一种优化的小鼠女性尿道上皮分离方法用于单细胞及免疫荧光分析

本研究团队致力于探索泌尿生殖道上皮的模式形成。本方案提供了一种优化的方法，用于分离雌性小鼠尿道的上皮层，以便进行后续的分子与细胞分析。本文所述方法将有助于开展针对雌性尿道上皮及其在免疫防御中作用的相关研究。

首先，将一只6至12周龄的雌性CD1小鼠处死后仰卧置于解剖台上。用70%乙醇喷洒腹部以浸湿毛发。使用镊子提起腹部皮肤。

然后用小剪刀向下体方向做一纵向切口，至尿道外口处停止。辨认膀胱，并用镊子轻轻提起，确保膀胱内无尿液。用剪刀修剪膀胱周围的脂肪和结缔组织，以暴露呈蝴蝶状的结构，即两侧耻骨在耻骨联合处相连接的区域。

观察位于耻骨联合下方的尿道。然后用镊子提起耻骨联合，用剪刀将其剪开。去除耻骨碎片，以暴露位于阴道壁腹侧表面的细薄尿道。

使用精细镊子，轻轻将膀胱从体腔中向上提起。用剪刀沿尿道与阴道壁之间剪开，以分离泌尿道与生殖道。在沿尿道后方剪切以分离阴道壁时，保持膀胱轻微张力。

继续切割至远端尿道开口，以获取全长的小鼠尿道，其长度为1.2至1.5厘米。接下来，在膀胱颈处进行一次切割，将尿道与膀胱分离。将四到五根尿道收集于一个无菌培养皿中，培养皿内含有不含钙和镁的新鲜HBSS。

在解剖显微镜下，使用尖头镊子和剪刀修剪尿道周围的脂肪和结缔组织。然后用剪刀将每根尿道横向切成大小相等的两段。将组织片段置于100微米的尼龙网筛上。

用1毫升HBSS洗涤组织块，然后将其转移至含有1毫升HBSS配制的1%胰蛋白酶（添加抗生素和抗真菌剂）的1.5毫升微量离心管中。接着，将样品置于旋转仪上，在30转/分钟、4°C条件下孵育15至30分钟。消化完成后，向管中加入HBSS配制的10毫摩尔氯化镁，随后加入PBS配制的10微克/毫升DNA酶I。

将试管置于37摄氏度杂交炉内的旋转仪上孵育15至30分钟。为终止胰蛋白酶消化，将尿道组织转移至含有10%羊血清的HBSS溶液的1.5毫升微量离心管中，室温下孵育。五分钟后，将尿道组织转移至另一含有冰浴HBSS的新离心管中，随后转移至含有冰浴HBSS的无菌培养皿中。

在显微镜下观察样本时，用一对镊子夹住尿道组织的一端。用另一对镊子沿尿道组织全长轻轻推动，以挤出透明的上皮层。将部分分离得到的尿道上皮层直接用于全组织免疫染色，以原位观察上皮细胞及与上皮相关联的巨噬细胞。

使用小型塑料移液管将来自四至五只小鼠尿道组织混合样本的上皮组织碎片转移到含有 HBSS 的液滴中，并将其移至无菌培养皿内。用剪刀将上皮组织剪切成小片段。将剪碎的上皮组织片段转移至含有 1.5 毫升预热至 37 摄氏度的 Accutase 消化液的 2 毫升微量离心管中。

将样品在旋转仪上37摄氏度孵育一小时。孵育结束后，将全部内容物转移至含有2毫升洗涤缓冲液的5毫升离心管中，洗涤缓冲液由不含钙和镁的1×PBS及1% BSA组成。使用摆桶转子，在4摄氏度下以600 ×g离心5分钟。

接下来，使用温和的真空抽吸去除上清液。然后用1 mL带滤芯吸头的移液器将沉淀重悬于1 mL洗涤缓冲液中。通过反复吹打使沉淀分散，直至团块变小。

将悬液依次通过23.5号和26.5号针头，每根针头连接1毫升注射器，各推注4次。接着，加入1毫升洗涤缓冲液，润湿置于5毫升离心管上方的30微米预分离滤膜表面。使用连接26.5号针头的注射器，将1毫升细胞悬液通过滤膜过滤。

然后用一毫升洗涤缓冲液清洗离心管，并使其通过滤膜。使用摆桶转子，在4°C条件下以600 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。吸除上清液。

将沉淀重悬于100微升洗涤缓冲液中，并加入100微升红细胞裂解缓冲液。准确孵育3分钟后，加入4毫升洗涤缓冲液并混匀。使用摆桶转子，在4°C条件下以600 × g离心5分钟，收集细胞。

根据沉淀物的大小，将上清液弃去，然后在 50 至 200 微升洗涤缓冲液中重悬沉淀。取 5 微升细胞等分试样与 5 微升台盼蓝混合，将混合液加入血细胞计数板，以评估细胞得率和活力。通过流式细胞术评估细胞活力并定量不同细胞群体。

将尿道上皮单细胞培养于基底膜基质和类器官扩增培养基中，以生成三维尿道上皮类器官。对包埋的类器官切片进行苏木精-伊红染色和荧光免疫染色，以观察类器官的结构和细胞组成。分离后，所获得的尿道上皮鞘透明度高于间质组织。

上皮鞘的整体免疫染色显示，E-钙黏蛋白 CDH1 抗体具有强阳性标记。使用 F480 抗体对上皮鞘进行染色，显示出巨噬细胞在尿道上皮细胞之间形成分支状树突结构。从尿道上皮分离的单个细胞经台盼蓝排斥法在血细胞计数板上检测，以及使用胺反应性 Ghost Dye V 450 进行流式细胞术分析，均显示出 consistently 高的细胞活力。

在对活细胞进行分选后，分离得到的细胞中上皮细胞比例显著富集。单细胞悬液中约含有1.3%的CD45阳性免疫细胞和1.18%的巨噬细胞。从尿道分离得到的单个上皮细胞在体外培养中保持活性，并能在三维基质中形成类器官，类器官的生长可持续观察至培养的第6天。

苏木精-伊红染色显示尿道上皮类器官具有两种不同的形态，包括较大的中空类器官和较小的实心类器官。中空和实心的尿道上皮类器官均为复层结构，在基底层表达KRT5和P63，在上基底层和中间细胞层表达KRT-13。

由近端尿道生成的类器官表现出更高比例的中空类器官，而远端尿道来源的类器官则形成更多实心球状结构。本方案使研究人员能够研究近端和远端尿道的尿道细胞类型及上皮细胞的自我更新能力。该方案最重要的考虑因素之一是完整尿道的精细解剖以及最佳的酶消化条件，以获得可用于后续分析的有活力的尿道上皮细胞。

本方案产生的上皮细胞可用于多种应用，包括单细胞RNA测序、批量RNA测序、流式细胞术、免疫染色以及类器官培养。