1. 幼苗固定与细胞核释放
<ol>
	<li>在通风橱内将6孔培养板置于冰上，然后向每孔加入约4 mL在通风橱中新鲜配制的冰冷固定液（4% (v/v) 甲醇稳定的甲醛，0.1% Triton X-100 溶于1×磷酸盐缓冲盐水[PBS]中）。</li>
	<li>使用洁净镊子取出在固体（0.8%琼脂）半强度Murashige和Skoog培养基（2.2 g/L MS盐，1%蔗糖(w/v)，pH 5.7）上生长的幼苗（萌发后8至15天），参照文献24中MS幼苗的描述方法培养，并立即将其浸入固定液中。每孔用于处理约20株幼苗（每个样品需使用3孔以获得足够材料）。</li>
	<li>将培养板放入装有冰的真空室中，施加0.2 bar至0.8 bar之间循环变化的真空压力，持续15分钟，以去除组织内 trapped 的空气，使固定液充分渗透植物组织25。缓慢释放真空，轻轻搅动样品，再重复抽真空15分钟。</li>
	<li>在通风橱中用移液器吸除固定液，每孔用5 mL冰冷PBS在轻柔振荡条件下洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>吸除PBS，用镊子将固定后的组织转移至一个120 mm × 120 mm的培养皿中。向固定幼苗中加入50 µL核分离缓冲液（NIB），其配制方法由Kracik-Dyer和Baroux描述（45 mM MgCl2，20 mM MOPS，30 mM柠檬酸钠，0.3% Triton X-100，用1 N HCl调节至pH 7.0）19。用刀片切碎组织。 
	注意：对于此操作，切片机刀片比常规剃须刀片更有效。</li>
	<li>用同一刀片将切碎的组织刮至培养皿的一侧，并加入600 µL NIB，确保将粘附在刀片上的所有组织冲洗下来。</li>
	<li>将组织悬液转移至2 mL Dounce匀浆器管中，先用小号研杵研磨5–10次，再用大号研杵研磨5–10次，直至匀浆物在管内顺畅流动（通常各需5–10次 strokes）。</li>
	<li>将匀浆后的样品通过30 µm滤网过滤至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将悬液在800 × g 条件下离心10分钟，加减速均使用最低梯度。离心后可在绿色组织碎片中观察到少量白色沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用150 µL NIB重悬。</li>
	<li>再次在800 × g 条件下离心10分钟，弃去上清液。若仍有可见绿色碎片，可再洗涤一次。根据沉淀体积，用50 µL至150 µL NIB重悬。</li>
	<li>将最终获得的分离核悬液于4 °C保存，最多可保存1周后再进行染色。但建议立即进行后续操作。</li>
</ol>
2. （免疫）染色
注意：在以下步骤中，该方案适用于 50 µL 的细胞核悬液，通常对应 20 株幼苗。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。
<ol>
	<li>将溶液在 800 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。注意不要触碰沉淀。</li>
	<li>用 50 µL 封闭缓冲液（含 143 mM NaCl、4% BSA 的 PBS，4 °C 保存）通过轻柔吹打重悬细胞核。在轻柔振荡条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>将溶液在 800 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，注意不要触碰细胞核沉淀。</li>
	<li>用 50 µL 1× PBS 通过轻柔吹打重悬细胞核。再次在 800 × g 条件下离心 10 分钟。按上述方法弃去上清液。</li>
	<li>将细胞核重悬于 50 µL 一抗溶液中，该溶液用免疫染色缓冲液配制，缓冲液成分为含 143 mM NaCl、1% BSA、0.05% Tween 20 的 PBS（抗体种类及工作稀释比例详见材料表）。在轻柔振荡条件下孵育 60 分钟。</li>
	<li>进行两次洗涤（重复步骤 2.3 和 2.4）。</li>
	<li>将细胞核重悬于 50 µL 以 1/200 稀释度配制的山羊抗兔 AF647 二抗溶液中26。用铝箔包裹管子以避免荧光染料暴露于光照。在轻柔振荡条件下孵育 60 分钟。</li>
	<li>进行两次洗涤（重复步骤 2.3 和 2.4）。</li>
	<li>将沉淀重悬于 50 µL NIB 中。将悬液储存于 1.5 mL 微量离心管中，并用铝箔包裹。标记后的样品在 4 °C 可稳定保存数周。</li>
</ol>
3. 封片
<ol>
	<li>进行STORM成像时，通过将低熔点琼脂糖粉末溶解于1.25×缓冲液B（含50 mM Tris pH 8、10 mM NaCl、10%葡萄糖）中，配制1.5%（w/v）的低熔点琼脂糖溶液（LMA）。配制1.25×储存液，并于4 °C保存。</li>
	<li>在90 °C加热1分钟以完全溶解粉末，获得澄清溶液。冷却后，将熔化的LMA溶液维持在37 °C，待进行下一步操作，以避免葡萄糖氧化酶（GLOX）缓冲液中的酶受热变性（配制10×储存液，组成为100 mM Tris pH 7.5、25 mM KCl、1 mM TCEP pH 7.0、5 mg/mL葡萄糖氧化酶、0.4 mg/mL过氧化氢酶、50% v/v甘油，于-20°C保存）。</li>
	<li>当LMA溶液温度降至37 °C后，向温热的LMA溶液中加入100 mM巯基乙胺（MEA）和GLOX缓冲液，使终浓度为1×，配制成STORM缓冲液。MEA的1 M储存液可在4 °C保存最多1个月，但建议使用新鲜配制的溶液。轻轻混匀。 
	注意：如需进行可选的DNA标记，可加入JF549标记的Hoechst染料（终浓度1.5 nM，以DMSO配制的1 mM储存液），混匀后保持悬浮液于37 °C直至使用。</li>
	<li>将细胞核悬浮液与纳米金刚石颗粒按1/1500稀释比例轻柔混合，与样品共同孵育5分钟。 
	注意：纳米金刚石颗粒作为定位标记物，用于校正样品漂移。</li>
	<li>取10 µL混合液滴加至经臭氧处理的1.5H盖玻片（在紫外臭氧清洗仪中处理20分钟），静置3分钟，使细胞核沉降附着于盖玻片表面。</li>
	<li>吸除多余液体，静置2分钟。向盖玻片上添加10 µL步骤3.3中配制的LMA溶液，立即加盖载玻片封片。</li>
	<li>使用硅酮密封剂密封盖玻片。在小型培养皿中，用移液器吸头取等量的溶液A和溶液B混合均匀，将混合物涂抹于盖玻片边缘，以密封样品。硅酮密封剂在5分钟内即可固化。</li>
	<li>封片完成后应立即进行载玻片成像，最迟不超过4–5小时内完成，以避免封片介质中氧气清除系统的活性丧失。</li>
</ol>
4. 成像
注意：成像参数必须根据样本特性、荧光染料的光物理性质以及显微镜的光学配置进行仔细优化。确保每种荧光染料具有高信噪比的同时，应尽量减少荧光通道之间的光谱串扰和交叉激发。实验中使用配备高数值孔径（NA）100倍油浸物镜、焦点维持装置以及用于明场成像的白色LED的倒置荧光显微镜观察样本。荧光标记物AlexaFluor647（AF647）在640 nm激发，JF549-Hoechst在561 nm激发。发射光通过匹配的二向色镜和带通滤光片进行过滤，最终由科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机采集图像。
<ol>
	<li>安装样品载玻片并找到焦平面。如果系统具备自动防漂移模块，请将其激活（长时间采集时强烈推荐使用）。</li>
	<li>寻找并聚焦于细胞核。最好在目标细胞核附近存在一个或少数几个纳米金刚石，以便在重建过程中更高效地校正漂移。</li>
	<li>（可选）在低激光功率下，对明场图像及各荧光通道拍摄衍射极限下的快照图像。</li>
	<li>进行双色成像时，应先采集长波长通道，再切换至短波长通道（例如，先采集 AF647 通道，再采集 JF549 通道）。 
	注意：本研究中使用的成像参数示例如下： 
	通道 A — 表位标记 — AF647 
	曝光时间：20 ms 
	激光强度：640 nm – 2.2 kW/cm2 
	激发模式：HiLo27 
	通道 B — DNA 标记 — JF549-Hoechst 
	曝光时间：50 ms 
	激光强度：561 nm – 1 kW/cm2 
	激发模式：Epi 
	记录图像数量：每通道 10,000–30,000 张，确保每帧中荧光分子密度足够稀疏，以实现精确的单分子定位；同时，累积定位数量通过超分辨率定量图像评分与误差位置报告（SQUIRREL）28 进行经验性评估，该方法也可指示所需足够的帧数。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128 (4), 787-800 (2007).</li><li>Rowley, M. J., Corces, V. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+3D+genome+architecture.">Organizational principles of 3D genome architecture.</a> Nat Rev Genet. 19 (12), 789-800 (2018).</li><li>Fransz, P., de Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li><li>Tessadori, F., Chupeau, M. C., Chupeau, Y., Knip, M., Germann, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+dissociation+and+sequential+reassembly+of+pericentric+heterochromatin+in+dedifferentiated+Arabidopsis+cells.">Large-scale dissociation and sequential reassembly of pericentric heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells.</a> J Cell Sci. 120 (7), 1200-1208 (2007).</li><li>Caballero, L., Pasternak, T., Riyazuddin, R., P&#233;rez-P&#233;rez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+high-resolution+3D+chromatin+maps+with+cell+division+and+cell+differentiation+at+the+root+apical+meristem.">Connecting high-resolution 3D chromatin maps with cell division and cell differentiation at the root apical meristem.</a> Plant Cell Rep. 43 (10), 232 (2024).</li><li>Pavlova, P., van Zanten, M., Snoek, B. L., de Jong, H., Fransz, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+morphometric+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+nuclei+reveals+characteristic+profiles+of+different+cell+types+and+accessions.">2D morphometric analysis of Arabidopsis thaliana nuclei reveals characteristic profiles of different cell types and accessions.</a> Chromosome Res. 30 (1), 5-24 (2022).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+structured-illumination+microscopy:+Wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution.">Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett, OL. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy.">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt Lett, OL. 24 (14), 954-956 (1999).</li><li>Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Quantitative Single-Molecule Localization Microscopy.</a> Annu Rev Biophys. 52, 139-160 (2023).</li><li>Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Heilemann, M., van de Linde, S., Sch&#252;ttpelz, M., Kasper, R., Seefeldt, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Ricci, M. A., Manzo, C., Garc&#237;a-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fibers+are+formed+by+heterogeneous+groups+of+nucleosomes+in+vivo.">Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo.</a> Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Jin, J., Uttam, S., Fu, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+higher-order+chromatin+structures+at+different+epigenomic+states+in+single+mammalian+cells.">Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells.</a> Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).</li><li>Nozaki, T., Imai, R., Tanbo, M., Nagashima, R., Tamura, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organization+of+chromatin+domains+revealed+by+super-resolution+live-cell+imaging.">Dynamic organization of chromatin domains revealed by super-resolution live-cell imaging.</a> Molecular Cell. 67 (2), 282-293.e7 (2017).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+in+plant+cell+imaging.">Super-resolution microscopy in plant cell imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Kracik-Dyer, E., Baroux, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+STED+Imaging+of+isolated+Arabidopsis+thaliana+nuclei.">3D STED Imaging of isolated Arabidopsis thaliana nuclei.</a> Methods Mol Biol. 2873, 263-280 (2025).</li><li>Gaifas, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+live+fluorescence+imaging+with+in+situ+cryoelectron+tomography+sheds+light+on+the+septation+process+in+Deinococcus+radiodurans.">Combining live fluorescence imaging with in situ cryoelectron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 122 (19), e2425047122 (2025).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+time-lapse+microscopy.">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated time-lapse microscopy.</a> J Vis Exp. (53), e3145 (2011).</li><li>Vauclare, P., Wulffel&#233;, J., Lacroix, F., Servant, P., Canfalonieri, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+nucleoid+remodeling+in+Deinococcus+radiodurans+is+associated+with+major+changes+in+Heat+Unstable+(HU)+protein+dynamics.">Stress-induced nucleoid remodeling in Deinococcus radiodurans is associated with major changes in Heat Unstable (HU) protein dynamics.</a> Nucleic Acids Res. 52 (11), 6406-6423 (2024).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+&#8211;+Applications+in+plant+cell+research.">Super-resolution microscopy &#8211; Applications in plant cell research.</a> Front Plant Sci. 8, 531 (2017).</li><li>Carles, C. C., Ha, C. M., Jun, J. H., Fiume, E., Fletcher, J. C., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Shoot+Apical+Meristem+Development.">Analyzing Shoot Apical Meristem Development.</a> Plant Developmental Biology: Methods and Protocols. , 105-129 (2010).</li><li>Chincinska, I. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+infiltration+in+plant+science:+old+method,+new+possibilities.">Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities.</a> Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).</li><li>Tse-Kang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+immunity+in+C.+elegans+is+activated+by+pathogen+effector-triggered+aggregation+of+the+guard+protein+TIR-1+on+lysosome-related+organelles.">Intestinal immunity in C. elegans is activated by pathogen effector-triggered aggregation of the guard protein TIR-1 on lysosome-related organelles.</a> Immunity. 57 (10), 2280-2295.e6 (2024).</li><li>Lim, D., Ford, T. N., Chu, K. K., Mertz, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optically+sectioned+in+vivo+imaging+with+speckle+illumination+HiLo+microscopy.">Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy.</a> J Biomed Opt. 16 (1), 016014 (2011).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mapping+and+minimization+of+super-resolution+optical+imaging+artifacts.">Quantitative mapping and minimization of super-resolution optical imaging artifacts.</a> Nat Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+mutations+in+histone+H3.3+illuminate+the+functional+significance+of+H3K4+methylation+in+plants.">Single amino acid mutations in histone H3.3 illuminate the functional significance of H3K4 methylation in plants.</a> Nat Commun. 16 (1), 4408 (2025).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plugin+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plugin for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Van Heel, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+measures+between+images.">Similarity measures between images.</a> Ultramicroscopy. 21 (1), 95-100 (1987).</li><li>Loureiro, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+plant+nuclei+for+estimation+of+nuclear+DNA+content:+Overview+and+best+practices.">Isolation of plant nuclei for estimation of nuclear DNA content: Overview and best practices.</a> Cytometry Part A. 99 (4), 318-327 (2021).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).</li><li>Duncan, S., Olsson, T. S. G., Hartley, M., Dean, C., Rosa, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detecting+single+mRNA+molecules+in+Arabidopsis+thaliana.">A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12, 13 (2016).</li><li>Gutzat, R., Mittelsten Scheid, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+chromatin+and+RNA+from+rare+cell+types+with+fluorescence-activated+nuclear+sorting+(FANS).">Preparing chromatin and RNA from rare cell types with fluorescence-activated nuclear sorting (FANS).</a> Methods Mol Biol. 2093, 95-105 (2020).</li></ol>

作者声明无利益冲突。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞核用于单分子定位显微镜（SMLM）观察前的制备过程包含多个关键步骤，这些步骤对最终样品的质量具有重要影响。如先前所述19,35，彻底且一致的组织切碎对于最大限度地回收完整细胞核至关重要。使用切片机刀片代替标准剃须刀片可实现更清洁、更均匀的组织破碎，从而提高细胞核的释放效率。随后的洗涤和离心步骤对于减少碎片同样重要。这些操作需谨慎进行，先用200 µL移液器缓慢吸除上清液，再用10 µL移液器进一步吸取残留上清，以尽量减少细胞核的损失。当沉淀物特别紧密时，将NIB缓冲液的重悬体积增加至200–250 µL有助于防止聚集，并确保获得更均匀的悬浮液。
可选的改进步骤可进一步提高样品纯度和成像质量。在最终洗涤前进行短暂的超声处理，可去除碎片并分散聚集的细胞核19；然而，过度超声可能损伤核膜。此外，成像缓冲液可在真空条件下脱气以去除溶解氧，这有助于改善荧光染...

显微镜技术长期以来一直是研究染色质组织和细胞核结构的核心手段，揭示了DNA及组蛋白相关蛋白如何在三维细胞核空间中排列，并影响基因调控。1,2传统的荧光显微镜技术为研究染色质的大尺度结构域（如染色体领地、染色中心和核体）提供了重要的见解3,4，可行的 原位，特别是对于植物的根组织3,5,6然而，这些技术从根本上受到光的衍射极限的限制，其空间分辨率横向约为200 nm，轴向约为500 nm7这一局限性掩盖了染色质折叠、组蛋白修饰模式以及转录区室化等表观遗传调控背后的纳米级细节。为突破这一障碍，可采用超分辨率显微镜（SRM）技术，例如结构照明显微镜（SIM）8，受激发射损耗（STED）9,10以及单分子定位显微镜（SMLM）11,12 分辨率从100 nm到几纳米不等13.
在SRM技术中，单分子定位显微镜（SMLM）——包括光激活定位显微镜（PhotoActivated Localization Microscopy, PALM）13和直接随机光学重建显微镜（dSTORM）——兼具卓越的空间分辨率和分子特异性14。通过随时间检测单个荧光分子的位置，SMLM可在单细胞中重建染色质结构域、组蛋白修饰标记及核结构的高精度纳米级图像15,16。这一能力已深刻改变了哺乳动物体系中的染色质研究，SMLM已被用于以前所未有的细节可视化核小体聚集、染色质压缩状态以及组蛋白修饰模式15,16,17。相比之下，SMLM在植物细胞核中的应用仍较为有限，主要受限于植物组织特性带来的技术挑战，例如强烈的自发荧光、细胞壁的刚性，以及淀粉和叶绿素等导致光散射的化合物的存在18。此外，在细胞核的分离与标记过程中，其结构极为脆弱，需要优化的操作流程以维持结构完整性，并在长时间成像过程中最大限度地降低背景荧光。
本文所述方案最初由 Elizabeth Kracik-Dyer 和 Célia Baroux 为受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）显微镜技术开发19，随后结合已发表的微生物学应用中的相关知识进行了优化和调整，以满足STORM成像的特定需求20,21,22。该方法的总体目标是为分离的Arabidopsis thaliana细胞核提供一种简洁且可重复的单分子定位显微镜（SMLM）成像工作流程。通过整合优化的固定、温和的机械破碎以及在悬浮状态下进行荧光染料标记，该方法在有效去除常影响成像质量的细胞质污染物的同时，保持了细胞核的形态完整性。将标记后的细胞核固定在低熔点琼脂糖垫上，可在图像采集过程中确保机械稳定性，从而实现纳米级精度的长期单分子成像。与先前报道的植物细胞核超分辨显微成像（SRM）方案——特别是基于STED显微镜的方法19,23——相比，本工作流程采用光可切换荧光染料（如AF647、JF549），并通过洗涤步骤去除叶绿素和组织碎片，显著降低了背景荧光；同时，将标记分子直接加入已固定并通透化的细胞核中，提高了标记的均一性。因此，该方法能够稳定地可视化单个细胞核中的染色质修饰、核区室结构以及表观遗传模式。通过降低在植物中实施SMLM的技术门槛，该方法拓展了纳米级成像技术的可及性，并为研究染色质组织和核结构如何响应发育与环境信号调控基因表达提供了基础。

<table><tbody><tr><td>抗RNA聚合酶II CTD重复序列YSPTSPS（磷酸化S2）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5095</td><td>免疫染色缓冲液中以1/200稀释度使用的初级抗体，用于可视化聚合酶的活性形式（兔源多克隆抗体）</td></tr><tr><td>采集软件</td><td>Abbelight</td><td>NEO LiveImaging v2.18</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>认证低熔点琼脂糖</td><td>Bio-Rad</td><td>1613111</td><td></td></tr><tr><td>1.5H圆形盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>117640</td><td>&amp;Oslash;：24 mm</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖，无水，99%</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16828-36&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>Di03-R405/488/561/635-t1</td><td>用于激发光与发射光分离的二向色镜</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液 10&amp;acute;</td><td>biowest</td><td>X0515 - 500&amp;nbsp;</td><td>在无菌条件下操作</td></tr><tr><td>Epredia超薄一次性切片刀片</td><td>FisherScientific</td><td>12191830</td><td>低剖面，一次性使用</td></tr><tr><td>Falcon 6孔透明平底TC处理多孔细胞培养板，带盖</td><td>&amp;nbsp;Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液 37%</td><td>Carl Roth</td><td>7398</td><td>在通风橱中操作</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>VWR</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 647标记</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32733TR</td><td>以1/200稀释度用作与AF647偶联的二抗</td></tr><tr><td>Hoechst 33258溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94403</td><td>以1/500稀释度用于DNA复染，加入琼脂糖垫中</td></tr><tr><td>盐酸溶液</td><td>Chem-Lab</td><td>CL05.0311.1000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>JF549-Hoechst</td><td>Lavis实验室和Open Chemistry团队（Janelia）</td><td>JF549-Hoechst</td><td>用于DNA复染，以1.5 nM终浓度加入琼脂糖垫中</td></tr><tr><td>KIMBLE Dounce组织研磨器套装</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>2 mL研磨管，配有大间隙（0.0030–0.0050英寸）和小间隙（0.0005–0.0025英寸）研杵</td></tr><tr><td>激光器单元</td><td>Oxxius</td><td>L6Cc</td><td>配备六种激光器：405 nm - 100 mW，488 nm - 200 mW，532 nm - 500 mW，561 nm - 300 mW，640 nm - 500 mW 和 730 nm - 30 mW</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Carl Roth</td><td>HN03</td><td></td></tr><tr><td>巯基乙胺（MEA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>MOPS钠盐 98%</td><td>Fisher Scientific SAS</td><td>352590010</td><td></td></tr><tr><td>多波段发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/523/600/677</td><td>多波段发射滤光，用于阻断激光散射光</td></tr><tr><td>纳米金刚石</td><td>Adamas Nanotechnologies</td><td>NDNV100nmHiWGA2ml</td><td>储存浓度为1 mg/mL</td></tr><tr><td>ORCA-Fusion数字CMOS相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C14440-20UP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，100/20 mm，聚苯乙烯，透明，带通气孔，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td>用于在1/2 MS培养基上培养植物</td></tr><tr><td>方形培养皿，聚苯乙烯，透明，120/120/17 mm，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>688161</td><td>用于切碎植物幼苗</td></tr><tr><td>pluriStrainer Mini细胞筛</td><td>pluriSelect</td><td>43-10030-50</td><td>孔径30 &amp;micro;m，适用于1.5 mL Eppendorf管</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>单波段发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-698/70</td><td>AF647通道专用发射滤光片</td></tr><tr><td>单波段发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET600/50m</td><td>JF549通道专用发射滤光片</td></tr><tr><td>氯化钠（99.5%）&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td>Star-Frost载玻片 76 × 26 mm</td><td>Knittel</td><td>&amp;nbsp;VS112711FKB.01</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器&amp;oslash; 33 mm，孔径0.2 &amp;micro;m，Luer Lock锥形</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td></td></tr><tr><td>超分辨率成像系统</td><td>Abbelight</td><td>SAFe360</td><td>配备100倍NA1.5油浸物镜的Olympus IX83显微镜</td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠 Gen-Apex Biomole</td><td>Prolabo</td><td>PRO-33615.268</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级Tris碱</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Euromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-B</td><td></td></tr><tr><td>Twinsil Speed</td><td>Picodent</td><td>13001002</td><td>硅酮密封剂</td></tr><tr><td>紫外臭氧清洗系统UVOCS烘箱</td><td>UVOCS Inc.</td><td>T10X10</td><td>盖玻片清洗需暴露20分钟&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Vacuubrand</td><td>VP 100C</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>转子型号TX-400 75003629。使用Eppendorf管进行离心。</td></tr></tbody></table>

拟南芥细胞核中单分子定位显微镜的简化实验方案

A Streamlined Protocol for Single-Molecule Localization Microscopy in Arabidopsis Nuclei

尽管共聚焦荧光显微镜为研究植物细胞核中染色质的组织结构提供了重要见解，但其受衍射极限限制的分辨率制约了对染色质结构的深入探究，因而推动了超分辨率成像技术的应用，例如&#160;单分子定位显微镜（SMLM）。在这些技术中，直接随机光学重建显微镜（dSTORM）可在单个细胞中实现纳米级分辨率，从而精确可视化染色质结构域、组蛋白修饰以及细胞核内结构的组织特征。尽管此类方法在哺乳动物系统中的应用日益广泛，但在植物生物学中的使用仍较为有限，这主要归因于样品制备过程中的技术挑战。
本文介绍了一种针对拟南芥（Arabidopsis thaliana）分离细胞核进行单分子定位显微镜（SMLM）成像的简化且可重复的工作流程。该方案从幼苗固定开始，以保持细胞核形态；随后通过轻柔组织切碎和离心步骤富集完整的细胞核。分离的细胞核在液体环境中进行荧光染料标记，并固定于低熔点琼脂糖垫上，该策略可显著提高长时间单分子成像过程中的样本稳定性。上述步骤共同作用，有效降低了背景荧光，提高了标记的一致性，并增强了生物学重复之间的可重复性。
所获得的样品能够更清晰地观察植物中染色质修饰和细胞核结构。通过降低在拟南芥中实施超分辨率显微成像（SMLM）的技术门槛，本实验方案提供了一种多功能的方法，可用于在纳米尺度上研究表观遗传调控、染色质组织以及细胞核拓扑结构的变化。本研究建立了将SMLM技术应用于植物的系统方法，缩小了植物与哺乳动物细胞生物学之间的差距，为研究植物系统中细胞核结构如何响应发育和环境信号调控基因组功能开辟了新的途径。

上述方案可用于制备适用于单分子定位显微镜（SMLM）的高质量拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞核。经过多轮优化，提高了细胞核完整性，并减少了影响成像质量的细胞质和细胞碎片。每次优化步骤后，均使用Olympus IX81转盘共聚焦显微镜进行共聚焦成像，以评估细胞核制备样品的质量，再进行超分辨率成像采集。
共聚焦成像 
上述步骤确实适用于共聚焦成像。为此，第3.1步中使用的LMA溶液可基于PBS（或任何中性缓冲液或培养基）。MEA和GLOX仅在SMLM中需要。另一方面，SMLM中使用的基于JF的Hoechst染料（第3.3步）浓度过低，无法被常规成像方法检测到。因此，共聚焦或落射荧光成像的DNA标记采用Hoechst H33258，稀释比例为1/500（储存浓度为1 mg/mL）。
采用本优化方案，从15日龄的拟南芥野生型幼苗中分离出细胞核。通过C端结构域（CTD）上七肽串联重复序列中丝氨酸2（Ser2）的磷酸化标记，对处于活跃伸长状态的RNA聚合酶II...

本方案介绍了一种高效的工作流程，用于对分离的拟南芥细胞核进行单分子定位显微成像，通过优化的分离、固定和标记方法，实现染色质和RNA聚合酶II的可靠纳米级可视化。该方法可轻松扩展应用于其他染色质相关蛋白或组蛋白修饰的高分辨率成像。

尽管共聚焦荧光显微镜为研究植物细胞核内染色质的组织结构提供了重要见解，但其受衍射极限限制的分辨率……

我的研究重点是表观基因组编辑以及利用超分辨率显微镜对拟南芥细胞核内染色质结构进行可视化观察。现有的方法并不适用于STORM成像。本实验方案改进了细胞核纯度、标记一致性、样品封片以及成像稳定性。该方法适用于拟南芥及其他植物系统，用于高分辨率研究细胞核结构、染色质结构和表观遗传学。首先，在通风橱内将六孔培养板置于冰上。混合固定液，其中包含4%（体积分数）甲醇稳定的甲醛、0.1% Triton X-100 和 PBS。在通风橱内，向每个孔中加入约四毫升冰冻的固定液。使用洁净的镊子，从固体半倍浓度的Murashige和Skoog（MS）培养基上取出发芽后8至15天的拟南芥幼苗。立即将幼苗浸入固定液中，每孔放置约20株幼苗。每个样品使用三个孔以获得足够的材料。将培养板放入装有冰的真空室中并关闭。在-0.6 bar至-0.8 bar之间进行15分钟的真空循环，以去除组织中的 trapped 空气，并使固定剂充分渗透到植物组织中。然后缓慢释放真空。混匀样品，并继续抽真空15分钟。在通风橱中，用移液器移除固定液。用5毫升冰冻PBS在温和振荡条件下每孔清洗三次，每次10分钟。清洗后弃去PBS。用镊子将固定好的组织转移至120 mm × 120 mm的培养皿中，并向固定后的幼苗加入50 µL细胞核分离缓冲液。用刀片切碎固定组织。使用同一刀片将切碎的组织刮至培养皿的一侧边缘。加入 600 微升细胞核分离缓冲液，并冲洗掉粘附在刀片上的任何组织。将组织匀浆液转移至一个2毫升的Dounce匀浆管中，先用较小的研杵研磨5到10次。然后换用较大的研杵继续研磨，直至其在管内移动顺畅，通常需要5到10次研磨。将匀浆后的样品通过30微米的滤网过滤至一个50毫升的离心管中。将滤液转移至一个新的1.5毫升离心管中。以800×g离心10分钟，加速度和减速度均使用最低梯度。离心后，可见在绿色组织碎片中有一个微小的白色沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于600 µL细胞核分离缓冲液中。再次以800 × g离心10分钟，并移除上清液。彻底洗去绿色碎片后，将分离的细胞核悬液于4 °C保存，最多可保存一周，并用目标抗体对细胞核进行免疫染色。将1.5%（重量/体积）低熔点琼脂糖溶液在90摄氏度加热一分钟，以溶解粉末并获得澄清溶液。短暂涡旋以确保充分混匀。在继续操作前将溶液冷却并维持在37摄氏度，以避免葡萄糖氧化酶缓冲液发生热变性。当低熔点琼脂糖溶液降至37摄氏度时，通过向其中加入100毫摩尔的巯基乙胺和葡萄糖氧化酶缓冲液，使低熔点琼脂糖中的终浓度达到1X，并轻轻混匀。将10微升的细胞核混合物滴加到经紫外线臭氧清洗系统处理20分钟的臭氧处理1.5H盖玻片上。静置3分钟，使细胞核沉积在盖玻片上。然后，去除多余的液体，静置两分钟。向盖玻片上加入10 µL已制备的低熔点琼脂糖，立即用载玻片覆盖。使用硅酮密封剂密封盖玻片。使用微量移液器吸头在小型培养皿中等量混合溶液A和溶液B。将混合物涂抹在盖玻片边缘，以密封样品。让硅酮密封剂固化五分钟。将样本载玻片安装到显微镜上并找到焦平面。定位并聚焦于细胞核。如果设备支持，启用焦平面维持模块，以确保长时间采集过程中的稳定性。选择一个或少数几个纳米金刚石靠近细胞核的区域，以在重建过程中提高漂移校正效果。对于双色成像，先从较长波长的通道开始采集，然后切换到较短波长的通道完成成像。使用 ThunderSTORM 对原始图像序列进行处理，采用加权最小二乘法的高斯拟合，并生成重建图像。根据低于 30 纳米的 sigma 和不确定性进行滤波，以保留精确的定位结果并去除噪声。最后，使用 ThunderSTORM 互相关法或 COMET 算法进行样品漂移校正，并确认重建图像中的漂移极小。细胞核来自 15 天龄的野生型幼苗，用 AF647 标记的二抗进行免疫标记，并用 Hoechst H33258 复染。共聚焦成像显示多个孤立且保存良好的细胞核，碎片极少，染色中心和核仁清晰可辨。RNA聚合酶II信号在染色中心和核仁中均不存在。衍射受限的最大强度投影及其对应的单分子定位显微镜（SMLM）重建结果揭示了RNA聚合酶II和DNA标记的结构细节，包括放大显示更精细结构的兴趣区域。与检测到的定位相比，基于sigma值和不确定性的定位筛选改善了RNA聚合酶II和DNA信号的清晰度。在漂移校正后的进一步优化保持了这种增强的结构。基于sigma值的筛选去除了拟合宽度过小或过大的定位。傅里叶环相关分析显示，AF647通道在滤波后分辨率从90.1纳米提高到47.7纳米，而JF549通道则从56.6纳米提高到27.9纳米。在最小化碎片和背景荧光的同时保持细胞核完整性，对于实现高质量的单分子成像至关重要。未来的研究可将核结构与环境或发育条件下的基因调控联系起来。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

拟南芥核单分子定位显微镜的简化方案

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我们在此提供一种高效且可靠的免疫染色和荧光检测方案 在 原位 杂交，DNA染色后对整体样本进行定量高分辨率成像 拟南芥...

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高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

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玉米减数分裂细胞中的三维免疫定位

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学习拟南芥核单分子定位显微镜的简化方案，用于植物细胞生物学研究。该方法利用dSTORM技术实现染色质结构的高分辨率可视化，为研究表观遗传调控和核拓扑学提供可靠的技术基础。

拟南芥细胞核中单分子定位显微镜的简化实验方案

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