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本工作得到国家自然科学基金青年项目（编号：82405539）、广东省基础与应用基础研究基金项目（编号：2023A1515110322，2025A1515011811）、中华中医药学会青年人才支持计划（编号：2025-QNRC2-B16）、国家中医药综合改革示范区科技共建项目（编号：GZY-KJS-GD-2025-048，GZY-KJS-GD-2025-033）以及广州中医药大学针灸推拿学学科基础巩固专项项目的资助。

本方案已获得广州中医药大学动物护理与使用委员会的批准（编号：00379474），并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》所制定的指南和规定进行。本研究已采取一切可能的措施以尽量减少所使用的动物数量。
1. 病毒载体递送
注意：本节描述将星形胶质细胞特异性的腺相关病毒（AAV）载体立体定位注射至运动皮层（M1FL）的操作。目的是在光探针植入前，实现星形胶质细胞中GCaMP6s钙指示剂和光遗传学工具opto-vTRAP的稳定且特异性表达。所需主要设备包括：立体定位仪、数字游标系统、玻璃微量移液管和微输注泵。
<ol>
	<li>将小鼠放入诱导室；使用 3%–4% 异氟烷开始麻醉诱导，必要时可在第一分钟内将异氟烷浓度最高增加至 5%，直至小鼠无反应。  
	注意：异氟烷为挥发性麻醉剂。所有操作均应在有效通风条件下进行。避免长时间个人暴露。</li>
	<li>将小鼠转移至配备麻醉面罩的立体定位仪，并使用 1–2% 异氟烷维持深度麻醉状态。</li>
	<li>每 10 分钟通过呼吸节律、眼睑反射和脚趾夹捏检查一次麻醉深度。使用反馈控制加热垫维持小鼠体温在 36–37.5 °C。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止手术期间角膜损伤。</li>
	<li>使用耳杆和门齿固定杆将小鼠固定在立体定位仪上。调整耳杆位置，确保小鼠头部对称固定。通过轻柔探查确认头部完全固定。</li>
	<li>使用脱毛膏彻底去除毛发，然后用 10% 聚维酮碘清洁手术区域。使用手术剪做正中切口以暴露颅骨。用生理盐水和棉签清理骨膜，暴露前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。</li>
	<li>降低玻璃微电极依次接触前囟和后囟；记录数字游标上的 Z 坐标。调整门齿固定杆，确保两者差异 &lt;0.04 mm。</li>
	<li>将玻璃微电极降至前囟处并重置数字游标为零。随后将微电极分别向左、右两侧移动至距前囟 ±2.3 mm 处；记录数字游标上的 Z 坐标。调整耳杆，确保双侧差异 &lt;0.04 mm。</li>
	<li>在前囟处将数字游标重置为零，并标记运动皮层（M1FL；AP: +1.5 mm，ML: +0.74 mm）。使用配备 0.5 mm 钻头（圆头）的微型钻机，在标记位置钻出直径约 0.5 mm 的小孔。钻孔时应小心操作，避免出血和脑组织损伤；滴加冰生理盐水以抵消钻孔过程中产生的热量。</li>
	<li>将连接至微输注泵的玻璃微电极下降至目标位置（DV: 脑表面下 -0.94 mm）。注射前，将 AAV9-GfaABC1D-GCaMP6s 与 AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP 等体积混合，配制病毒混合液。以 50 nL/min 的速率注入 400 nL 混合液（每种载体各 200 nL）。 
	注意：病毒混合液包含：200 nL 星形胶质细胞特异性钙指示剂（AAV-GfaABC1D-GCaMP6s，1.0 × 1013 vg/mL）和 200 nL 星形胶质细胞特异性光遗传病毒载体（AAV-GfaABC1D-opto-vTrap，1 × 1013 vg/mL）。在部分动物中通过 GFAP 免疫荧光染色验证了星形胶质细胞特异性转导，结果显示荧光报告基因与 GFAP 阳性细胞共定位，且在 GFAP 阴性细胞中无表达。      
	注意：AAV 载体为重组生物制剂；所有病毒载体及废弃物均须按照所在机构的生物安全指南进行处理。</li>
	<li>输注完成后将电极留置 10 分钟，以促进病毒更好扩散并防止回流。缓慢撤出电极，缝合头皮（4-0，20 mm，3/8 圆针），并将小鼠置于加热垫上直至完全恢复。 
	注意： 需要 3–4 周时间以实现最佳病毒表达。本方案的详细时间线见 图 1A。</li>
</ol>
2. 光电极检查与功能验证
注意：在植入前，必须对定制的光导电极进行物理检查，并通过光学测试确认其能够在所有三种功能模式下（光栓塞、光遗传学刺激和光纤光度测定）正常传递光。所需主要设备包括：显微镜、光功率计，以及波长分别为532 nm、488 nm、470 nm和405 nm的激光光源。
<ol>
	<li>光探针的物理检查：
	<ol>
		<li>将制备好的光探针置于显微镜下，检查记录位点的排列情况。</li>
		<li>确保16根钨丝微电极均匀捆束，并围绕在中心光学纤维周围。检查是否存在弯曲或交叉的导线，以免引起电短路。</li>
		<li>确认光学纤维尖端短于钨丝微电极尖端（图1B）。 
		注意：光学纤维尖端应比电极尖端内缩100–200 µm23。该偏移量参考自Lee等人的研究22，可确保光锥充分覆盖记录区域，同时避免产生过量的光电噪声。建议研究人员在各自使用的光探针上通过实验验证合适的偏移量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将光学纤维连接至激光建模光源和记录光源。使用光功率计测量光纤尖端在以下三种功能模式下的输出（图1B）：
	<ol>
		<li>光栓塞建模模式：验证系统能否输出高强度连续波（CW）光（532 nm）。 
		注意：本实验使用数值孔径（NA）为0.22的光纤。在光纤尖端下方100–200 µm处，预计照明光斑直径约为200–400 µm。确保光纤尖端输出功率达到&gt;20 mW，以保证玫瑰红（Rose Bengal）的有效激活及血栓形成。</li>
		<li>光遗传操控模式：测试脉冲激光输出（例如，用于opto-vTrap的488 nm激光）。 
		注意：将光纤尖端的输出功率校准至10 mW；该参数针对运动皮层记录深度0.94 mm处的opto-vTRAP激活进行了优化。对于其他脑区，建议通过行为学或电生理学方法进行验证。</li>
		<li>光纤光度法（钙信号记录）模式：测试低功率激发光（例如，470 nm和405 nm）。 
		注意：确保输出稳定并维持在极低水平（&lt;50 µW），以尽量减少长期记录过程中对钙指示剂（例如GCaMP6s）的光毒性和光漂白效应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 慢性光遗传电极植入
注意：本节介绍在病毒注射位点长期植入光探针的手术步骤。精确定位注射坐标至关重要，以确保记录电极和光纤能够采集到表达GCaMP6s和光遗传学vTRAP的脑区信号。所需主要设备包括：立体定位仪、微型钻头、镊子、颅骨固定螺钉、琼脂糖凝胶和牙科水泥。
<ol>
	<li>对于 麻醉、立体定位固定、颅骨准备和平衡，遵循第1节所述的相同步骤，但在头皮切口时，需去除1.5 cm × 1.5 cm的头皮组织，同时确保眼部周围保留足够的皮肤。</li>
	<li>用过氧化氢和0.9%生理盐水清洁颅骨。确定前囟位置，并将数字游标归零。</li>
	<li>使用钻头（0.8 mm，圆头）轻轻打磨颅骨表面，以增强牙科水泥的粘附性。</li>
	<li>用标记笔标记运动皮层（M1FL；AP：1.5 mm，ML：0.74 mm），然后以其为中心点绘制一个5 mm × 5 mm的正方形（图1C).
	<ol>
		<li>使用微型钻以适当速度（约10000 rpm）沿方形标记进行钻孔。钻孔过程中持续滴加冰冻生理盐水至钻孔路径，以抵消高速钻孔产生的热量，防止脑组织损伤。一旦骨瓣松动，立即停止操作图1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在对侧大脑半球和小脑区域钻三个小孔（直径0.5 mm），并将颅骨固定螺钉植入孔中。确保每根螺钉到达硬脑膜，但避免进一步穿透，以防对脑组织造成额外损伤。图1C).</li>
	<li>使用镊子移除先前已松动的骨瓣。移除过程中应避免施加额外的向下压力，以防止损伤脑组织并保持硬脑膜完整。 
	注意：如果出现任何出血情况，可使用止血海绵快速止血。</li>
	<li>使用超细尖镊子（&lt;使用0.03 mm × 0.01 mm的镊子去除颅窗处的硬脑膜。操作过程中应避免镊子尖端直接夹压任何脑组织。 
	注意：去除颅骨后，保持脑组织湿润至关重要。在不进行操作时，建议使用无菌生理盐水浸湿的棉球覆盖创口，以防止因干燥引起的脑组织肿胀和神经元损伤。</li>
	<li>将光纤电极固定在立体定位仪的显微操作臂上，并移至颅窗上方。将光纤电极的银质接地线和参考电极线牢固地缠绕在三个颅骨成形术螺钉上图1C).</li>
	<li>用无菌生理盐水清洁颅窗表面，确保无出血或血凝块阻碍电极插入。以1 µm/s的速度缓慢将光遗传电极降至目标深度（DV：-0.94 mm）。 
	注意：植入过程中，暴露的皮层组织应以无菌生理盐水保持湿润。</li>
	<li>在植入后，在颅窗上覆盖一层琼脂糖，以保护皮层组织免受牙科水泥的影响。</li>
	<li>用牙科水泥涂抹3–4层以覆盖暴露的颅骨，确保整个光探针被牢固固定。待牙科水泥变硬后，将小鼠从立体定位仪上取下。图1C).</li>
	<li>给予小鼠3–5天镇痛处理，并让其在记录和建模前恢复1–2周。</li>
</ol>
4. 光化学血栓模型构建与同步记录
注意：本节介绍行为适应、基线记录、通过光血栓法诱导脑卒中以及卒中后纵向记录的操作流程。光血栓通过植入的光导电极递送，同时持续进行电生理和光纤光度记录。所需主要设备包括：转棒仪、抓力计、光纤光度系统、多通道神经记录系统、玫瑰红染料以及530 nm激光光源。
<ol>
	<li>有 小鼠在建模前需进行行为学训练。 
	注意：所有动物均在标准化的实验室条件下饲养和测试。饲养条件：室温20–25 °C，相对湿度50%–60%，12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为07:00）。实验期间动物可自由获取食物和水。所有行为测试和手术操作均在光照期进行。行为记录会话在每天光照期内的相同时间进行，以尽量减少神经元活动和星形胶质细胞钙动力学的昼夜节律变化。记录所用的围栏环境温度也维持在20–25 °C。
	<ol>
		<li>在转棒实验中，让小鼠在旋转棒上持续奔跑，共进行3次连续试验，每次试验中转棒在5分钟内转速从4 RPM匀加速至40 RPM。</li>
		<li>在握力测试中，训练小鼠使用前爪拉动测试杆，并完成三次连续测量，结果波动小于10%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置光纤光度测量的数据采集参数。
	<ol>
		<li>使用双通道或三通道光纤光度系统激发钙指示剂（例如 GCaMP6s）。对于 GCaMP6s，将信号通道设为 470 nm，对照通道设为 405 nm，以校正运动伪影和自发荧光。 
		注意：必须重新测试记录激光功率，以确保光纤尖端的输出功率保持在20–40 µW之间，以避免光漂白和光毒性。</li>
		<li>将数据采集采样率设置为 60–100 Hz，足以捕获星形胶质细胞的钙瞬变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置多通道电生理数据采集参数。
	<ol>
		<li>确保记录系统中的所有组件（包括握力测试装置和笼子）均正确接地，以减少噪声。记录期间使用公共中位参考（CMR）以消除全局伪迹。 
		注意：在记录系统中检查信号频谱图视图非常重要，以确保不存在电源线干扰，并将由运动伪影引起的噪声降至最低。较大的运动伪影可能表明植入手术期间螺钉和接地线固定失败。</li>
		<li>确保在记录软件中选择宽频带信号和局部场电位（LFP）信号，并在记录过程中监测是否存在任何噪声。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行基线记录。
	<ol>
		<li>用异氟烷短暂麻醉（60秒内）；通过适配器将光探针连接至记录线路。</li>
		<li>将小鼠置于类似家笼的环境中进行记录，在清醒后给予10分钟适应时间。</li>
		<li>在进行握力测试的同时进行记录，要求小鼠每分钟拉动测试杆一次，持续5分钟。</li>
		<li>确保在多通道系统和光纤光度系统中对行为学实验进行精确的时间戳记录，以便对数据进行对齐（图1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立光化学血栓模型。
	<ol>
		<li>经腹腔注射（i.p.）1.5% 伊红Y染料溶液，剂量为10–20 mg/kg，注射后等待5分钟，使染料通过皮层血管循环。 
		警告：玫瑰红B是一种光敏性染料。操作时应避免强光照射，并佩戴手套和护目用具。</li>
		<li>使用异氟烷对小鼠进行麻醉，诱导和维持参数同前所述。</li>
		<li>当小鼠处于深度麻醉状态并使用麻醉面罩维持时，将光探针的光学探头连接至激光光源。</li>
		<li>通过植入的光导电极以15 mW功率输送530 nm激光束5–8分钟，以诱导局部缺血。 
		警告：15 mW 的 530 nm 激光具有危险性。所有研究人员必须佩戴激光安全护目镜。在进行光栓塞实验时，切勿直接注视光纤尖端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行卒中后记录。
	<ol>
		<li>将小鼠放置于加热垫上以恢复。待小鼠完全清醒（通常在10分钟内）后，开始首次卒中后急性记录。</li>
		<li>每天重复记录，以密切监测疾病进展。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行光遗传学操控。
	<ol>
		<li>除了记录钙信号和发射用于诱导缺血的激光束外，该光极还能够传递光遗传学刺激，如代表性结果所示（图4).</li>
		<li>将光纤电极连接至具有合适激光波长和功率的光遗传学激光刺激器（本实验中为488 nm，10 mW，持续5分钟用于opto-vTrap），开启刺激器以进行光遗传学操控。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 多模态数据分析流程
注意：本节概述了多通道电生理数据（ spike sorting）、星形胶质细胞钙信号（ΔF/F 计算）以及两种数据流跨模态对齐的分析工作流程。所需软件：Plexon Offline Sorter（离线 spike sorting 软件）、NeuroExplorer（神经数据分析软件）和 RWD OFRs（光纤光度法）分析软件。
<ol>
	<li>神经元脉冲分类（Plexon 系统）：
	<ol>
		<li>将原始 .pl2 文件导入离线脉冲分类软件。应用数字高通带滤波器（&lt;300 Hz）以分离高频脉冲活动。</li>
		<li>设置电压阈值（通常为噪声标准差的 -5 倍）以检测潜在的脉冲信号。</li>
		<li>在手动筛选并剔除噪声波形后，使用离线脉冲分类软件中的扫描功能进行主成分分析（PCA），对波形进行聚类，并识别不同的神经元簇24。</li>
		<li>检查脉冲间间隔（ISI）直方图。确保每个“单个神经元”单位的 ISI 违例率低于 &lt;1%（反映不应期特性）。ISI 违例率显示在离线脉冲分类软件中每个单位的左上角。</li>
		<li>将分类后的脉冲时间戳导出至神经数据处理软件。使用神经数据处理软件中的放电率直方图和“事件周围时间直方图”功能，生成放电率直方图和事件相关时间直方图（PSTH）。</li>
		<li>从神经数据处理软件的统计模块中输出每个单位的平均波形长度和平均放电率，用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>星形胶质细胞钙信号处理（光纤光度分析软件）
	<ol>
		<li>在分析软件中打开原始荧光数据（470 nm 通道为信号，410 nm 通道用于运动校正控制）。</li>
		<li>在光纤光度系统的 预处理 模块中，使用 410 nm 通道作为运动校正的对照，将 平滑系数 设置为 8，并选择 PLS 拟合 作为基线校正方法。</li>
		<li>使用以下公式计算荧光变化（ΔF/F）25： 
		<img alt="荧光比值公式 ΔF/F = (F470-F410)/F410；用于发射分析研究。" src="/files/ftp_upload/71017/71017eq1.jpg" style="font-size: 14px;" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>基于事件时间戳进行星形胶质细胞钙信号分析，提取事件周围数据用于可视化（例如热图和平均轨迹），并计算曲线下面积（AUC）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>星形胶质细胞-神经元同步相关性分析
	<ol>
		<li>以共有的行为事件时间戳作为时间零点，对齐神经元脉冲与星形胶质细胞钙信号。</li>
		<li>在提取事件周围数据后，将两组数据流对齐至该共同时间零点，并可视化星形胶质细胞-神经元相关性（图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的整合型实验方案在缺血性脑卒中进展过程中星形胶质细胞与神经元相互作用的研究方面取得了重要进展。该方法通过将光化学血栓诱导与实时光-电生理监测及光遗传学操控相结合，有效弥合了脑卒中起始与神经元及星形胶质细胞在环路水平重组观察之间的空白。Boyce 等人近期的研究表明，在自由活动的小鼠脑卒中模型中，结合光纤光度法与电生理记录是可行的，证实了多模态方法在此领域的价值。本研究所提出的整合型光控电极系统进一步拓展了这一理念，通过在同一植入装置中实现对星形胶质细胞的光遗传学操控，使得能够对星形胶质细胞–神经元相互作用进行因果性探究，而这是仅依赖记录手段所无法实现的26。
图1所示的记录设置提供了一种将记录与行为任务相结合的示例性方案，因为光探针被植入初级运动皮层前肢区域（M1FL），并选择前肢抓握测试来特异性观察运动行为与星形胶质细胞-神经元活动之间的关系。该系统能够递送光血栓并同时记录星形胶质细胞钙瞬变和神经元活动的能力已得到验证（图3 和 图4</strong...

缺血性脑卒中仍是全球主要的健康挑战，是全球范围内致死和获得性长期残疾的主要原因之一1,2,3。缺血性脑卒中高致残率与其多种临床症状相关，包括运动性瘫痪、感觉丧失以及认知功能障碍等4,5,6。目前迫切需要深入理解缺血性脑卒中修复阶段的病理机制与恢复机制。除了神经元功能障碍外，星形胶质细胞的严重功能障碍近年来也受到广泛关注7,8。星形胶质细胞是最丰富的胶质细胞，是中枢神经系统以及三联突触的重要组成部分。在缺血级联反应的各个阶段，星形胶质细胞均发挥着不可或缺的作用，并深刻影响神经元及功能的恢复9,10,11。在健康大脑中，星形胶质细胞与神经元通过三联突触实现功能耦合，其中星形胶质细胞的突起包绕突触前和突触后终末，并积极参与突触传递过程7,8。星形胶质细胞通过兴奋性氨基酸转运体调节细胞外谷氨酸浓度，通过Kir4.1通道维持钾离子稳态，并通过钙依赖性胞吐释放胶质递质来调节突触强度7,8。在此背景下，星形胶质细胞内钙瞬变代表其活性状态，并与神经元放电活动紧密关联7。在缺血性脑卒中期间，这种精细调控的关系迅速被破坏。能量衰竭导致离子梯度崩溃，引发大量谷氨酸释放和扩布性去极化，从而造成兴奋性神经元损伤以及反应性星形胶质细胞增生12。梗死核心区域及其周围星形胶质细胞经历一系列病理变化，包括钙超载、谷氨酸再摄取功能受损、突触耦合丧失以及胶质递质释放功能障碍13。与此同时，神经元的放电活动显著受到抑制，表现为神经元活力下降及膜电位完整性丧失14,15。在梗死周围区域，存活的神经元与反应性星形胶质细胞之间发生动态相互作用，这些相互作用被认为对决定卒中后恢复结局至关重要；然而，在清醒、行为活动动物中，这种相互作用的实时电生理和钙信号特征仍缺乏充分研究13,16。因此，同步理解星形胶质细胞活动与神经元信号被认为是缺血性损伤后神经功能恢复的关键基础。
光栓塞是一种广泛应用的缺血模型，它利用光敏染料和局部光照在特定靶向区域诱导缺血性病灶17。目前的卒中建模与记录方案在研究卒中后星形胶质细胞-神经元相互作用方面受到三个主要技术瓶颈的限制17,18,19。建模与记录分离是当前大多数方案的常见缺陷，导致模型建立与实时信号记录之间存在时间间隔20,21。然而，缺血性卒中发生后的数分钟至数小时内，神经元和星形胶质细胞均经历剧烈波动，是至关重要的时期12,22。若无法在缺血事件发生后立即同步监测星形胶质细胞-神经元相互作用，将严重阻碍对缺血性卒中有效早期干预的研究。当前方案的另一局限在于记录方式的孤立性；大多数现有方法仅针对单一类型的信号进行了优化。例如，多通道电生理技术可检测神经元放电和局部场电位（LFPs），但无法感知胶质细胞的信号状态15,16。相反，通过in vivo.钙成像监测星形胶质细胞动态可捕捉其活动波动，却缺乏神经元放电数据。当前方案的最后一个瓶颈在于动物的记录状态；在大多数方案中，动物处于麻醉或自由活动状态。然而，运动功能障碍被认为是卒中最棘手的后遗症之一；理解特定行为与星形胶质细胞-神经元事件之间的关联至关重要。因此，迫切需要一种集成化方法，能够在执行特定行为测试的清醒小鼠中，同时构建光栓塞性卒中模型并同步捕获星形胶质细胞和神经元信号。现有的各种方法仅能满足其中部分需求。双光子钙成像在完整大脑中对星形胶质细胞微区动态具有卓越的空间分辨率，但要求动物头部固定或处于麻醉状态，无法进行自然行为评估，且不能同时获取多通道神经元放电数据13。独立的光纤光度法可在自由活动动物中实现星形胶质细胞钙信号监测，但仍无法获取神经元放电模式，无法提供回路功能的电生理读数16。多通道细胞外电生理技术虽能以高时间分辨率解析神经元单元的放电活动和局部场电位，但无法提供星形胶质细胞信号状态的信息15。然而，这些方法均无法在不中断的情况下，于同一解剖位点同时诱导精确定位的光栓塞性卒中并进行多模态记录。
为解决现有技术局限，我们提出了一种集成化系统。该系统通过单一的慢性植入装置，同时克服了上述三项技术限制，可在清醒、自由活动的小鼠中，从卒中发生起始直至慢性阶段，同步实现光血栓诱导、基于光纤光度法的星形胶质细胞钙信号记录以及多通道神经元电生理记录。本方法的可行性通过将定制制造的光探针长期植入表达星形胶质细胞特异性钙指示剂及光遗传病毒载体的小鼠脑内得以验证。利用该方法，可在动物执行行为任务及接受光遗传调控的过程中，同步记录并分析星形胶质细胞的钙瞬变与神经元放电活动。

<table><tbody><tr><td>2% TTC 染色液</td><td>Solarbio</td><td>G3005</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Biosharp</td><td>BS081</td><td></td></tr><tr><td>体温维持系统 / 恒温监测仪</td><td>RWD life Science</td><td>69002</td><td></td></tr><tr><td>颅骨螺钉</td><td>中科慧达</td><td>23092007</td><td></td></tr><tr><td>数据采集与分析软件（光纤光度法）</td><td>RWD life Science</td><td>ORFs</td><td></td></tr><tr><td>数据采集与分析软件（多通道电生理）</td><td>Plexon</td><td>PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>数字式实验室立体定位仪</td><td>RWD life Science</td><td>68804</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>镊子直径 0.005 mm &amp;acute; 0.025 mm</td></tr><tr><td>激光功率计</td><td>Sanwa</td><td>LP10</td><td></td></tr><tr><td>激光散斑血流成像系统</td><td>Pericam AB</td><td>Pericam PSI NR</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>Risemice</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>微型手持式颅骨钻</td><td>RWD life Science</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>小鼠病毒微量注射仪</td><td>RWD life Science</td><td>68025</td><td></td></tr><tr><td>光刺激电极（Optrode）</td><td>定制</td><td>Kedou</td><td>定制产品，含16根钨丝电极环绕1根光纤</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>5.01 版本</td><td></td></tr><tr><td>R studio</td><td>Posit</td><td>版本 4.4.1</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s</td><td>BrainVTA</td><td>PT-2560</td><td>星形胶质细胞特异性钙离子指示剂</td></tr><tr><td>rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap</td><td>BrainCase</td><td>BC-2446</td><td>星形胶质细胞特异性光遗传病毒载体</td></tr><tr><td>玫瑰红染料（Rose Bengal Dye）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198250</td><td>用于血栓诱导的光敏染料 / Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>推车式麻醉工作站</td><td>RWD life Science</td><td>R520</td><td>适用于小鼠可控吸入麻醉的麻醉机</td></tr></tbody></table>

一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

An Integrated Method for Photothrombotic Stroke Modeling and In Vivo Optrode Recording of Neuronal and Astrocytic Activity in Behaving Mice

研究缺血性卒中后星形胶质细胞与神经元之间的动态相互作用，对于理解卒中后的恢复机制至关重要。然而，现有方法通常难以捕捉动物在执行特定行为任务时神经元与星形胶质细胞之间的实时相互作用，限制了我们对卒中急性期病理过程的探究能力。本实验方案介绍了一种整合方法，结合光栓塞性卒中模型、多通道电生理记录和光纤光度法，在清醒且自由活动的小鼠中利用自行制备的光遗传电极（optrode）实现同步检测。该方案包括通过光栓塞诱导局灶性缺血，随后同步记录神经元放电活动和星形胶质细胞钙瞬变信号。该光遗传电极可在无需多次手术操作的前提下，同时实现光栓塞诱导、钙信号记录和光遗传学操控。代表性结果证实了星形胶质细胞钙信号与神经元放电活动的同步记录成功实现。对星形胶质细胞进行光遗传学操控可引起神经元放电模式的显著改变（与光刺激前相比，锥体神经元放电频率降低1.55 ± 0.45 Hz，中间神经元降低3.64 ± 1.37 Hz，n = 2），表明该系统具备研究星形胶质细胞-神经元相互作用的能力。这一整合方法通过在行为动物模型中实现从卒中急性期到慢性期的实时、多模态记录，弥补了当前卒中研究方法中的关键空白。

实验时间线
图1总结了实验时间线和关键手术标志。病毒注射与光探针植入之间需间隔三周，以确保GCaMP6s充分表达；在诱导脑卒中前的基线记录期间，应通过检测光纤光度学信号来确认星形胶质细胞钙信号是否显著。
光血栓模型的多维度验证
局灶性缺血的诱导得到了体内、组织学和行为学证据的支持。
激光散斑成像可实时提供照射区域内脑血流灌注下降的证据。在短暂异氟烷麻醉（1.5–2%，维持浓度）下进行卒中后血流验证的激光散斑对比成像（LSCI）。为实现无遮挡的皮层成像，在LSCI前小心移除植入部位的光导探针，并用无菌生理盐水冲洗颅窗。LSCI分别在光栓塞后立即、卒中后第1天和第7天进行。基础脑血流量（CBF）为275.63 ± 11.03 LSPU；光栓塞后，CBF下降至154.15 ± 4...

本方案提供了一种整合性方法，包括病毒递送、光探针植入、光血栓诱导、星形胶质细胞与神经元活动的同步记录，以及星形胶质细胞的光遗传学刺激。该整合性方法旨在对缺血性脑卒中从急性期到慢性期各个阶段的星形胶质细胞-神经元相互关系进行同步研究。

研究缺血性脑卒中后星形胶质细胞与神经元之间的动态相互作用，对于理解脑卒中后的恢复机制至关重要。然而，目前……

我们的研究开发了一种集成方法，可在行为小鼠发生缺血性脑卒中期间同时记录星形胶质细胞和神经元的活动。以往的方法仅分别记录神经元或星形胶质细胞。本方案能够在脑卒中发作的初始时刻即同步捕获星形胶质细胞和神经元的信号。首先，将一只深度麻醉的 C57BL/6J 小鼠转移至配备麻醉面罩的立体定位仪上。每 10 分钟监测一次麻醉深度，同时使用反馈控制加热垫将小鼠体温维持在 36 至 37.5 摄氏度之间。在小鼠眼部涂抹眼用软膏后，用耳杆和门齿固定杆将其固定于立体定位仪上。头部对称固定后，通过轻柔探查确认头部固定是否稳固。脱毛并进行无菌皮肤准备后，使用手术剪做正中切口。用生理盐水和棉签清洁骨膜，暴露前囟和人字缝。依次降低玻璃微量移液管，使其接触前囟和后囟。记录数字游标上的Z坐标后，调节口杆，直至两者之差小于0.04毫米。再降低玻璃微量移液管接触前囟，并将数字游标归零。将微量移液器依次从bregma向左和向右移动2.3毫米。记录Z坐标后，调整耳杆，直至双侧差异小于0.04毫米。在bregma处将数字游标重新归零后，标记运动皮层前肢区域，即前后方向+1.5毫米，内侧-外侧方向+0.74毫米处。使用微型钻机和0.5毫米圆头钻头，在标记位置钻一个小孔，直径约为0.5毫米。在装载前，将两种腺相关病毒载体等体积混合，并短暂离心样品。将连接至微输注泵的玻璃微量移液管下降至目标位置，从脑表面起算的背腹深度为-0.94毫米。以每分钟50纳升的速度注入400纳升病毒混合液（含每种载体各200纳升）。注毕后10分钟缓慢撤出移液管。使用4-0、20毫米、3/8圆弧缝合针缝合头皮，并将小鼠置于加热垫上直至完全恢复。病毒注射后三至四周，按照先前展示的步骤操作，直至头皮切开。进行头皮切开时，去除1.5厘米×1.5厘米大小的头皮组织，同时保留足够覆盖眼部周围的皮肤。用过氧化氢和0.9%生理盐水清洁颅骨。确定前囟后，将数字游标归零。使用0.8毫米圆形钻头轻轻磨糙颅骨表面。标记运动皮层前肢区域。在前后方向1.5毫米、内外侧方向0.74毫米处，以该标记点为中心绘制一个5毫米×5毫米的正方形。使用转速约为10,000转/分钟的微型钻头沿正方形轮廓进行切割。持续用冰盐水冲洗钻孔路径，一旦骨瓣松动，立即停止操作。在对侧半球和小脑区域钻三个直径为0.5毫米的小孔。将颅骨成形术螺钉植入这些孔中。确保每颗螺钉到达硬脑膜，但不得进一步穿透，以避免损伤脑组织。使用镊子移除松动的骨瓣。使用超细镊子（其尖端尺寸小于0.03毫米×0.01毫米）在避免直接接触脑组织的前提下，去除颅窗处的硬脑膜。将光纤电极固定在立体定位仪的显微操作臂上，并移至颅窗上方。将光纤电极的银质接地线和参考电极线牢固地缠绕在三个颅骨成形术螺钉上。用无菌生理盐水清洁颅窗表面。以每10秒1毫米的速度，缓慢将光探针降至背腹侧深度为-0.94毫米的目标位置。植入后，在颅窗上覆盖一层琼脂糖。再涂抹三至四层牙科水泥。待牙科水泥凝固后，给予小鼠3至5天的镇痛处理，并让小鼠恢复1至2周。使用双通道或三通道光纤光度系统激发GCaMP6s，将信号通道设为470纳米，对照通道设为410纳米。将采样率调整为每秒60帧。现在，正确接地所有记录系统组件。记录期间使用共同中位参考。在记录过程中持续监测噪声，同时确认记录软件中已选择宽频带和局部场电位信号。短暂麻醉小鼠后，通过适配器将光探针连接至记录线路。将小鼠置于类似饲养笼的环境中进行记录。清醒后静置 10 分钟以适应环境。记录小鼠进行握力测试的过程，每分钟进行一次拉力测试，持续五分钟。在多通道系统和光纤光度系统中均需精确记录行为测试的时间戳。腹腔内注射1.5%玫瑰红染料溶液，剂量为每千克体重10至20毫克，注射后等待五分钟。在达到并维持深度麻醉后，将光导探头连接至激光源。通过植入的光导探头输送530纳米波长、15毫瓦的激光束，持续照射五到八分钟，以诱导局部缺血。进行光遗传学刺激时，将激光刺激器连接至光探针。打开488纳米光遗传学激光刺激器，并将其设置为10毫瓦，持续5分钟，用于Opto-vTrap实验。最后，将小鼠置于加热垫上以恢复。与基线相比，光血栓形成后脑血流量下降，并在卒中后1天和7天仍持续受到抑制。前肢抓握力在卒中后1天显著下降，并在7天时仍维持在较低水平。通过光纤光度法记录的星形胶质细胞钙瞬变信号与电生理记录的神经元放电活动根据时间戳进行对齐。光栓塞性卒中后，与前肢抓握任务基线期的放电频率相比，锥体神经元和中间神经元的放电频率均显著受到抑制。在基线期，星形胶质细胞的钙瞬变在任务开始后4至6秒内达到峰值。但光栓塞性卒中后，其振幅显著降低，反映出钙活动减弱。光栅图和刺激后时间直方图显示了在光刺激期间神经元活动的变化。与刺激前基线相比，锥体神经元和中间神经元的放电率在光刺激后均显著降低，证实星形胶质细胞的调控对局部神经环路的兴奋性具有可测量的下游效应。该方案允许从急性发作期到慢性期的卒中前时间线上，对运动和神经活动进行连续记录。本方案的成功依赖于精确或协调的定位、单侧光遗传探针植入以及各次手术中病毒表达时间的充分一致性。未来的研究可采用多个植入探针以监测更广泛的大脑区域，或结合多种行为学检测手段，针对不同类型的细胞进行研究。

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一种集成方法：用于光血栓性卒中 建模及体内 视摄取记录行为小鼠神经元和星形胶质细胞活动的方法

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小鼠模型中光血栓性卒中的建模：通过小鼠颅骨进行激光照射的技术，在给予光敏染料后诱导光血栓形成

来源： Maruoka, H., et. al. 清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。J. Vis. Exp. (2022)...

在清醒小鼠中同步成像小胶质细胞动态与神经元活动

光血栓法是一种快速、微创的技术，可高度可重复地在特定感兴趣区域诱导产生小而界限清晰的梗死灶。该方法特别适用于研究转基因小鼠中脑可塑性相关的细胞和分子反应。...

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本文介绍光化学血栓性脑卒中模型，该模型通过在给予光敏染料后利用激光照射，经完整颅骨诱导永久性微血管闭塞，从而产生脑卒中。...

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清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

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低成本脑电图记录系统结合毫米级线圈用于活体小鼠脑部经颅刺激 体内

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133 次观看.  Guangzhou University of Chinese Medicine. 我们的研究开发了一种综合方法，可以在行为小鼠的缺血性中风发生期间同时记录星形胶质细胞和神经元活动。之前的方法分别记录神经元或星形胶质细胞。我们的协议从中风发生的那一刻开始同时捕捉星形胶质细胞和神经元信号。首先，将一只深度麻醉的C57BL/6J小鼠转移到配备麻醉面罩的立体定位架上。每10分钟监测一次麻醉深度，同时使用反馈控制的加热垫将小鼠体...

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