一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

我们的研究开发了一种集成方法，可在行为小鼠发生缺血性脑卒中期间同时记录星形胶质细胞和神经元的活动。以往的方法仅分别记录神经元或星形胶质细胞。本方案能够在脑卒中发作的初始时刻即同步捕获星形胶质细胞和神经元的信号。

首先，将一只深度麻醉的 C57BL/6J 小鼠转移至配备麻醉面罩的立体定位仪上。每 10 分钟监测一次麻醉深度，同时使用反馈控制加热垫将小鼠体温维持在 36 至 37.5 摄氏度之间。在小鼠眼部涂抹眼用软膏后，用耳杆和门齿固定杆将其固定于立体定位仪上。

头部对称固定后，通过轻柔探查确认头部固定是否稳固。脱毛并进行无菌皮肤准备后，使用手术剪做正中切口。用生理盐水和棉签清洁骨膜，暴露前囟和人字缝。

依次降低玻璃微量移液管，使其接触前囟和后囟。记录数字游标上的Z坐标后，调节口杆，直至两者之差小于0.04毫米。再降低玻璃微量移液管接触前囟，并将数字游标归零。

将微量移液器依次从bregma向左和向右移动2.3毫米。记录Z坐标后，调整耳杆，直至双侧差异小于0.04毫米。在bregma处将数字游标重新归零后，标记运动皮层前肢区域，即前后方向+1.5毫米，内侧-外侧方向+0.74毫米处。

使用微型钻机和0.5毫米圆头钻头，在标记位置钻一个小孔，直径约为0.5毫米。在装载前，将两种腺相关病毒载体等体积混合，并短暂离心样品。将连接至微输注泵的玻璃微量移液管下降至目标位置，从脑表面起算的背腹深度为-0.94毫米。

以每分钟50纳升的速度注入400纳升病毒混合液（含每种载体各200纳升）。注毕后10分钟缓慢撤出移液管。使用4-0、20毫米、3/8圆弧缝合针缝合头皮，并将小鼠置于加热垫上直至完全恢复。

病毒注射后三至四周，按照先前展示的步骤操作，直至头皮切开。进行头皮切开时，去除1.5厘米×1.5厘米大小的头皮组织，同时保留足够覆盖眼部周围的皮肤。用过氧化氢和0.9%生理盐水清洁颅骨。

确定前囟后，将数字游标归零。使用0.8毫米圆形钻头轻轻磨糙颅骨表面。标记运动皮层前肢区域。

在前后方向1.5毫米、内外侧方向0.74毫米处，以该标记点为中心绘制一个5毫米×5毫米的正方形。使用转速约为10,000转/分钟的微型钻头沿正方形轮廓进行切割。

持续用冰盐水冲洗钻孔路径，一旦骨瓣松动，立即停止操作。在对侧半球和小脑区域钻三个直径为0.5毫米的小孔。将颅骨成形术螺钉植入这些孔中。

确保每颗螺钉到达硬脑膜，但不得进一步穿透，以避免损伤脑组织。使用镊子移除松动的骨瓣。使用超细镊子（其尖端尺寸小于0.03毫米×0.01毫米）在避免直接接触脑组织的前提下，去除颅窗处的硬脑膜。

将光纤电极固定在立体定位仪的显微操作臂上，并移至颅窗上方。将光纤电极的银质接地线和参考电极线牢固地缠绕在三个颅骨成形术螺钉上。用无菌生理盐水清洁颅窗表面。

以每10秒1毫米的速度，缓慢将光探针降至背腹侧深度为-0.94毫米的目标位置。植入后，在颅窗上覆盖一层琼脂糖。再涂抹三至四层牙科水泥。

待牙科水泥凝固后，给予小鼠3至5天的镇痛处理，并让小鼠恢复1至2周。使用双通道或三通道光纤光度系统激发GCaMP6s，将信号通道设为470纳米，对照通道设为410纳米。

将采样率调整为每秒60帧。现在，正确接地所有记录系统组件。记录期间使用共同中位参考。

在记录过程中持续监测噪声，同时确认记录软件中已选择宽频带和局部场电位信号。短暂麻醉小鼠后，通过适配器将光探针连接至记录线路。将小鼠置于类似饲养笼的环境中进行记录。

清醒后静置 10 分钟以适应环境。记录小鼠进行握力测试的过程，每分钟进行一次拉力测试，持续五分钟。在多通道系统和光纤光度系统中均需精确记录行为测试的时间戳。

腹腔内注射1.5%玫瑰红染料溶液，剂量为每千克体重10至20毫克，注射后等待五分钟。在达到并维持深度麻醉后，将光导探头连接至激光源。通过植入的光导探头输送530纳米波长、15毫瓦的激光束，持续照射五到八分钟，以诱导局部缺血。

进行光遗传学刺激时，将激光刺激器连接至光探针。打开488纳米光遗传学激光刺激器，并将其设置为10毫瓦，持续5分钟，用于Opto-vTrap实验。最后，将小鼠置于加热垫上以恢复。

与基线相比，光血栓形成后脑血流量下降，并在卒中后1天和7天仍持续受到抑制。前肢抓握力在卒中后1天显著下降，并在7天时仍维持在较低水平。通过光纤光度法记录的星形胶质细胞钙瞬变信号与电生理记录的神经元放电活动根据时间戳进行对齐。

光栓塞性卒中后，与前肢抓握任务基线期的放电频率相比，锥体神经元和中间神经元的放电频率均显著受到抑制。在基线期，星形胶质细胞的钙瞬变在任务开始后4至6秒内达到峰值。但光栓塞性卒中后，其振幅显著降低，反映出钙活动减弱。

光栅图和刺激后时间直方图显示了在光刺激期间神经元活动的变化。与刺激前基线相比，锥体神经元和中间神经元的放电率在光刺激后均显著降低，证实星形胶质细胞的调控对局部神经环路的兴奋性具有可测量的下游效应。该方案允许从急性发作期到慢性期的卒中前时间线上，对运动和神经活动进行连续记录。

本方案的成功依赖于精确或协调的定位、单侧光遗传探针植入以及各次手术中病毒表达时间的充分一致性。未来的研究可采用多个植入探针以监测更广泛的大脑区域，或结合多种行为学检测手段，针对不同类型的细胞进行研究。