Name: 通过尺寸排除色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离出小型细胞外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-23T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学习使用尺寸排除色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离高纯度小型细胞外囊泡。该方法通过差速离心和SEC技术，仅需微量组织即可获得约10⁸颗粒/毫升/毫克的产量，适用于下游分子与功能分析。

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感谢杨珍妮（Jennie Yang）、达留什·日拉韦克（Dariusz Żurawek）和沃洛迪米尔·耶尔科（Volodymyr Yerko）提供的技术支持和有益的讨论。我们衷心感谢应用纳米医学中心平台，特别是纳迪姆·塔维尔（Nadim Tawil）和劳拉·蒙特里尼（Laura Montermini），在细胞外囊泡表征和数据采集方面给予的支持。同时感谢动物实验中心工作人员吉莱娜·加杜里（Guylaine Gadoury）和塔拉·汤姆森（Tara Thomson）在小鼠操作方面提供的帮助。

所有动物实验程序均经麦吉尔大学动物护理委员会（DOUG10029）批准，并依照加拿大动物护理委员会的指南进行。
1. 骨骼肌来源的sEV（SkM-sEV）分离方案
<ol>
	<li>样本采集与组织解离
	<ol>
		<li>组织收获与保存
		<ol>
			<li>切除骨骼肌（SkM）组织后，立即将其浸入预冷的甲基丁烷中进行速冻。 
			注意：为制备预冷的甲基丁烷，将甲基丁烷容器置于干冰浴中，并逐渐将小块干冰直接加入液体中。让溶液冷却，温度通常在−70°C至−80°C之间。使用过程中应将甲基丁烷保持在干冰浴中以维持温度。将组织浸入约3–4秒，直至完全冻结，表现为组织完全硬化并失去柔韧性。</li>
			<li>将组织转移至冻存管中。</li>
			<li>将样本置于干冰上。 
			注意： 将样本储存在−80°C直至进一步处理。避免反复冻融循环。当样本密封良好时，快速速冻能有效保存细胞外囊泡（EVs）。若组织暴露在空气中或经历多次冻融循环，可能发生脱水或囊泡损伤13。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>组织解离 
		&#8203;注意： 所有步骤均应在生物安全柜中使用无菌器械和手套进行，以防止污染，否则可能影响EV纯度。
		<ol>
			<li>称量组织
			<ol>
				<li>用70%乙醇对镊子进行灭菌，并使其自然晾干。</li>
				<li>将冷冻组织转移至已预先称重的悬浮培养皿中。</li>
				<li>使用毫克天平称量组织（通常每样本约80–120 mg，具体取决于小鼠年龄和性别）。 
				注意：本方案已验证适用于输入组织质量为~80–120 mg的情况。对于在此范围内的样本，使用步骤1.2.3.1、1.3.1.3和1.3.2.1中指定的试剂体积，无需调整。对于超出此范围的样本，所有试剂体积应按组织质量成比例缩放，同时保持RPMI-1640、胶原酶D和DNase I的验证比例（每100 mg组织对应1000:40:4 µL）。这相当于每毫克组织使用约10 µL RPMI-1640、0.4 µL胶原酶D（100 mg/mL储备液）和0.04 µL DNase I（20,000 U/mL储备液）。保持这些比例以确保反应中最终酶浓度一致。当组织质量显著偏离80–120 mg范围时，消化效率和EV产量应通过实验验证。</li>
				<li>将样本放回预冷的离心管中，并置于冰上保存。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>酶液准备
			<ol>
				<li>将胶原酶D（100 mg/mL储备液）和DNase I（20,000 U/mL储备液）分装物在冰上解冻（参见补充文件1，步骤1.4获取酶储备液制备方法）。这些酶将在步骤1.3.2.1中加入，以达到反应中最终浓度分别为3.8 mg/mL胶原酶D和77 U/mL DNase I。最终消化体积为1.044 mL。</li>
				<li>轻轻颠倒混匀DNase I。切勿涡旋震荡。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>消化前组织准备
			<ol>
				<li>在置于冰上的无菌悬浮培养皿中加入800 µL RPMI-1640。</li>
				<li>将组织转移至培养皿中。</li>
				<li>使用无菌一次性手术刀将组织切成6–8个大小均匀的片段（每边约2–3 mm）。切割时用无菌镊子固定组织，以确保均匀破碎。每个样本应在1分钟内完成此步骤，以保证样本间的一致性。</li>
				<li>整个操作过程中保持培养皿在冰上，以最小化降解。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>组织转移与酶解消化
		<ol>
			<li>组织转移
			<ol>
				<li>使用无菌刀片修剪无菌P1000移液器吸头末端，使其开口直径为2–3 mm，足以允许步骤1.2.3.3中产生的组织碎片自由通过。 
				注意：也可使用市售宽口（大孔径）1 mL移液器吸头，其提供标准化开口（通常内部直径约~2–3 mm），避免手动修剪带来的变异性。</li>
				<li>使用装有改装吸头的P1000移液器将组织碎片和RPMI-1640培养基转移至预先标记的1.5 mL离心管中。进行2–3次连续吸打以回收残留碎片和培养基。转移后目视检查培养皿和移液器吸头，并使用无菌镊子转移任何残留碎片，确保无可见组织残留。</li>
				<li>向每根离心管中加入200 µL RPMI-1640。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>酶解消化
			<ol>
				<li>从冰上解冻的分装物中向每根离心管加入40 µL胶原酶D储备液（100 mg/mL）和4 µL DNase I储备液（20,000 U/mL）。这将使反应中最终浓度达到3.8 mg/mL胶原酶D和77 U/mL DNase I。对于组织质量超出80–120 mg范围的样本，应按照步骤1.2.1.3后注释中所述成比例调整酶体积。 
				注意：这些体积是针对典型80–120 mg组织质量校准的。对于超出此范围的组织质量，应按照步骤1.2.1.3后注释中所述成比例缩放所有试剂体积（每毫克组织对应0.4 µL胶原酶D储备液和0.04 µL DNase I储备液），以确保无论组织质量如何，反应中最终酶浓度保持一致。</li>
				<li>处理多个样本时，应同时向所有样本中加入酶液。</li>
				<li>加酶期间保持离心管在冰上。</li>
				<li>轻轻颠倒混匀。切勿涡旋震荡。</li>
				<li>将离心管置于37°C下，在摇摆混合仪上孵育30分钟（24 rpm，20°倾斜角；参见材料表）。确保孵育期间混合均匀。 
				注意：每个样本的总消化体积为1.044 mL（每样本含1000 µL RPMI-1640、40 µL胶原酶D和4 µL DNase I；相当于约25:1的缓冲液与胶原酶比例）。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>去除碎片 
		注意：在第一次离心开始时（步骤1.4.1.1）即启动SEC柱平衡。SEC柱需要20–25分钟进行冲洗和平衡。在此时开始平衡可确保在过滤步骤（步骤1.4.3）完成后立即准备好上样。
		<ol>
			<li>第一次离心
			<ol>
				<li>在4°C下以300 × g离心10分钟，以沉淀未消化的碎片、完整细胞和残留组织片段。</li>
				<li>小心地将上清液转移至新的无菌1.5 mL微量离心管中，避免扰动沉淀。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>第二次离心
			<ol>
				<li>在4°C下以2,000 × g离心15分钟，以沉淀大块碎片、死亡细胞、凋亡小体和大型囊泡。</li>
				<li>小心地将上清液转移至新的无菌1.5 mL微量离心管中，避免扰动沉淀。 
				&#8203;注意：第二次离心为可选步骤，仅在需要进一步去除碎片时进行。如果第一次离心后上清液明显浑浊或含有残留颗粒物质，则应执行此步骤。如果先前的制备结果显示EV富集的SEC组分中存在细胞内标志物（如Calnexin或BiP）污染，或透射电子显微镜观察到非囊泡颗粒，也建议进行此步骤。是否需要此步骤应在每种组织类型的初始方案优化过程中进行验证。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>过滤
			<ol>
				<li>通过用RPMI-1640冲洗，预润湿无菌30 µm细胞筛，以平衡膜并减少样本损失。弃去冲洗液。</li>
				<li>将每个样本通过预润湿的30 µm细胞筛过滤至无菌低蛋白结合1.5 mL微量离心管中，以在SEC前去除残留的细胞碎片和大颗粒。</li>
				<li>让样本依靠重力通过滤膜。</li>
				<li>每样本过滤需时10–15分钟。 
				注意：当滤膜上方无可见液体且收集管中的滤液体积稳定时，过滤完成。如果过滤速度较慢或停滞，可能表明因残留碎片导致堵塞；此时可考虑重复澄清步骤或减少样本载量。</li>
				<li>收集550–600 µL过滤后的上清液用于后续上样至SEC柱。为保证样本间一致性，无论回收总体积如何，均将上样体积标准化为每柱500 µL（参见步骤2.2.1）。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尺寸排阻色谱法（SEC）
	<ol>
		<li>SEC柱平衡 
		注意： 如有可能，应在离心过程中进行此步骤。
		<ol>
			<li>用17 mL 1× PBS（0.22 µm过滤）冲洗SEC柱。</li>
			<li>让全部体积依靠重力通过色谱柱，预期流速为0.75 mL/min（17 mL冲洗体积共需20–25分钟）。流速过快或过慢可能表明柱子平衡不当或发生堵塞。</li>
			<li>平衡期间保持柱子和PBS处于室温（RT，21°C ± 2°C），以确保流速一致和柱子最佳性能。</li>
			<li>准备低蛋白结合的1.5 mL微量离心管，用于收集所有组分。</li>
			<li>如有需要，另准备一根离心管用于收集空体积。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>样本上样与洗脱
		<ol>
			<li>将500 µL过滤后的上清液上样至SEC柱。</li>
			<li>让样本完全进入树脂。终点为液面弯月面到达树脂床表面，树脂上方无可见液体，而树脂仍明显湿润。</li>
			<li>切勿让弯月面降至树脂表面以下或让柱子干涸，否则会引入空气进入树脂床并干扰洗脱。当液面弯月面到达树脂表面（如步骤2.2.2所定义）时，应立即无延迟地进入步骤2.2.4。</li>
			<li>立即加入2 mL PBS以启动洗脱。</li>
			<li>收集空体积（约2.5 mL）。</li>
			<li>弃去空体积或将其保留作为非EV组分。</li>
			<li>在2.5 mL空体积洗脱后，立即开始收集EV富集组分。</li>
			<li>在空体积之后收集总共1.6 mL EV富集洗脱液，可作为单个连续组分收集于一根离心管中，或作为连续组分收集后合并。</li>
			<li>或者，可收集0.4 mL的连续组分，以优化纯度与产量之间的平衡。当需要更高纯度时（例如用于蛋白质组学分析或敏感的下游应用），建议使用更小的组分体积；而为最大化总体EV产量，可使用更大的组分体积。</li>
			<li>使用表征方法（如EV标志物和污染物的Western blot，以及NTA）评估各组分的EV富集情况，并根据表征部分的定义合并EV富集组分。 
			注意：保持柱子持续流动。当一个组分即将收集完毕时，立即加入PBS，以在树脂床上维持恒定液面，防止柱子干涸。使用低蛋白结合、无核酸酶的离心管进行收集。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>浓缩
		<ol>
			<li>使用离心过滤器（100 kDa分子量截留值[MWCO]）浓缩EV样本，用于下游应用（如RNA测序、蛋白质组学或Western blot）。</li>
			<li>使用前用PBS预冲洗过滤器。</li>
			<li>在4°C下以4,000 × g离心，每2–3分钟检查一次，直至达到所需最终体积（通常为50–100 µL）。对于需要更高浓度的应用，使用较低最终体积（如约50 µL）；当优先考虑最大化回收率时，使用较高体积（如约100 µL）。 
			警告：一旦达到目标体积即停止离心，避免过度浓缩。</li>
			<li>通过轻柔移液回收截留物。</li>
			<li>如有需要，记录浓缩前后的样本体积以估算回收率。如有条件，可使用NTA评估浓缩前后颗粒浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>储存
		<ol>
			<li>将EV富集组分置于冰上或4°C保存，用于立即检测（如NTA和透射电子显微镜[TEM]），TEM检测应在24小时内完成，NTA检测应在48小时内完成。</li>
			<li>将EV样本分装至低蛋白结合离心管中储存。</li>
			<li>长期使用时储存于−80°C。</li>
			<li>避免反复冻融循环。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 骨髓来源sEV（BM-sEV）分离方案
<ol>
	<li>样本采集与组织解离
	<ol>
		<li>组织收获与保存
		<ol>
			<li>切除骨骼后切勿立即进行速冻，因为这会使骨髓变硬，从而增加使用穿孔管法提取的难度。相反，在处理或按步骤3.1.1.4所述进行冷冻（在干冰上放置后转移至−80°C保存）前的短暂操作期间，应将骨骼置于冰上或4°C环境中。</li>
			<li>去除解剖所得骨骼周围的肌肉和结缔组织。</li>
			<li>将骨骼转移至冻存管中。</li>
			<li>将样本置于干冰上。 
			&#8203;注意：将样本在−80°C下保存，直至进一步处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>骨髓（BM）处理 
		&#8203;注意： 所有步骤均应在生物安全柜中使用无菌器械和手套进行，以防止污染，否则可能影响外泌体（EV）纯度。
		<ol>
			<li>在加入任何材料前，预先称重并标记1.5 mL离心管。通过比较提取前后管重计算骨髓质量。</li>
			<li>准备穿孔管装置：将一个0.2 mL PCR管（盖子完整）紧密插入1.5 mL离心管中。用无菌16 G针头垂直于管底刺穿0.2 mL管底部一次，形成一个直径约1.6 mm的均匀穿孔。每只小鼠的每条腿准备一套装置。</li>
			<li>将已去除全部肌肉和周围组织的腿置于无菌培养皿中。</li>
			<li>通过切断关节间隙分离股骨和胫骨。</li>
			<li>切去股骨和胫骨两端以暴露红骨髓。将骨骼放入置于1.5 mL管内的穿孔PCR管中，并用封口膜密封组装体，确保离心过程中结构稳固。</li>
			<li>在台式微量离心机中，室温下以约8,000 × g（或所用仪器可达到的最接近设置）离心10秒。</li>
			<li>通过以下三项标准验证骨髓提取是否成功：(i) 骨骼明显呈白色，无残留红骨髓；(ii) 下方离心管中的沉淀呈深红色且致密，通常填满1.5 mL管的锥形尖端；(iii) 测得的骨髓质量（步骤3.1.2.9）在每只小鼠约15–30 mg的预期范围内。</li>
			<li>若骨骼内仍可见红骨髓，则重新定位或重新切割骨骼，并重复短暂离心。</li>
			<li>再次称量离心管以确定提取骨髓的质量（通常每样本约15–30 mg，取决于小鼠年龄、性别及提取效率）。 
			注意：本方案已验证适用于每样本约15–30 mg的骨髓产量。由于RPMI-1640重悬体积固定为250 µL（步骤3.1.2.10），无论骨髓质量如何，外泌体产量将在下游分析中归一化至起始骨髓质量（颗粒数·mL−1·mg−1 组织）。对于显著低于15 mg的样本，在重悬前应合并来自匹配小鼠（相同年龄、性别和骨骼）的骨髓，以保证下游表征所需的足够输入量。对于显著高于30 mg的样本，可将骨髓分至两个独立的250 µL重悬液中，或按比例增加RPMI-1640体积（约每毫克骨髓12.5 µL），以避免重悬不完全；无论采用哪种方式，分析时均应采用相同的单位质量归一化方法。</li>
			<li>向每管中加入250 µL RPMI-1640。无论骨髓质量如何，均保持样本间体积恒定，以便将外泌体产量归一化至起始骨髓质量。将样本置于冰上保存。</li>
			<li>使用P1000移液器轻轻吹打10–15次，使骨髓重悬，直至悬液外观均匀，无可见团块或完整组织碎片残留。避免强力吹打或产生气泡，以免破坏囊泡完整性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除碎片
	<ol>
		<li>第一次离心
		<ol>
			<li>在4°C下以300 × g离心10分钟，使未消化的碎片、完整细胞和残留组织碎片沉淀。</li>
			<li>小心转移上清至新的无菌1.5 mL微量离心管中，避免扰动沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第二次离心
		<ol>
			<li>在4°C下以2,000 × g离心15分钟，以去除大颗粒碎片。</li>
			<li>小心转移上清至新的无菌1.5 mL微量离心管中，避免扰动沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第三次离心
		<ol>
			<li>在4°C下以10,000 × g离心30分钟，以去除凋亡小体和大囊泡。</li>
			<li>小心转移上清至新的无菌1.5 mL微量离心管中，避免扰动沉淀。</li>
			<li>确保最终获得200 µL上清液。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尺寸排阻色谱（SEC）
	<ol>
		<li>色谱柱准备
		<ol>
			<li>用6 mL 1× PBS（0.22 µm过滤）冲洗尺寸排阻色谱柱进行平衡。 
			注意：平衡体积因色谱柱而异，应与材料表中所列色谱柱类型匹配。本色谱柱需6 mL平衡体积，不同于用于骨骼肌（SkM）样本的色谱柱。</li>
			<li>让全部液体依靠重力流过色谱柱。</li>
			<li>平衡过程中保持色谱柱和PBS处于室温，以确保最佳流速和色谱柱性能。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>样本上样与洗脱
		<ol>
			<li>将150 µL过滤后的上清液上样至尺寸排阻色谱柱。</li>
			<li>让样本完全进入树脂。终点为液面弯月面到达树脂床表面，树脂上方无可见液体残留，同时树脂保持湿润（如步骤2.2.2所述）。</li>
			<li>切勿让弯月面降至树脂表面以下或使色谱柱变干（参见步骤3.3.2.2定义的终点），否则会引入空气至树脂床并干扰洗脱。当液面弯月面到达树脂表面时，应立即无延迟地进入步骤3.3.2.4。</li>
			<li>立即加入550 µL PBS以启动洗脱。</li>
			<li>收集空体积（700 µL）。</li>
			<li>弃去空体积或将其保留为非外泌体组分。</li>
			<li>在700 µL空体积洗脱后，立即开始收集富含外泌体的组分。</li>
			<li>在700 µL空体积之后收集850 µL富含外泌体的洗脱液。</li>
			<li>或者，可连续收集约170 µL的组分，以优化纯度与产量之间的平衡。 
			注意： 当需要更高纯度时（例如用于蛋白质组学分析或敏感的下游应用），建议使用较小的组分体积；而为最大化外泌体总产量，可使用较大的组分体积。</li>
			<li>检测各组分的外泌体标志物，并根据需要合并富含外泌体的组分。 
			注意： 保持色谱柱持续流动。当一个组分即将结束时，加入PBS以维持树脂床上方恒定的液体层，防止色谱柱变干。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+size-exclusion+chromatography+column+affects+recovery,+purity,+and+miRNA+cargo+analysis+of+extracellular+vesicles+from+human+plasma.">Choice of size-exclusion chromatography column affects recovery, purity, and miRNA cargo analysis of extracellular vesicles from human plasma.</a> Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (3), 497-508 (2024).</li><li>Mo, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-mediated+bidirectional+communication+between+the+liver+and+other+organs:+Mechanistic+exploration+and+prospects+for+clinical+applications.">Extracellular vesicle-mediated bidirectional communication between the liver and other organs: Mechanistic exploration and prospects for clinical applications.</a> J Nanobiotechnology. 23 (1), 190 (2025).</li></ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种稳健且可重复的方法，用于直接从骨骼肌（SkM）和骨髓（BM）这两种产量低且高度异质的组织中分离富含小细胞外囊泡（sEV）的组分。尽管细胞外囊泡（EV）的分离在生物体液和细胞培养体系中已有成熟方法，但由于组织解离困难、细胞内物质污染以及产量波动等问题，目前针对组织来源EV的标准化方法仍十分有限。本文详细阐述了影响EV纯度、产量和可重复性的关键步骤、故障排除策略及局限性，并特别针对SkM和BM样本的制备提供了具体建议。本研究中富含EV的组分是根据多个互补标准进行操作性定义的，包括典型EV标志物的富集、细胞内污染物的最低检出水平，以及与预期的尺寸排阻色谱（SEC）洗脱谱型的一致性10。因此，选择早期洗脱组分（SkM为F1–F4，BM为F1–F5）用于后续分析；而较晚的洗脱组分虽仍持续检出EV标志物，但同时伴随蛋白质含量升高和细胞内污染物水平增加，表明囊泡纯度降低（补充表1和2）。这些结果强调了在解析SEC洗脱组分时，应结合标志物检测与蛋白质含量评估的重要性，因为仅基于尺寸的分离无法区分囊泡性颗粒与非囊泡性颗粒<s...

小型细胞外囊泡（sEVs）是一类纳米级的脂质包被颗粒，通过传递蛋白质、脂质和核酸介导细胞间通讯1。所有类型的细胞均可释放sEVs，它们几乎存在于所有生物体液中，作为生物活性物质（包括肽段和微小核糖核酸（RNAs））的关键载体发挥作用2。其内容物经过选择性分选，能够精确递送特定信号3；同时，囊泡结构使其能够克服自由分泌因子通常面临的浓度梯度和稀释限制，实现远距离传递高浓度的分子负载4。尽管来自生物体液（如血浆、血清和唾液）的细胞外囊泡（EVs）可提供系统性信号传导的便捷快照，但它们来源于多种组织，构成高度混合的群体5。这使得确定特定生物信号由哪个器官产生，或组织水平上EV介导的通讯如何被调控变得困难。由于循环中的EVs是多种来源的混合物，组织特异性的变化可能被稀释或掩盖，从而限制了对信号真实来源的识别能力6。
骨骼肌（SkM）和骨髓（BM）是具有显著代谢活性和功能的重要组织，其细胞组成和信号作用各不相同7,8。这两种组织均可能释放富含独特、组织特异性内容物的细胞外囊泡（EV）群体；然而，来自高更新率组织（如免疫细胞）的EV在血浆中可能占主导地位，从而轻易掩盖骨骼肌或骨髓来源的信号8,9。直接从肌肉或骨髓中分离EV可提高检测灵敏度，有助于发现那些在循环系统中无法观察到的细微且具有组织特异性的适应性变化。因此，组织来源的EV提供了重要的补充信息，揭示特定器官何时释放EV、这些信号能持续多长时间，以及哪些适应性变化属于急性或慢性。尽管人们对EV的研究兴趣日益增加，但目前大多数成熟的分离方法主要针对生物液体（如血浆和血清）或细胞培养体系。在这些情况下，EV可以获得较高的产量，且结构损伤较小。然而，直接从骨骼肌和骨髓等实体组织中分离EV面临显著的技术挑战。这些组织结构复杂且具有高度异质性，需要进行机械或酶解离步骤，而这些步骤可能引入多种干扰物质，包括高水平的可溶性蛋白、细胞器碎片以及非囊泡性纳米颗粒，从而难以获得高纯度的EV制备物。
组织来源的细胞外囊泡分离中的另一个主要挑战是缺乏用于组分定义和分离的标准化操作流程10差速离心法单独使用时常导致蛋白质聚集体与大型囊泡的共同分离，而基于超速离心的方法尽管被广泛使用，却可能因转子类型和实验条件不同而导致囊泡聚集、变形以及回收率不稳定。密度梯度法虽可提高纯度，但耗时较长、通量低，且在不同实验室之间难以标准化。11因此，目前尚无被广泛采纳的、可重复的方法用于从固体组织中高纯度、稳定产量地分离小细胞外囊泡（small EVs）10.
尺寸排阻色谱法（SEC）作为一种有前景的细胞外囊泡（EV）分离替代方法已受到关注，因其可根据颗粒大小进行分离，而无需对囊泡施加高离心力。SEC能够有效分离小细胞外囊泡（sEVs）与可溶性蛋白质及低分子量污染物，同时保持囊泡的完整性和生物学功能。尤为重要的是，SEC可明确定义洗脱组分，从而实现对富含EV组分的可重复鉴定，并提高实验间的一致性12。然而，针对组织来源样本的SEC操作流程需要进行精细优化，特别是在上游组织处理、碎片去除和组分收集方面。为解决这些局限性，我们开发了一种可重复且标准化的从骨骼肌（SkM）和骨髓（BM）中分离sEVs的实验方案。该方法结合了对纤维性组织的可控酶解消化、差速离心去除碎片以及基于SEC的纯化步骤，以获得高纯度的囊泡。该流程经过专门优化，可在保持囊泡完整性的同时，最大限度减少细胞内成分的污染，并实现对低产量组织中囊泡的稳定回收。
本方案通过纳米颗粒示踪分析（NTA）、经典细胞外囊泡（EV）标志物的蛋白质印迹检测、电镜形态学评估，以及基于抗体捕获、干涉测量定尺寸和多通道荧光成像的单颗粒EV分析，提供了一种实用且可扩展的方法，用于实现具有明确分级和经验证纯度的组织来源小细胞外囊泡（sEVs）的分离，从而填补了关键的方法学空白。该方法特别适用于需要进行组织特异性EV分析的研究，在这些研究中，生物液体来源的囊泡不足以解析信号的细胞来源。当研究目标是从实体组织中获取高纯度sEVs，并最大限度减少污染、保持囊泡完整性时，研究人员应采用此方法。相比之下，在对产量要求较高而对纯度要求相对较低的应用中，基于超速离心的方法可能更为合适；而在需要分离特定EV亚群时，尽管通量较低，密度梯度法可能是更优选择。综上所述，本方案为组织来源sEVs的分离与表征提供了标准化框架，支持可重复的下游分子、生化及功能分析。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>本方案中通用的微量离心管</td></tr><tr><td>1.5 mL 低蛋白吸附管</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.600</td><td>用于细胞外囊泡（EV）操作、尺寸排阻层析（SEC）组分收集及储存</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-262</td><td>用于穿孔管骨髓提取装置的搭建</td></tr><tr><td>16 G 针头</td><td>BD</td><td>305197</td><td>用于穿刺 0.2 mL PCR 管</td></tr><tr><td>30 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-098-458</td><td>用于骨骼肌样本过滤</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.11727</td><td>用于镊子的灭菌</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于无菌组织操作</td></tr><tr><td>骨组织切割器械</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-001-976</td><td>用于分离股骨与胫骨并暴露骨髓</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>BioShop</td><td>ALB001</td><td>用于 Western 印迹封闭及抗体稀释</td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>BioShop</td><td>CCL302</td><td>用于 HEPES 缓冲液的配制</td></tr><tr><td>200 目碳支持铜网</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>930342</td><td>用于透射电子显微镜（TEM）样本制备</td></tr><tr><td>离心过滤器，100 kDa 截留分子量（MWCO）</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC810096</td><td>用于细胞外囊泡（EV）浓缩</td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td>用于骨骼肌组织的酶解消化</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>用于组织和骨骼的储存</td></tr><tr><td>去离子水（超纯）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于缓冲液配制及透射电镜（TEM）洗涤步骤</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>用于骨骼肌组织的酶解消化</td></tr><tr><td>干冰</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于样本冷却和运输</td></tr><tr><td>增强型化学发光底物</td><td>Biorad</td><td>1705061</td><td>用于 Western 印迹检测</td></tr><tr><td>滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.3941.501</td><td>用于必要时过滤 PBS</td></tr><tr><td>镊子</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3892</td><td>用于组织操作</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于透射电镜（TEM）固定</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于透射电镜（TEM）载网洗涤步骤</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>用于 DNase I 储存液的配制</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500</td><td>用于 HEPES-NaOH 缓冲液的配制</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记链霉亲和素</td><td>Thermo Fisher</td><td>S911</td><td>用于 Western 印迹检测</td></tr><tr><td>化学发光成像系统</td><td>Biorad</td><td>12003153</td><td>用于 Western 印迹膜的成像</td></tr><tr><td>KCl</td><td>BioShop</td><td>POC308</td><td>用于 HEPES 缓冲液的配制</td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>BioShop</td><td>MAG510.500</td><td>用于 HEPES 缓冲液的配制</td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Thermo Fisher</td><td>78-78-4</td><td>用于骨骼肌组织的速冻</td></tr><tr><td>毫克天平</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z741359</td><td>用于组织和骨髓的称重</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD004.1</td><td>用于 HEPES 缓冲液的配制</td></tr><tr><td>纳米颗粒追踪分析仪</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300</td><td>使用 NanoSight NS300 进行颗粒尺寸分析与计数</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY500.500</td><td>用于 pH 调节</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>BioRad</td><td>1704271</td><td>用于 Western 印迹转膜</td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Labnet</td><td>&amp;nbsp;S0500</td><td>用于酶解消化过程中的混合</td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>MilliporeSigma</td><td>FA10006M-1EA</td><td>用于组织转移</td></tr><tr><td>移液器吸头，1 mL</td><td>Sarstedt</td><td>70.3050.275</td><td>吸头经修剪以扩大开口，便于组织碎片转移</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Wisent</td><td>INC 811.012-FL</td><td>本方案中广泛使用；也用于尺寸排阻层析（SEC）的平衡与洗脱</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂</td><td>MilliporeSigma</td><td>4906845001</td><td>用于 Western 印迹裂解液的制备</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS351146</td><td>用于骨髓制备</td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺凝胶，4&amp;ndash;20% 梯度免染胶</td><td>BioRad</td><td>4561094</td><td>用于 Western 印迹蛋白分离</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>MilliporeSigma</td><td>11697498001</td><td>用于 Western 印迹裂解液的制备</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388-500ML</td><td>未添加补充物；不含胎牛血清（FBS）或抗生素</td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液，10&amp;times;</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td>用于 Western 印迹的蛋白提取</td></tr><tr><td>手术刀片，无菌一次性</td><td>Ultident Paragon</td><td>02-90000-10</td><td>用于切碎骨骼肌组织</td></tr><tr><td>SEC 柱，原始型 70 nm</td><td>IZON</td><td>ICO70P</td><td>用于骨骼肌的尺寸排阻层析（SEC）</td></tr><tr><td>SEC 柱，单用型 70 nm</td><td>IZON</td><td>ICS70P</td><td>用于骨髓的尺寸排阻层析（SEC）</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>添加至 PBS 中用于柱子的洗涤</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于透射电镜（TEM）固定缓冲液</td></tr><tr><td>无针鲁尔滑动一次性注射器&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>SYR101020</td><td>必要时用于纳米颗粒追踪分析（NTA）采集</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td>NA</td><td>使用 Tecnai G2 Spirit Twin 120 kV 冷冻透射电镜（Cryo-TEM）进行 TEM 成像</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN508.1</td><td>用于配制 PBS-T 进行 Western 印迹</td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于透射电镜（TEM）负染色</td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1003055</td><td>用于吸除多余的 TEM 染色液</td></tr></tbody></table>

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

Isolation of Small Extracellular Vesicles from Murine Skeletal Muscle and Bone Marrow by Size-Exclusion Chromatography

小细胞外囊泡（sEVs）是一类纳米级的脂质包被颗粒，通过传递蛋白质、脂质和核糖核酸（RNAs）介导细胞间通讯。由于产量低且易受非囊泡成分污染，从骨骼肌（SkM）和骨髓（BM）等实体组织中分离sEVs仍具挑战性。本方案描述了一种可重复地从小鼠SkM和BM中分离sEVs的工作流程。SkM采用酶消化法处理，而BM则直接处理，随后进行差速离心和尺寸排阻色谱（SEC）。对于SkM，弃去空体积（约2.5 mL），收集后续约1.6 mL的囊泡富集组分，通常分为400 µL的连续组分（F1–F4）。对于BM，弃去700 µL的空体积，随后收集约850 µL的囊泡富集组分，可进一步分为约170 µL的连续组分（F1–F5），并根据EV标志物富集情况合并组分。采用该方法，可从少量组织体积中分离sEVs（单侧股四头肌约500 µL，合并的股骨和胫骨骨髓约150 µL），获得约~108 粒子·mL−1·mg−1 组织，粒子直径主要&#60;200 nm。通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析及经典EV标志物的Western blotting验证囊泡的完整性与纯度，并结合单粒子干涉检测技术对四跨膜蛋白定义的囊泡亚群进行进一步表征。该方法可在使用极少起始材料的前提下，实现从结构复杂的组织中可重复地分离高纯度sEVs，支持对组织来源囊泡进行下游分子和功能分析。

为评估该方案在分离组织来源sEVs方面的有效性，本文展示了来自SkM和BM样本的代表性结果。成功的分离需满足以下标准：（i）早期SEC组分中富集典型的EV标志物（TSG101、CD63、CD81和CD9）；（ii）细胞内污染物（如Calnexin和BiP）的检出量极低；（iii）粒子尺寸分布呈单峰，且大多数粒子 &lt;200 nm；（iv）通过透射电子显微镜（TEM）观察完整且具有膜结构的囊泡；（v）与后期富含蛋白质的组分相比，EV富集组分中颗粒浓度更高。附加表征包括单颗粒四跨膜蛋白分析。相比之下，次优或失败的分离表现为早期组分中EV标志物富集微弱或缺失、细胞内污染物显著存在、颗粒粒径分布广泛或呈多峰分布，以及电子显微镜下缺乏清晰可辨的囊泡结构。这些标准与既定的小细胞外囊泡（sEV）表征指南一致。
骨骼肌来源的sEVs（SkM-sEVs）
骨骼肌组织经过酶解离、过滤和尺寸排阻色谱分离后（图1A），在早期SEC洗脱组分中持续检测到富含...

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。

小型细胞外囊泡（sEVs）是纳米级的脂质包被颗粒，通过转运蛋白质、...

我们的研究重点是从小鼠肌肉和骨髓中分离小细胞外囊泡，以了解组织之间如何进行信号交换。该方案可应用于与小鼠模型中衰老、肌肉再生、运动生理学以及骨髓病理生理学相关的研究。首先，将小鼠股骨和胫骨样本置于生物安全柜中。预先称重并标记1.5毫升离心管。接着，用一支无菌的16号针头垂直刺穿0.2毫升离心管的管底，形成一个均匀的单孔。将打孔后的0.2毫升管紧密插入已预称重的1.5毫升离心管中，以制备“打孔管”装置。将腿骨放入无菌培养皿中。通过切断关节间隙分离股骨和胫骨。切除股骨和胫骨的两端以暴露红骨髓。将骨骼放入已打孔的 PCR 管中，该 PCR 管置于 1.5 毫升离心管内，用封口膜密封整个装置。在室温下，使用台式微量离心机以约 8,000 ×g 的离心力离心 10 秒。通过观察上层管中骨骼呈明显白色、无残留红色骨髓，以及下层管底部出现深红色且致密的沉淀，确认骨髓提取成功。然后再次称量1.5毫升离心管，以确定提取的骨髓质量，确保其在每只小鼠约15至30毫克的预期范围内。向每支含有骨髓的离心管中加入250 µL RPMI 1640培养基，并将样品置于冰上。使用P1000移液器轻轻吹打10至15次，使骨髓重悬，直至获得均匀的悬液，无残留团块或完整的组织碎片。在4°C条件下，以300 ×g离心10分钟，使未消化的碎片、完整细胞和残留组织沉淀。小心地将上清液转移至新的无菌1.5毫升微量离心管中，注意不要扰动沉淀。将转移后的上清液在2,000 ×g离心15分钟，以去除大颗粒碎片。将上清液收集到新离心管中，在4°C条件下以10,000 g离心30分钟。然后将至少200微升最终上清液收集至新的离心管中。用6毫升过滤后的PBS冲洗凝胶过滤层析柱以进行平衡，层析柱和PBS均需保持在室温。让全部体积依靠重力流过柱子。然后将150微升过滤后的上清液上样至柱中，使样品完全进入树脂。当液面弯月面降至树脂床表面且湿树脂上方无可见液体时，即达到终点。立即加入 550 微升 PBS 以启动洗脱，并收集 700 微升的空体积。弃去空体积，或将其保留作为非细胞外囊泡组分。在 700 微升空体积流出后，立即开始收集富含细胞外囊泡的组分。确保收集850微升富含细胞外囊泡的洗脱液。为浓缩细胞外囊泡，将样品加入预先用缓冲液冲洗过的截留分子量为100千道尔顿的离心过滤装置中。在4°C条件下以4,000 g离心，每2至3分钟检查一次，直至达到所需终体积。然后通过轻柔吹打回收截留物。将富含细胞外囊泡的组分置于冰上，用于立即进行检测，例如透射电子显微镜分析。Western blot分析显示早期组分中存在小型细胞外囊泡或SEV标志物。将第一至第五组分合并，用于后续对小型细胞外囊泡的表征。这些组分中未检测到钙联蛋白和结合免疫球蛋白蛋白信号，排除了来自细胞内膜和内质网组分的污染。对富集了SEV的F1至F5组分进行透射电子显微镜观察，显示完整且呈圆形的囊泡，具有清晰可辨的双分子层膜结构，直径小于200纳米。对混合样本进行的纳米颗粒追踪分析显示，颗粒大小呈单峰分布，峰值位于200纳米以下，中位粒径为147.8纳米。以组织质量归一化的颗粒浓度在富含SEV的F1至F5组分中最高，达到每毫升每毫克组织3.7×10⁸个颗粒，而在后续的F6至F8组分中略有降低，为每毫升每毫克组织3.7×10⁸个颗粒。本方案可使研究人员测定来自肌肉和骨髓的细胞外囊泡的粒径、浓度及其分子载荷。未来的研究可将该方案扩展至疾病模型，并利用分离出的囊泡来鉴定生物标志物和治疗靶点。

isolation-small-extracellular-vesicles-from-murine-skeletal-muscle

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过尺寸排除色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离出小型细胞外囊泡

来源：Watson, D. C., 等. 从大肠杆菌及其他细菌中可扩展地分离与纯化细胞外囊泡. J. Vis. Exp.

使用尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡

在本视频中，我们演示一种技术——尺寸排阻色谱法，用于分离来源于细菌的异质性外膜囊泡（OMV）群体。这些囊泡为纳米级球形结构，可通过尺寸排阻色谱法根据其大小分离为大尺寸和小尺寸亚群。...

基于尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡：一种根据尺寸分离革兰氏阴性菌外膜囊泡异质群体的技术

尺寸排阻色谱法，细菌胞外囊泡，外膜囊泡，革兰氏阴性菌，囊泡分离，尺寸分离，纳米颗粒，生物分离技术

本视频演示了利用尺寸排阻色谱法（SEC）从结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种用于纯化分枝杆菌胞外囊泡的尺寸排阻色谱技术

本方案阐述了以下两个方面：1）从小鼠成年腓肠肌中分离和培养原代成纤维细胞；以及...

骨骼肌成纤维细胞外泌体的分离与表征

细菌囊泡在致病过程中发挥重要作用，并具有广阔前景的生物技术应用价值。由于囊泡具有异质性，其分析和应用受到限制；因此，亟需一种简单且可重复的方法来分离不同大小的囊泡。本文中，我们展示了利用尺寸排阻色谱法分离由Aggregatibacter...

利用尺寸排阻色谱分析细菌外膜囊泡的异质性

本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。...

利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。...

一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡

本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。...

优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。...

利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

本方案旨在通过机械剥离、酶解离、过滤和差速超速离心法，从啮齿类动物肌肉组织中分离和纯化骨骼肌间质细胞外囊泡（SkM-EVs）。该方法具有良好的重复性和可靠性。所获得的SkM-EVs有助于研究肌肉稳态及肌肉相关疾病，并有望作为诊断生物标志物或治疗载体加以应用。...

骨骼肌间质细胞外囊泡的酶法分离

学习使用尺寸排除色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离高纯度小型细胞外囊泡。该方法通过差速离心和SEC技术，仅需微量组织即可获得约10⁸颗粒/毫升/毫克的产量，适用于下游分子与功能分析。

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

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