Name: 一种优化方法：分离雌鼠尿道上皮以进行单细胞和免疫荧光分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学习优化方法分离雌鼠尿道上皮细胞，用于单细胞RNA测序、流式细胞术和免疫荧光分析。该技术可生成高活性细胞悬液和三维类器官，助力研究下尿路宿主防御机制。

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我们感谢位于国家生物科学中心（NCBS）的动物护理与资源中心（Animal Care and Resource Centre）以及班加罗尔生命科学集群（BLiSC）提供的服务。我们感谢Yousuf Khan及BRIC-inStem传播办公室（Communications Office）提供的摄影支持。我们感谢Sudarshan Gadadhar博士提供AxioObserver显微镜和Apotome的使用权限。本工作由印度DBT/惠康基金会印度联盟（DBT/Wellcome Trust India Alliance）早期职业研究员项目（项目编号：IA/E/21/1/506274）资助，授予D.B.J.；同时由印度政府生物技术部（DBT）向inStem提供的机构核心资金支持。

作者声明无竞争利益。本文未使用任何人工智能工具。

机体中的上皮屏障对宿主防御至关重要。这些是具有多种上皮细胞类型及伴随的常驻免疫细胞的特化结构。上皮屏障在发育过程中不断变化，通常在微生物群或环境暴露的刺激下获得宿主防御相关基因的表达。上皮完整性或基因表达的缺陷可能影响宿主防御能力15。为了理解转录组特征以及研究细胞间连接和上皮完整性，必须对上皮组织进行分离研究。目前尚无详细描述专门优化用于从小鼠雌性尿道分离上皮组织的方法。虽然膀胱上皮可通过单纯的机械分离获得16，但尿道上皮位于尿道间质管内部，需要结合酶消化与机械分离的方法才能成功分离上皮组织。
本文中，作者介绍了一种从雌性小鼠尿道腔内分离上皮细胞片的优化方法。该方法可用于制备高活力的尿道上皮细胞单细胞悬液，适用于流式细胞术、类器官培养和免疫染色等后续实验。该研究团队此前已证实此方法适用于单细胞RNA测序流程5。经过适当修改和进一步优化，本方案也可用于提取其他管状器官的上皮组织，以满足不同的下游应用需求。
该实验方案的关键步骤包括对成年雌性小鼠全长尿道进行精细解剖，从而能够研究其近端-远端轴向上的区域差异。随后，方案采用温和的酶消化法，使尿道上皮层与其周围的间质组织松散分离。通过酶消化使上皮层松动后，可用镊子轻轻挤压尿道管，实现上皮组织的机械分离并释放。研究人员已对胰蛋白酶消化的时间进行了细致优化，能够以高活性（&#160;&#62; 80%）获得完整的尿道上皮组织片层，适用于免疫染色或后续的单细胞分离（图3，补充文件1）。对尿道上皮组织进行单细胞消化后发现，分离物中80–90%为上皮细胞。根据先前的研究，该制备物中的非上皮细胞主要由与上皮相关的免疫细胞和血管内皮细胞组成5。当前的单细胞分离方法通过使用细口径针头抽吸进行机械破碎以消除细胞团块，并通过温和裂解去除红细胞，从而获得高质量的单细胞悬液，适用于流式细胞术和单细胞RNA测序等下游应用。
结果表明，该方法可用于富集特定区室的免疫细胞（图3）。还可分别研究从尿道近端和远端分离的上皮组织。此外，作者证明分离的上皮细胞可用于生成尿道类器官，这些类器官具有&#160;此前尚未被描述图4）。这些结果还表明女性尿道类器官生成能力存在区域差异。尽管作者近期的研究已显示雌性小鼠尿道上皮基因表达和免疫细胞分布具有近端-远端差异5本研究显示，近端尿道上皮细胞形成的类器官少于从远端尿道分离的上皮细胞图4）。将尿道划分为近端和远端的局限性在于，在解剖过程中缺乏可用于区分这两个区域的解剖学标志。在本研究中，作者通过将尿道长度均分为两部分，以获得近端和远端区室。此处描述的上皮分离方法可用于进一步表征近端与远端尿道上皮在基因表达和细胞组成上的差异。
尽管本文介绍的优化方案具有良好的可及性和可重复性，但某些步骤需要反复练习并仔细校准。特别是本方案所示的解剖方法，要求在保留尿道全长的前提下，小心地从耻骨联合下方分离出尿道管。此外，解剖后必须注意清除附着于尿道背侧壁的任何阴道组织。膀胱颈周围存在的脂肪组织应仔细去除，以减少在后续应用（如单细胞RNA测序）中脂肪细胞&#160;污染的风险。此外，每次使用新的胰蛋白酶批次时，都应仔细优化消化条件，以确保消化效果的一致性。组织过度消化可能导致细胞活力下降。作者已对胰蛋白酶消化时间进行了细致优化，建议在4 °C和37 °C孵育步骤中的消化时间为15–30分钟，具体时间可根据所用酶的批次进一步调整。为了实现高效的单细胞消化，将组织切碎成小块也至关重要。作者采用Accutase进行进一步的单细胞消化，因其可实现温和的细胞解离。若出现细胞活力下降的情况，可缩短Accutase的孵育时间。此外，作者在Accutase消化体系中加入了ROCK抑制剂，以提高细胞存活率。建议使用DNase消化，以降解死亡或濒死细胞释放的胞外DNA，从而减少细胞聚团现象。作者还建议使用红细胞裂解缓冲液，以减少红细胞污染，避免对后续实验结果（如流式细胞术和单细胞RNA测序）造成干扰。
本文所述上皮细胞分离方法的一个局限性在于，该方法已针对雌性小鼠尿道进行了优化。雄性小鼠尿道解剖结构更为复杂，从近端到远端尿道的上皮结构存在变化。此外，该方法仅能分离衬于尿道管腔的上皮细胞。与尿道管腔通过短的上皮导管相连的尿道分泌腺无法被分离，因为这些结构嵌于间质组织中。相反，这些上皮结构在分离尿道上皮层后残留的间质组分中得以富集（图3）。
尽管存在这些局限性，该方法已为了解尿道上皮结构提供了重要见解，并将通过原位可视化上皮相关巨噬细胞，进一步推动对上皮相关免疫细胞的研究。该方法已被证实可与单细胞RNA测序流程兼容，用于鉴定尿道上皮及关联免疫细胞的细胞异质性5。此外，能够从尿道近端和远端分离上皮组织，将有助于研究尿道内不同区域的空间差异。尤为重要的是，上皮细胞消化法可获得具有活性的单个细胞，这些细胞能够形成尿道上皮类器官，可用于研究尿道宿主与病原体的相互作用以及上皮生物学特性。总体而言，这些方法丰富了研究工具，有助于更深入地探究尿道上皮生物学。

小鼠下尿路（LUT）由两部分组成：膀胱和尿道。在胚胎发育阶段，下尿路的结构起源于泄殖腔，泄殖腔是一种短暂存在的内胚层来源结构，位于后肠尾端。泄殖腔的腹侧部分即尿生殖窦，其前部形成膀胱，后部形成尿道1。膀胱内衬已有深入研究，其通过顶端由尿斑蛋白（uroplakin proteins）组成的结晶斑形成一道紧密屏障，以抵御尿液成分的渗透2,3,4。尽管膀胱内衬为移行上皮，但从膀胱颈部至远端尿道开口，尿道的上皮结构与膀胱存在差异。此外，尿道在上皮结构和细胞架构方面表现出性别二态性。雄性小鼠尿道在膀胱颈部为移行上皮，随后为柱状上皮和复层上皮；雌性小鼠尿道在膀胱颈部由移行上皮衬覆，向远端则逐渐过渡为多层复层非角化上皮，并分布有通向分泌腺体的小导管5。
女性更容易发生尿路感染（UTIs），这主要由尿路致病性细菌引起，这些细菌从肠道经尿道上行感染膀胱6。尿道是下尿路（LUT）中首先与上行性尿路病原体接触的表面。尿道上皮细胞的功能，尤其是其作为主动免疫屏障的作用，迄今研究尚不充分。同一研究团队近期发表了成年雌性小鼠尿道的单细胞分辨率空间图谱5，揭示了尿道衬层具有基底细胞、中间细胞和顶细胞组成的三层结构。在上皮衬层中还零星分布着少量神经内分泌细胞5,7。在尿道中段区域，一些小导管从尿道主干分支而出，末端连接成群的分泌腺体，这些腺体嵌于尿道的间质区。转录组学数据显示，尿道上皮细胞表达多种免疫调节和抗菌基因，可能在宿主防御中发挥重要作用5。深入研究尿道上皮细胞在防御潜能及免疫调节功能方面的特性，可能为防治尿路感染提供新的策略。
利用小鼠研究尿道上皮可实现对时间动态过程及性别二态性的探究。鉴于小鼠与人类在膀胱和尿道细胞结构方面具有相似性1，小鼠已被广泛用于下尿路胚胎发育的研究1,8,9。此外，小鼠也被应用于经尿道灌注模型，以研究由尿路病原体引起的尿路感染10,11,12 。在临床患者中，除非因癌症或其他疾病接受切除手术，否则难以获取下尿路组织。持续且健康的正常人类组织来源极为有限，因此小鼠为研究下尿路组织的稳态维持、损伤修复以及对炎性刺激的反应提供了有价值的模型。雌性小鼠与人类的尿道内衬在膀胱颈部位均由移行上皮构成，向远端则逐渐转变为复层非角化、非鳞状上皮。在人类女性尿道的远端可观察到鳞状上皮，但随着年龄增长，人类女性尿道内衬存在个体差异5,13。尽管目前尚未在转录组水平上对人类与小鼠尿道内衬进行系统比较，小鼠仍是一个有效的模型，可用于研究尿道上皮的模式形成、上皮-免疫相互作用以及对感染的响应。
在本研究中，作者描述了完整分离成年雌性小鼠尿道、分离尿道上皮组织以及通过温和酶消化制备单细胞悬液的方法。这是首个针对雌性小鼠尿道上皮组织的分离与消化的详细实验方案。优化后的方案可获得富含上皮细胞的单细胞群体，可用于多种下游分析。如研究中所示，作者对尿道上皮细胞分离物的单细胞悬液进行了流式细胞术分析，结果显示存在大量存活的单细胞，且主要为上皮细胞。此外，这些上皮细胞能够在三维培养中形成类器官，其结构类似于分层的小鼠尿道上皮衬里。作者还展示了尿道上皮片的整体染色方法，用于研究与上皮相关联的免疫细胞（特别是巨噬细胞）与尿道上皮细胞之间的相互关系。本文所描述的方法将有助于开展关于尿道上皮及其在免疫防御中作用的研究。

<table><tbody><tr><td>#5 精细镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>30 微米预分离滤器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>用于制作图版</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>用于制作图版</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD326 (EpCAM)</td><td>Invitrogen</td><td>17-5791-82</td><td>1:20 稀释，用于流式细胞术</td></tr><tr><td>Anti-CD45</td><td>Tonbo</td><td>35-0451-U100</td><td>1:20 稀释，用于流式细胞术</td></tr><tr><td>Anti-CDH1 (Rabbit)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>3195S</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Anti-F4/80</td><td>Tonbo</td><td>50-4801-U100</td><td>1:20 稀释，用于流式细胞术</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Rat)</td><td>Invitrogen</td><td>14-4801-82</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 13 (Rabbit)</td><td>Abcam</td><td>ab92551</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 4 (Mouse)</td><td>Abcam</td><td>ab9004</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 5 (Chicken)</td><td>Biolegend</td><td>905904</td><td>1:800 稀释</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 5 (Rabbit)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>71536</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Anti-p63 (Mouse)</td><td>Biocare medical</td><td>CM163A</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Axioobserver 7</td><td>Zeiss</td><td>431007-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)，第五组分</td><td>Genetix</td><td>PG-2330</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 小鼠</td><td>Charles River, USA</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex BME</td><td>R&amp;D systems</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Qualigens</td><td>Q15405</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Himedia</td><td>MB058</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠 (Na2HPO4)</td><td>Qualigens</td><td>Q15825</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>驴抗鸡 IgG (H+L) (AF488)</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>703-545-155</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG (H+L) (AF488)</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>715-545-151</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG (H+L) (AF594)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-585-151</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H+L) (AF594)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-585-152</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H+L) (AF647)</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>711-605-152</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG (H+L) (AF647)</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>712-605-153</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG (H+L) (AF594)</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>712-585-153</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-315-09</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Himedia</td><td>GRM938</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Supelco</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt 封片介质&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>PeproTech</td><td>450-61</td><td></td></tr><tr><td>带滤帽分选管</td><td>&amp;nbsp;Falcon/Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye&amp;trade; Violet 450</td><td>Tonbo biosciences</td><td>13-0863-T100</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>无水甘油</td><td>Merck</td><td>DA1P692899</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Polysciences</td><td>24243</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza Analysis</td><td>Beckman Coulter</td><td>Kaluza Analysis 2.4</td><td>流式细胞术数据分析</td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl2)</td><td>Qualigens</td><td>Q15535</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Noggin&amp;nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>AF-250-38</td><td></td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸丙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>石蜡&amp;nbsp;</td><td>Qualigens</td><td>Q19215</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q13305</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH2PO4)</td><td>Qualigens</td><td>19465</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>RBC 裂解缓冲液 (10X)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>TNB-4300-L100</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Rocki&amp;nbsp; (Y-27632)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>13624S</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>PeproTech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 (7.5% w/v 溶液)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>Stero Zoom 体视显微镜</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ18</td><td>用于上皮组织分离</td></tr><tr><td>SuperFrostTM PLUS 黏附载玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71896-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Hi-Media</td><td>MB029</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TrueVIEW 自发荧光淬灭试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400-15</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>猪胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure LMP 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Qualigens</td><td>Q32295</td><td></td></tr></tbody></table>

一种优化的小鼠女性尿道上皮分离方法用于单细胞及免疫荧光分析

An Optimized Method To Isolate Female Mouse Urethral Epithelium For Single-Cell And Immunofluorescence Analysis

尿道由上皮细胞衬覆，是尿液排出体外的通道。尿道上皮层包含多种具有特定基因表达特征的细胞类型，提示其在抗菌和免疫防御中发挥作用。嵌于尿道上皮层中的常驻巨噬细胞代表一种转录上独特的亚型，据称参与免疫监视和抗原呈递。尿路病原体经尿道上行至膀胱。对尿道上皮层及其相关免疫细胞的研究将有助于阐明下尿路的宿主防御机制。本方案的核心目标是提供优化的方法，用于分离雌性小鼠尿道并获取上皮层，以进行后续分析。该方案描述了一种通过温和的酶解和机械分离方法，从雌性小鼠尿道中分离上皮组织的优化流程。在完成上皮分离后，进一步介绍了通过温和酶消化法处理分离的尿道上皮组织及其相关免疫细胞，以获得高存活率的单细胞悬液的技术。本方案还详细说明了对分离的小鼠尿道上皮细胞及上皮相关免疫细胞进行流式细胞术分析的方法。此外，本文提供了由分离的上皮细胞生成分层三维尿道上皮类器官的方法。方案中还详述了一种用于尿道上皮片整体免疫染色的优化方法，可用于观察小鼠尿道上皮及其相关免疫细胞的形态学和分子结构。总体而言，本文所述的小鼠尿道上皮细胞的分离与单细胞消化方法，可支持包括免疫染色、流式细胞术、类器官生成以及单细胞RNA测序在内的多种下游分析。

成年雌性小鼠尿道的解剖与采集
在本研究的第一部分，作者提供了一种小鼠雌性尿道解剖的详细方案。由于尿道附着于阴道前壁，并位于耻骨联合下方，本方法可实现完整雌性尿道的清晰解剖（图1）。
尿道上皮组织的分离及单细胞流式细胞术分析
胰蛋白酶消化可使尿道上皮层与周围间质组织易于分离。分离后可观察到透明度高于间质组织的上皮片层（图2）。分离得到的上皮片层经酶消化后可获得单细胞悬液。通过台盼蓝染色在血细胞计数板上检测，从尿道上皮分离的单细胞始终表现出较高的存活率（&gt;80%）（图2L），并可通过使用活细胞染料进行流式细胞术分析以圈定活细胞（图3，补充文件1）。
作者通过流式细胞术评估了从尿道上皮单细胞悬液中富集上皮细胞的效果。为检测细胞活力，将细胞悬液用活/死细胞染料（一种胺反应性鬼染料 V450）进行染色。作者通过活/死标记 consistently 观察到细胞活力 &gt;80%。该活/死标记有助于在流式分析过程中排除碎片和死细胞。他们使用上皮细胞标记物（CD326/EPCAM）、巨噬细胞标记物（F4/80）以及免疫细胞标记物（CD45）对样本进行染色，以记录通过该方法分离得到的细胞组成。流式细胞术结果显示，作者成功从雌性小鼠尿道上皮中分离出富集的上皮细胞群体。在两次独立实验中，经活细胞设门后，EPCAM 阳性上皮细胞的比例均达到 80–90%。作者还在上皮细胞制备物中观察到约 1.30% 的 CD45+ 免疫细胞。与上皮层相关的巨噬细胞约占上皮区室中活细胞的 1.18%。对来自上皮片层的单细胞悬液进行流式细胞术分析显示，间质污染极少（5–6%），根据他们之前的研究5，这些污染主要来源于血管内皮。补充文件 1 展示了来自上皮区室和间质区室单细胞制备物的流式细胞术结果。与从上皮区室分离得到的上皮细胞 80–90% 的富集度相比，间质区室中也含有 40–50% 的上皮细胞，这些细胞来源于从尿道腔延伸至周围间质中的短导管和腺上皮（图 3，补充文件 1）。
尿道上皮类器官培养、组织学与免疫染色
作者还展示了从尿道分离的单个上皮细胞具有活力，并能在三维基质中形成类器官，观察到单个尿道上皮细胞在培养至第6天时的类器官生长情况（图4B–G）。他们进行了苏木精-伊红染色（H&amp;E）以观察类器官的组织学结构（图4H–J）。作者观察到尿道上皮类器官存在两种不同的形态：一种体积较大且中空，另一种较小且为实心结构。在两种情况下，类器官均呈现分层结构，并重现了女性尿道上皮衬里中表达的标志物，包括标记基底层的KRT5和P63，以及标记上基底层/中间细胞层的KRT4和KRT13（图4K–N），补充图1）。研究还比较了近端与远端尿道之间类器官形成能力的差异。源自近端尿道的类器官中空结构比例更高，而来自远端尿道的类器官则形成实心球状结构（图4O–P）。此外，作者还观察到从尿道近端和远端分离的上皮细胞在类器官形成效率上的差异。在相同的初始接种密度（5000个细胞/滴）下，远端尿道上皮细胞形成类器官的效率高于近端尿道上皮细胞（图4Q–S）。
分离尿道上皮组织的整体免疫染色
研究人员还提出了一种优化的小鼠雌性尿道上皮组织全封片染色方法。在此方法中，他们使用两种标记物对上皮组织片进行染色：F4/80 用于标记巨噬细胞，E-钙黏蛋白/CDH1 用于标记上皮细胞间的细胞连接（图5）。组织样本使用配备 Apotome 3 光学切片系统的蔡司 Axio Observer 7 显微镜进行成像。上皮组织片显示出 CDH1 抗体的强阳性标记信号。使用 F4/80 抗体标记的尿道上皮全封片显示，巨噬细胞在上皮层内形成树突状分支结构。可观察到巨噬细胞向尿道上皮细胞之间延伸出树突样突起。总体而言，结果表明本文所述实验方案可用于研究小鼠雌性尿道上皮层的结构与特征。
<img alt="小鼠解剖顺序；解剖学研究；子宫和膀胱暴露；科学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70973/70973fig1.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图1"> 
图1：用于采集雌性小鼠尿道的解剖操作。（A）将小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇喷洒腹部。（B–C）提起皮肤并做垂直切口以打开腹腔。（D）修剪脂肪和结缔组织，暴露呈蝴蝶状、在（黑色箭头所示）耻骨联合处相连的耻骨。（E）剪开耻骨联合。（F）去除耻骨后，可见尿道从膀胱向下延伸（以黑色虚线轮廓标示）。（G）用镊子轻轻提起膀胱，尿道清晰可见，呈一条细的红色管道。（H–I）将膀胱从体腔中向上牵拉，利用张力使尿道与阴道前壁分离。将剪刀插入尿道与阴道壁之间，分离泌尿道与生殖道。（J–K）分离附着于皮肤的尿道远端。（L）雌性小鼠下尿路（FLUT）解剖后图像，显示膀胱与尿道。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/70973fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="尿道组织的酶消化及上皮与间质组分的分离示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70973/70973fig2.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图 2"> 
图 2：尿道上皮的分离及单细胞悬液的制备。（A）示意图显示尿道上皮和间质组分的酶消化与机械分离过程，随后进行单细胞消化。（B）清除女性下尿路多余的脂肪组织。（C–F）从膀胱颈区域切断尿道，以将尿道与膀胱分离，然后使用精细剪刀将尿道沿纵轴剪成两半。（G）用1× HBSS溶液冲洗尿道组织片段，并通过100微米滤网过滤。（H）将尿道组织碎片转移至1%胰蛋白酶溶液中，在低温室中置于样品旋转仪上孵育。向同一管中加入MgCl₂和DNase I，随后在杂交炉中37 °C、样品旋转仪上继续孵育。（I–J）用精细镊子沿尿道片段长度方向轻轻挤压，以分离上皮层。（K）使用精细剪刀将组织剪碎成小片段，将剪碎的上皮组织转移至Accutase消化液中，并在杂交炉中37 °C、样品旋转仪上孵育。（L）使用血细胞计数板和台盼蓝染色对上皮细胞进行计数并评估细胞活力。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/70973fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；尿道上皮和间质的散点图；CD45、CD326标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70973/70973fig3.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图3"> 
图3：通过流式细胞术分析尿道上皮和间质区室的单细胞悬液。对来自小鼠尿道混合样本的单细胞制备物进行流式细胞术分析，包括（A）上皮区室和（B）间质区室。通过Ghost Dye V450染色排除死细胞，对活细胞进行设门分析。检测活细胞中CD45（泛免疫标记物）、CD326/EPCAM（泛上皮标记物）以及F4/80（小鼠巨噬细胞标记物）的表达情况。数据代表了两次独立实验的结果，每次实验使用5–6只小鼠的组织混合后制备上皮和间质样本。缩写：SSC-A = 侧向散射峰值面积；FITC = 异硫氰酸荧光素；APC = 别藻蓝蛋白；PE = 藻红蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/70973fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="尿道类器官形成过程；小鼠细胞包埋、胰蛋白酶消化；显微镜图像、图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70973/70973fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图 4"> 
图 4：尿道上皮类器官的组织学与免疫染色分析。（A）尿道上皮类器官生成流程示意图。（B–G）由单细胞体外扩增不同时间点生成的尿道上皮类器官（UEOs）的代表性明场显微图像。（H）中空型和（I）实心型尿道上皮类器官（UEOs）经苏木精-伊红（H&amp;E）染色后的代表性明场图像。（J）三次独立实验中生成的类器官类型的量化结果。误差线表示均值的标准误。（K）中空型和（L）实心型尿道上皮类器官（UEOs）经上皮标志物KRT13（表层上皮标志物）、KRT5（基底上皮标志物）和P63（基底上皮标志物）免疫染色的代表性图像。单个荧光通道的图像分别显示于K’、K’’、K’’’、L’、L’’和L’’’。（M）中空型和（N）实心型尿道上皮类器官（UEOs）经上皮标志物KRT4（表层上皮标志物）和KRT5（基底上皮标志物）免疫染色的代表性图像。单个荧光通道的图像分别显示于M’、M’’、N’和N”。（O）近端与远端尿道解剖示意图。（P）两次独立实验中从近端和远端尿道生成的类器官类型的量化结果。（Q）从近端尿道和（R）远端尿道分离的上皮细胞生成的第6天尿道上皮类器官（UEOs）的代表性明场显微图像。完整尿道来源类器官的数据代表了3次独立实验，每次实验使用3–5只小鼠的混合样本。（S）近端与远端尿道来源类器官的数据代表了2次独立实验，每次实验使用3–4只小鼠的混合样本。细胞核用DAPI标记（蓝色）。（比例尺：100 µM）。示意图使用BioRender和Adobe Illustrator绘制。在BioRender中创建。Binoy joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/70973fig4largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="E-cadherin+F4/80 免疫染色图示；上皮分离；显微镜检查；细胞分析；成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70973/70973fig5.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图 5"> 
图 5：尿道上皮片的整体免疫染色。（A）成年雌性小鼠尿道在最佳切割介质中的10微米冷冻切片，显示小鼠巨噬细胞标志物F4/80（红色）和上皮蛋白E-cadherin/CDH1（绿色）的免疫染色。（A’）为（A）中插图的放大视图。（B）示意图展示分离的尿道上皮片进行整体染色的步骤。对分离的雌性小鼠尿道上皮层进行整体免疫染色，使用针对小鼠巨噬细胞标志物F4/80（红色）和上皮蛋白E-cadherin/CDH1（绿色）的抗体。（C）合并视图的代表性图像。（D）红色通道的正交最大强度投影，显示巨噬细胞的排列。（E–F）上皮及关联巨噬细胞的放大视图。白色标尺，50 µM。灰色标尺，500 µM。数据代表在4–5只小鼠组成的样本池上进行的2次独立实验的结果。示意图使用BioRender和Adobe Illustrator绘制。由BioRender制作。Binoy joseph, D.（2026）https://BioRender.com/tjh9opk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/70973fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 1：1x HBSS（无钙、镁）的配制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/Supplementary%20Table%201%20(9).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：1x sHBSSa 和 1% 胰蛋白酶溶液的配制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/Supplementary%20Table%202%20(5).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 3：细胞/流式染色缓冲液的配制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/Supplementary%20Table%203%20(4).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 4：尿道上皮类器官扩增培养基的制备。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/Supplementary%20Table%204%20(1).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表5：马封闭缓冲液的配制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/Supplementary%20Table%205%20(1).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1： 两次独立实验中来自尿道上皮和间质区室的单细胞进行流式细胞术实验的细胞计数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/Supplementary%20File%201_Flow%20Experiment%20Data.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 1： 成年雌性小鼠尿道上皮与尿道上皮类器官的比较。 （A）成年雌性小鼠尿道上皮、（B）中空尿道上皮类器官和（C）实心尿道上皮类器官（UEOs）的代表性图像，使用上皮标志物 KRT13（表层上皮标志物）、KRT5（基底层上皮标志物）和 P63（基底层上皮标志物）进行免疫染色。单个荧光通道的图像分别显示于 A’、A’’、A’’’、B’、B’’、B’’’、C’、C’’ 和 C’’’。代表性图像还包括（D）成年雌性小鼠尿道上皮、（E）中空尿道上皮类器官和（F）实心尿道上皮类器官（UEOs），使用上皮标志物 KRT4（表层上皮标志物）和 KRT5（基底层上皮标志物）进行免疫染色。单个荧光通道的图像分别显示于 D’、D’’、E’、E’’、F’ 和 F”。数据代表了3次独立实验的结果，每次实验使用3–4只小鼠的样本合并进行。细胞核用DAPI标记（蓝色）。（比例尺，100 µM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70973/Supplementary%20Figure%201_Urethra%20and%20UEOs_A4.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了一种优化的小鼠成年雌性尿道上皮层分离方法，可用于后续分析，包括流式细胞术、免疫染色和类器官培养。实验结果表明，该方法可获得富集且具有活性的尿道上皮细胞，流式细胞术分析、整体组织成像以及高效的类器官形成均证实了这一点。

尿道由上皮细胞衬覆，作为尿液排出体外的通道。尿道上皮衬层包含不同的……

本研究团队致力于探索泌尿生殖道上皮的模式形成。本方案提供了一种优化的方法，用于分离雌性小鼠尿道的上皮层，以便进行后续的分子与细胞分析。本文所述方法将有助于开展针对雌性尿道上皮及其在免疫防御中作用的相关研究。首先，将一只6至12周龄的雌性CD1小鼠处死后仰卧置于解剖台上。用70%乙醇喷洒腹部以浸湿毛发。使用镊子提起腹部皮肤。然后用小剪刀向下体方向做一纵向切口，至尿道外口处停止。辨认膀胱，并用镊子轻轻提起，确保膀胱内无尿液。用剪刀修剪膀胱周围的脂肪和结缔组织，以暴露呈蝴蝶状的结构，即两侧耻骨在耻骨联合处相连接的区域。观察位于耻骨联合下方的尿道。然后用镊子提起耻骨联合，用剪刀将其剪开。去除耻骨碎片，以暴露位于阴道壁腹侧表面的细薄尿道。使用精细镊子，轻轻将膀胱从体腔中向上提起。用剪刀沿尿道与阴道壁之间剪开，以分离泌尿道与生殖道。在沿尿道后方剪切以分离阴道壁时，保持膀胱轻微张力。继续切割至远端尿道开口，以获取全长的小鼠尿道，其长度为1.2至1.5厘米。接下来，在膀胱颈处进行一次切割，将尿道与膀胱分离。将四到五根尿道收集于一个无菌培养皿中，培养皿内含有不含钙和镁的新鲜HBSS。在解剖显微镜下，使用尖头镊子和剪刀修剪尿道周围的脂肪和结缔组织。然后用剪刀将每根尿道横向切成大小相等的两段。将组织片段置于100微米的尼龙网筛上。用1毫升HBSS洗涤组织块，然后将其转移至含有1毫升HBSS配制的1%胰蛋白酶（添加抗生素和抗真菌剂）的1.5毫升微量离心管中。接着，将样品置于旋转仪上，在30转/分钟、4°C条件下孵育15至30分钟。消化完成后，向管中加入HBSS配制的10毫摩尔氯化镁，随后加入PBS配制的10微克/毫升DNA酶I。将试管置于37摄氏度杂交炉内的旋转仪上孵育15至30分钟。为终止胰蛋白酶消化，将尿道组织转移至含有10%羊血清的HBSS溶液的1.5毫升微量离心管中，室温下孵育。五分钟后，将尿道组织转移至另一含有冰浴HBSS的新离心管中，随后转移至含有冰浴HBSS的无菌培养皿中。在显微镜下观察样本时，用一对镊子夹住尿道组织的一端。用另一对镊子沿尿道组织全长轻轻推动，以挤出透明的上皮层。将部分分离得到的尿道上皮层直接用于全组织免疫染色，以原位观察上皮细胞及与上皮相关联的巨噬细胞。使用小型塑料移液管将来自四至五只小鼠尿道组织混合样本的上皮组织碎片转移到含有 HBSS 的液滴中，并将其移至无菌培养皿内。用剪刀将上皮组织剪切成小片段。将剪碎的上皮组织片段转移至含有 1.5 毫升预热至 37 摄氏度的 Accutase 消化液的 2 毫升微量离心管中。将样品在旋转仪上37摄氏度孵育一小时。孵育结束后，将全部内容物转移至含有2毫升洗涤缓冲液的5毫升离心管中，洗涤缓冲液由不含钙和镁的1×PBS及1% BSA组成。使用摆桶转子，在4摄氏度下以600 ×g离心5分钟。接下来，使用温和的真空抽吸去除上清液。然后用1 mL带滤芯吸头的移液器将沉淀重悬于1 mL洗涤缓冲液中。通过反复吹打使沉淀分散，直至团块变小。将悬液依次通过23.5号和26.5号针头，每根针头连接1毫升注射器，各推注4次。接着，加入1毫升洗涤缓冲液，润湿置于5毫升离心管上方的30微米预分离滤膜表面。使用连接26.5号针头的注射器，将1毫升细胞悬液通过滤膜过滤。然后用一毫升洗涤缓冲液清洗离心管，并使其通过滤膜。使用摆桶转子，在4°C条件下以600 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。吸除上清液。将沉淀重悬于100微升洗涤缓冲液中，并加入100微升红细胞裂解缓冲液。准确孵育3分钟后，加入4毫升洗涤缓冲液并混匀。使用摆桶转子，在4°C条件下以600 × g离心5分钟，收集细胞。根据沉淀物的大小，将上清液弃去，然后在 50 至 200 微升洗涤缓冲液中重悬沉淀。取 5 微升细胞等分试样与 5 微升台盼蓝混合，将混合液加入血细胞计数板，以评估细胞得率和活力。通过流式细胞术评估细胞活力并定量不同细胞群体。将尿道上皮单细胞培养于基底膜基质和类器官扩增培养基中，以生成三维尿道上皮类器官。对包埋的类器官切片进行苏木精-伊红染色和荧光免疫染色，以观察类器官的结构和细胞组成。分离后，所获得的尿道上皮鞘透明度高于间质组织。上皮鞘的整体免疫染色显示，E-钙黏蛋白 CDH1 抗体具有强阳性标记。使用 F480 抗体对上皮鞘进行染色，显示出巨噬细胞在尿道上皮细胞之间形成分支状树突结构。从尿道上皮分离的单个细胞经台盼蓝排斥法在血细胞计数板上检测，以及使用胺反应性 Ghost Dye V 450 进行流式细胞术分析，均显示出 consistently 高的细胞活力。在对活细胞进行分选后，分离得到的细胞中上皮细胞比例显著富集。单细胞悬液中约含有1.3%的CD45阳性免疫细胞和1.18%的巨噬细胞。从尿道分离得到的单个上皮细胞在体外培养中保持活性，并能在三维基质中形成类器官，类器官的生长可持续观察至培养的第6天。苏木精-伊红染色显示尿道上皮类器官具有两种不同的形态，包括较大的中空类器官和较小的实心类器官。中空和实心的尿道上皮类器官均为复层结构，在基底层表达KRT5和P63，在上基底层和中间细胞层表达KRT-13。由近端尿道生成的类器官表现出更高比例的中空类器官，而远端尿道来源的类器官则形成更多实心球状结构。本方案使研究人员能够研究近端和远端尿道的尿道细胞类型及上皮细胞的自我更新能力。该方案最重要的考虑因素之一是完整尿道的精细解剖以及最佳的酶消化条件，以获得可用于后续分析的有活力的尿道上皮细胞。本方案产生的上皮细胞可用于多种应用，包括单细胞RNA测序、批量RNA测序、流式细胞术、免疫染色以及类器官培养。

an-optimized-method-to-isolate-female-mouse-urethral-epithelium-for

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种优化方法：分离雌鼠尿道上皮以进行单细胞和免疫荧光分析

本视频将演示经尿道诱导小鼠尿路感染的方法，并量化由此产生的感染程度。...

经尿道诱导小鼠尿路感染

在此，我们描述一种高效的高通量方法 原位...

高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

介绍了一种从小鼠生殖道中高效分离淋巴细胞的方法。该方法利用酶消化和Percoll梯度分离，实现高效的细胞分离。此技术也可适用于其他物种。...

从小鼠生殖道黏膜中分离淋巴细胞

来源：Yang, E., et al．从尿路感染小鼠模型中分离用于下游单细胞分析的单个胞内细菌群落．J. Vis. Exp. （2019）本视频展示了利用口控微量移液技术，从受感染小鼠膀胱中手动分离含有胞内细菌群落的单个上皮细胞的方法，从而实现对尿路感染模型中与宿主相关的可存活 E. coli...

分离含胞内细菌群落的小鼠膀胱上皮细胞

在本视频中，我们介绍了从雄性小鼠模型中分离泌尿生殖系统（UGS）的操作步骤。该泌尿生殖系统可在体外进一步解剖，以分离前列腺组织，并研究其在前列腺癌发生过程中的作用。...

从小鼠泌尿生殖系统中分离前列腺：一种将雄性小鼠前列腺腺体与其他泌尿及生殖器官分离的技术

关键词：前列腺分离，小鼠，泌尿系统，生殖系统，雄性小鼠，器官分离

已建立的小鼠经尿道插管模型可用于研究膀胱病理状态，包括尿路感染，但该模型仅适用于雌性小鼠。本文介绍一种新的雄性小鼠经尿道灌注模型，将有助于推动在临床上和流行病学上存在显著性别差异的领域的研究。...

小型动物模型中的尿路感染：雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术

本方案描述了一种从尿路感染的小鼠模型中分离单个受感染膀胱上皮细胞的简单方法。...

从小鼠尿路感染模型中分离用于下游单细胞分析的单个胞内细菌群落

本方案描述了利用透射 illumination...

透射光辅助分离小鼠生精上皮周期特定阶段用于后续免疫染色分析

介绍了一种小鼠输卵管显微解剖方法，该方法可在保持RNA完整性的前提下分离并收集输卵管的各个节段。此外，还描述了一种非酶法的输卵管细胞解离步骤。这些方法适用于对功能不同的输卵管节段以及解离后的输卵管细胞进行后续的基因和蛋白质分析。...

小鼠输卵管的显微解剖与分离：各节段识别及单细胞获取

本方案描述了建立小鼠子宫内膜上皮类器官以进行基因表达和组织学分析的方法。...

从小鼠子宫建立三维子宫内膜类器官

本方案描述了一种从人类输卵管上皮组织中分离上皮细胞的一日法。分离得到的上皮细胞可用于二维（2D）培养，或解离为单细胞悬液，进而应用于后续实验，包括流式细胞术和单细胞RNA测序。...

一种高效提取人输卵管上皮细胞用于单细胞分析的方法

学习优化方法分离雌鼠尿道上皮细胞，用于单细胞RNA测序、流式细胞术和免疫荧光分析。该技术可生成高活性细胞悬液和三维类器官，助力研究下尿路宿主防御机制。

一种优化的小鼠女性尿道上皮分离方法用于单细胞及免疫荧光分析

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