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本工作获得了以下资助：AI26170；Evelyn-Lipper 家族基金会以及 Gruss Lipper 生物光子学中心。我们感谢分析成像中心提供的支持，该中心由美国国家癌症研究所癌症中心资助项目 P30 CA013330 支持。

所有实验操作均按照机构生物安全和动物护理指南进行，并经阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物护理与使用委员会（IACUC）批准。菌株 mc28471 是 mc27902 的 pYUB1169 转化子，后者为经批准可用于 BSL-2 实验室的三重营养缺陷型结核分枝杆菌菌株。所有涉及活菌的操作均采用处理分枝杆菌的标准预防措施进行。
1. 构建符合BSL-2标准的表达tdTomato的结核分枝杆菌菌株mc28471
<ol>
	<li>通过质粒转化生成表达tdTomato的BSL-2安全型mc28471
	<ol>
		<li>将BSL-2批准的三重营养缺陷型菌株mc27902与附加体分枝杆菌质粒pYUB1169进行转化，该质粒含有由G13启动子驱动表达的tdTomato基因，从而获得荧光衍生菌株mc28471。</li>
		<li>取100 µL mc27902（600 nm处光密度（OD600 nm）为0.7–1.0），接种于10 mL无菌Middlebrook 7H9培养基中，该培养基添加OADC增补剂（10%（v/v））、甘油（0.2%（v/v））、D-泛酸盐（24 mg/L）、L-亮氨酸（50 mg/L）、L-精氨酸（200 mg/L）、丙酸钠（0.1 mM）和tyloxapol（0.05%（v/v）），置于30 mL磨口瓶中。</li>
		<li>将培养物在37 °C缓慢振荡（100 rpm）培养，直至OD600 nm达到0.7–1.0。</li>
		<li>将菌液转移至15 mL圆锥形离心管中，在室温下以3,000 × g离心10分钟。弃去上清液，用10 mL含0.05%（v/v）tyloxapol的无菌10%甘油溶液重悬菌体（洗涤#1）。重复离心和洗涤两次。将菌体沉淀重悬于0.175 mL含0.05%（v/v）tyloxapol的10%甘油溶液中，并加入2 µL pYUB1169 DNA（含DNA 100–200 ng）。</li>
		<li>将mc27902与pYUB1169混合物转移至0.2 cm电穿孔比色皿中，静置10分钟。轻敲比色皿2至3次以去除气泡，然后在室温下以2,500 mV、1,000 Ω、25 µF、时间常数20 ms的条件进行电穿孔。</li>
		<li>向比色皿中加入1 mL无菌Middlebrook 7H9培养基，该培养基补充有OADC增补剂（10%（v/v））、甘油（0.2%（v/v））、D-泛酸盐（24 mg/L）、L-亮氨酸（50 mg/L）、L-精氨酸（200 mg/L）、丙酸钠（0.1 mM）和tyloxapol（0.05%（v/v）），将内容物转移至15 mL圆锥形离心管中，在37 °C振荡培养过夜。</li>
		<li>取0.1 mL转化混合物涂布于添加OADC增补剂（10%（v/v））、甘油（0.2%（v/v））、D-泛酸盐（24 mg/L）、L-亮氨酸（50 mg/L）、L-精氨酸（200 mg/L）、丙酸钠（0.1 mM）和卡那霉素（20 mg/L）的Middlebrook 7H10琼脂平板上。将剩余转化混合物离心，弃去0.9 mL上清液，用残留上清液重悬菌体沉淀，并将重悬菌液涂布于第二块含相同补充物和抗生素的Middlebrook 7H10琼脂平板上。将平板在37 °C培养3–4周。粉红色菌落表明转化成功。</li>
		<li>挑取一个孤立的粉红色菌落，在30 mL磨口瓶中，于5 mL无菌Middlebrook 7H9培养基中37 °C缓慢振荡培养，该培养基补充有OADC增补剂（10%（v/v））、甘油（0.2%（v/v））、D-泛酸盐（24 mg/L）、L-亮氨酸（50 mg/L）、L-精氨酸（200 mg/L）、丙酸钠（0.1 mM）、tyloxapol（0.05%（v/v））和20 mg/L卡那霉素。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mc28471静脉感染前的制备
	<ol>
		<li>在30 mL磨口瓶中，将10 mL mc28471于37 °C在无菌Middlebrook 7H9培养基中缓慢振荡培养至对数中期（OD600 nm应在0.7至1.0之间），该培养基补充有OADC增补剂（10%（v/v））、甘油（0.2%（v/v））、D-泛酸盐（24 mg/L）、L-亮氨酸（50 mg/L）、L-精氨酸（200 mg/L）、丙酸钠（0.1 mM）、tyloxapol（0.05%（v/v））和20 mg/L卡那霉素。&#160;</li>
		<li>将菌液转移至15 mL圆锥形离心管中，在室温下以3,000 × g离心10分钟。弃去上清液，用10 mL含0.05%（v/v）tyloxapol的无菌磷酸盐缓冲液（PBS-T，洗涤#1）重悬菌体。重复离心和洗涤两次。将菌体沉淀重悬于4 mL PBS-T中，并以100 W功率进行超声处理，总能量2 × 1,000 J。&#160;</li>
		<li>测定菌液的光密度，并用PBS-T稀释至每注射剂量含有5 × 106 CFU，换算依据约为OD600 nm = 1对应1 × 108&#160; CFU/mL。由于该换算关系可能随菌株和培养条件变化，应通过平板计数CFU值对OD600 nm进行经验校准，以确保准确性和可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠活体成像用永久性肺窗植入术
<ol>
	<li>为活体成像准备一只Rag2KO MacBlue小鼠。本研究使用了一只10周龄、体重30 g的雄性小鼠。然而，任一性别的小鼠，年龄在8–12周之间，且体重处于该年龄段正常范围内的个体均适用于本实验。该品系在Rag2基因敲除背景下，于巨噬细胞中表达增强型青色荧光蛋白（ECFP），由B6.129S6-Rag2tm1FwaN12小鼠（Rag2，品系RAGN12）与Tg (Csf1r-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J小鼠（货号026051）杂交获得。</li>
	<li>在细菌感染前24小时植入肺部高分辨率成像窗（WHRIL），以提供稳定的肺部光学通路，并在成像前允许动物充分恢复。</li>
	<li>在诱导舱中使用5%异氟烷诱导麻醉。在开始任何操作前确认麻醉深度充分，并在整个手术和成像过程中持续监测动物状态，以防止疼痛、痛苦或呼吸功能受损。</li>
	<li>给予术前镇痛：将10 µL丁丙诺啡（剂量为0.1 mg/kg）溶于90 µL无菌注射用生理盐水中，皮下注射。</li>
	<li>在双眼涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>用2-0丝线在22G导管基部打结，留出约2英寸长的线尾用于固定导管。</li>
	<li>使用绑有缝线的导管对小鼠进行气管插管。通过透光法观察气管开口，并使用充气球囊确认导管位置（双侧胸廓抬起）。 
	注意：插管不当可能导致气道损伤或通气不足。仅在确认双侧胸廓均匀扩张后方可继续操作。</li>
	<li>插管成功后，用2-0丝线将导管在鼻部固定。将导管连接至呼吸机。</li>
	<li>将小鼠置于加热手术平台上的右侧卧位，暴露左侧胸壁，然后用胶带固定前肢、后肢和背部，以在整个操作过程中保持稳定体位。</li>
	<li>手术其余阶段将异氟烷浓度降低至3%。使用脱毛膏去除左侧上胸部的毛发。</li>
	<li>反复交替使用碘伏或氯己定擦洗并随后用酒精消毒，准备手术区域。在消毒区域覆盖无菌手术巾，并使用无菌器械和无菌技术进行后续所有手术操作。用镊子提起皮肤，使用无菌剪刀在胸骨左侧约7 mm、肋缘上方约7 mm处，以第6至第7肋间区域为中心，做5–10 mm的环形切口。</li>
	<li>检查暴露区域是否存在表浅血管。如需切断可见血管，应电凝两端以维持止血。在进入胸腔前，清除覆盖的软组织，清晰暴露肋骨。</li>
	<li>用镊子夹住并提起第6或第7肋骨，使用钝头显微解剖剪刀（圆头朝向肺部）轻轻穿刺两肋之间的肋间肌，进入胸腔。 
	注意：应轻柔且在直视下进入胸腔，避免划伤肺组织、肋间血管或周围组织。</li>
	<li>在肋间切口处短暂施加短促、轻柔的无菌压缩空气，暂时使邻近肺表面塌陷，并将其与胸壁分离，以便创建成像窗开口。确保压缩空气源及所有接触手术区域的管道或应用装置均为无菌，或配备适当的无菌过滤器。</li>
	<li>将活检打孔器安装在切割工具上，引导切割工具穿过肋间切口，保持其与胸壁平行。在肋骨上打一个5 mm的圆形缺损。</li>
	<li>在圆形缺损边缘约1 mm处放置一根5-0丝线荷包缝合线，穿过相邻肋骨之间，环绕开口一周。</li>
	<li>将成像窗框架就位，使胸壁缺损边缘嵌入框架凹槽内，然后收紧并固定荷包缝合线，将框架锁定在位。</li>
	<li>将氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂装入1 mL注射器中。轻轻抬起框架使其与肺部分离，然后在框架底面涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂。</li>
	<li>使用持续、轻柔的压缩空气流干燥肺表面，直至表面呈现哑光状。 
	注意：仅使用轻柔气流，避免长时间干燥，因力量过大或过度干燥可能损伤肺表面并影响窗口粘附。</li>
	<li>使用呼气末正压（PEEP）使肺膨胀，然后将成像窗粘附至框架上。释放PEEP，并对成像窗框架施加压力20–30秒。 
	注意：充气或放置框架时压力过高可能损伤肺组织或破坏密封。仅施加实现轻柔贴合所需的最小压力。</li>
	<li>在皮肤切口边缘不到1 mm处放置第二根5-0丝线荷包缝合线。必须使用丝线，因其可打成足够小且牢固的结，完全嵌入成像窗框架的凹槽内。此位置可将结隔离于外界环境之外，防止污染和缠结。将皮肤塞入框架下方，确保多余皮肤被压在框架下或已剪除，然后拉紧荷包缝合线，牢固打结，并将结完全嵌入框架凹槽中。</li>
	<li>使用真空拾取装置，在5 mm盖玻片底面涂一层极薄的粘合剂，并在矩形盖玻片边缘刮去多余部分。再次使用持续、轻柔的压缩空气流干燥肺表面。</li>
	<li>以约15°的浅角度将圆形盖玻片置于成像窗框架的凹槽内，位于肺表面之上。短暂增加气道压力使肺膨胀，然后将盖玻片旋转至平行位置，使肺表面与玻璃底面相对。在粘合剂固化期间保持轻柔压力约25秒，然后将真空拾取装置从盖玻片上分离。 
	注意：放置盖玻片时应避免产生气泡或使用过多粘合剂，否则可能降低成像质量、破坏密封或损伤肺表面。</li>
	<li>在盖玻片与金属框架交界处涂抹少量液体氰基丙烯酸酯，以加强气密性密封。</li>
	<li>将无菌针头连接至1 mL胰岛素注射器。将针头插入剑突下方，穿过膈肌进入胸腔，方向朝向左肩。轻柔抽吸以清除残留的胸腔内空气。 
	注意：应小心推进针头，避免刺穿肺、心脏或主要血管。轻柔抽吸，仅在残留空气被清除后即停止。</li>
	<li>关闭异氟烷，继续以100%氧气通气，直至接近恢复正常清醒时的呼吸频率。恢复期间不得无人看护。若自主呼吸未能及时恢复，应根据机构指南提供适当支持治疗或实施安乐死。</li>
	<li>拆除固定缝线，拔除气管插管，将小鼠放入清洁、加温的笼子中恢复。持续监测动物直至完全恢复活动能力；若未能恢复正常呼吸，应根据机构指南实施安乐死。</li>
	<li>给予术后镇痛：将10 µL丁丙诺啡（剂量为0.1 mg/kg）溶于90 µL无菌注射用生理盐水中，皮下注射。根据机构批准的IACUC方案和兽医指导，术后至少48小时内每8–12小时皮下注射一次丁丙诺啡（0.1 mg/kg），必要时可延长给药时间，依据临床评估决定。</li>
</ol>
3. 活体成像
<ol>
	<li>在成像前，让小鼠在植入窗口后恢复。手术后1至5天内进行成像。</li>
	<li>使用3%异氟烷诱导麻醉，随后在整个成像过程中维持麻醉浓度为1.5%。</li>
	<li>将定制的载物台板-窗口框架适配器插入皮肤与肺部窗口框架外缘之间，并使用胶带固定标准显微镜载物台板。</li>
	<li>将带有定制载物台板-窗口框架适配器的小鼠放置在显微镜平移载物台上。使用带有温度传感器反馈回路的强制热空气加热舱，维持小鼠体温在约37 °C。</li>
	<li>将小鼠置于载物台板上后，轻轻向后拉注射侧眼睛周围的皮肤以暴露内眦，随后经眶后注射FITC-葡聚糖（150 kDa；20 mg/mL，100 µL）以标记血管系统。</li>
	<li>在注射细菌前，使用以下参数获取肺部血管系统的静态图像、z轴层扫图像或延时成像图像。
	<ol>
		<li>共聚焦显微镜设置参数如下：位深：12位，帧率：2 fps，图像尺寸：512 × 512像素，像素大小：0.497 µm/像素，0.994 µm/像素，z轴步长：2 µm，总z轴深度：50–70 µm，帧平均：3，扫描速度：2 µs/像素（977行/秒），激光激发波长：405 nm、488 nm、559 nm，样品处激光功率：230 µW（405 nm）、75 µW（488 nm）、40 µW（559 nm），检测滤光片：430–470 nm（蓝色）、505–540 nm（绿色）、575–675 nm（红色），探测器增益：蓝色800 V，绿色650 V，红色700 V，针孔直径：60 µm或559 nm下的1艾里单位</li>
		<li>对于双光子显微镜，&#160;使用&#160;与共聚焦显微镜相同的成像参数，但激发激光波长为920 nm，样品处激光功率为25 mW。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经眶后注射5 × 106 CFU表达tdTomato的mc28471。 
	注意：仅在经过适当培训并妥善固定小鼠的情况下进行眶后注射，操作不当可能导致眼部损伤、出血或接种物输送失败。</li>
	<li>使用步骤3.6.1和3.6.2中的成像参数，获取结核病及荧光标记细胞与血管系统的静态图像、z轴层扫图像和延时成像图像。调整所有探测器的增益，以在避免探测器饱和的前提下最大化信号强度。</li>
	<li>成像结束后，关闭异氟烷，将小鼠从显微镜上移除。保持小鼠温暖并持续监测，直至完全恢复。</li>
	<li>在注射mc28471后的以下时间点重复成像：0–60分钟、6小时和3天。每次成像时，重新经眶后注射FITC-葡聚糖（100 µL）以可视化血管系统，然后按照步骤3.8–3.9所述获取图像。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

该平台通过在BSL-2条件下直接可视化完整哺乳动物肺组织中的分枝杆菌与宿主细胞相互作用，填补了结核病研究领域的一项真实空白。此前 体内 成像策略，包括使用光纤微内窥镜激发的全身光学检测20报告酶荧光成像21，以及表达近红外荧光蛋白的 Mtb22，实现了对细菌负荷量和药物反应的高灵敏度纵向监测，但这些方法仅能测量总体细菌载量，无法分辨单个或小簇的分枝杆菌，不能追踪聚集体动态，也无法揭示分枝杆菌与宿主细胞在完整组织结构中的空间关系。尽管已证明符合BSL-3标准的多光子系统可用于肺部强毒力Mtb成像的原理验证24，此类实施需要专门的 containment 基础设施，而大多数实验室仍无法获得。本研究建立在活体分枝杆菌成像技术的发展脉络之上，该技术始于对实时可视化 M. marinum&#160;斑马鱼感染13 并继续对小鼠肝脏中的BCG肉芽肿进行双光子成像<sup cla...

高分辨率活体显微技术通过在单细胞分辨率下直接可视化细胞迁移、血管相互作用以及免疫监视，彻底改变了对完整组织内动态细胞行为的研究1,2,3,4。尽管这些方法已在癌症研究中广泛应用3,5，但其在肺部感染研究中的应用却受到呼吸运动、组织脆弱性以及生物安全限制的制约。近年来胸腔成像平台的进步，包括真空稳定式和永久植入式光学窗口，已解决了许多技术难题，实现了对肺微环境长时间、稳定且无运动干扰的成像6,7,8,9,10。其中，可永久植入的光学窗口尤其强大，因其能够在数小时至数周的时间范围内重复观察血管血流、免疫细胞动态及单个细胞行为，并在揭示癌症转移机制、血管通透性以及免疫监视过程方面发挥了关键作用11,12。
尽管取得了这些进展，活体成像此前尚未被应用于 结核分枝杆菌 （结核分枝杆菌）感染在 体内 单细胞分辨率下的哺乳动物肺部。最接近的先例来自在其他条件下对分枝杆菌感染的活体成像。实时成像 Mycobacterium marinum&#160;斑马鱼胚胎感染13 揭示了早期巨噬细胞相互作用及肉芽肿的启动过程，同时通过双光子成像观察小鼠肝脏中由BCG诱导的肉芽肿14,15 揭示了肉芽肿形成过程中巨噬细胞与T细胞的动态变化，并证明肉芽肿病变内部抗原呈递及T细胞效应功能受限。这些研究为分枝杆菌宿主-病原体相互作用建立了基础性认识，但未涉及完整的哺乳动物肺组织。8,16.
活体成像技术也已应用于其他感染性和生物学背景下的肺部研究，包括常规肺部成像8，揭示巡逻型肺泡巨噬细胞可将细菌隐藏于免疫系统之外的研究17，以及对人肺中SARS-CoV-2感染引发的早期髓系免疫反应的表征16。类似地，活体成像也被用于流感病毒感染的肺组织，实现了对感染肺组织内免疫细胞动态行为的直接可视化18,19。
利用光纤微内窥镜激发20和报告酶荧光技术21,22的全身体学成像方法已能够灵敏地检测小鼠肺部的结核分枝杆菌（Mtb），但无法检测单个或少量成簇的杆菌，也无法追踪细菌聚集动态或在完整肺组织中可视化分枝杆菌与宿主细胞之间的直接相互作用。在生物安全三级（BSL-3）条件下，已建立用于感染肺组织的高防护活体成像方法，包括针对SARS-CoV-2感染23和以Mtb为重点的24多光子成像平台。这些研究证明了在封闭环境中对感染肺组织进行成像的可行性，但此类系统在技术上仍具有挑战性，且尚未广泛普及。对毒力型Mtb的操作需要在BSL-3条件下进行，这为活体成像带来了重大的工程技术和生物安全挑战23,24。因此，目前大多数关于Mtb早期感染的研究仍依赖于静态终点检测方法，无法捕捉细菌在肺内行为的空间和时间动态特征。
基因定义明确且经BSL-2认证的三重营养缺陷型结核分枝杆菌（Mtb）菌株的开发为克服上述局限提供了独特机遇。mc27902菌株是H37Rv株的泛酸-亮氨酸-精氨酸营养缺陷型衍生物，完全减毒，在免疫缺陷小鼠体内无法复制，仍保持典型的抗酸染色特性，对噬菌体的敏感性正常，并可在BSL-3设施之外安全操作25。这些特性使mc27902成为在降低生物安全防护等级条件下建立活体成像方法并研究早期宿主-病原体相互作用的理想替代模型。
本研究中，我们应用肺部高分辨率成像窗（WHRIL）技术，结合表达荧光蛋白tdTomato的三重营养缺陷型结核分枝杆菌（Mtb）菌株mc27902的衍生株mc28471，对完整小鼠肺组织中早期Mtb感染过程进行可视化观察。实验在免疫缺陷的Rag2-/-小鼠与MacBlue小鼠杂交后代中进行2627，其中MacBlue小鼠的Csf1r启动子驱动单核细胞、小胶质细胞以及部分树突状细胞和巨噬细胞表达增强型青色荧光蛋白（ECFP）。MacBlue转基因使得在早期Mtb感染期间单核吞噬细胞群体得以清晰成像。我们选择使用Rag2缺陷型小鼠，旨在聚焦于最早期的固有宿主-病原体相互作用，避免在此短期成像窗口中适应性免疫应答带来的额外复杂性。需要强调的是，该技术并不局限于Rag2缺陷型小鼠，亦可在免疫功能健全的动物中实施。
通过结合永久性肺部成像窗与一种符合生物安全二级（BSL-2）标准的荧光减毒结核分枝杆菌（Mtb）菌株，该技术平台可在同一肺部微环境中，以单细胞分辨率对细菌与宿主细胞的相互作用进行连续多日的活体成像。尽管本文演示的是早期感染阶段的应用，但该平台本身并不局限于感染早期，原则上也可根据实验模型和研究设计应用于感染后期。由于该成像平台的成功应用依赖于本文所述的特定荧光菌体制剂，因此我们将该试剂的制备与处理所需的关键步骤纳入完整实验方案中。该平台可实现对结核分枝杆菌行为的直接、实时成像。

关键词：肺部成像窗，结核分枝杆菌，活体成像，宿主-病原体相互作用，单细胞分辨率，荧光菌株，生物安全二级，Mtb 体内&#160;为未来对细菌生理学、宿主识别以及免疫介导清除机制的研究奠定了基础。

<table><tbody><tr><td>15 ml 离心管</td><td>康宁</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2-0 丝线结&amp;nbsp;</td><td>Ethicon, Inc</td><td>LA55G</td><td></td></tr><tr><td>5 mm 盖玻片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72296-05</td><td></td></tr><tr><td>5 mm 一次性活检打孔器</td><td>Integra</td><td>33-35-SH</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线荷包缝合&amp;nbsp;</td><td>Ethicon, Inc</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>钝头显微解剖剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Hospira</td><td>0409-2012-32</td><td>注射 10 &amp;mu;L-布洛芬（0.3 mg/mL 储备液）用 90 稀释 &amp;mu;无菌 PBS 溶液（最终剂量 = 0.1 mg/kg）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>压缩空气罐</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯粘合剂</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td></td></tr><tr><td>D-泛酸钙</td><td>阿克罗斯</td><td>243305000</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 电穿孔系统完整套装，含安全支架</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0051</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB102</td><td></td></tr><tr><td>FITC-葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD150S-1G</td><td>150 kDa</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Chemicals</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>格拉夫镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td>在肺窗植入手术过程中抓握并抬高肋骨</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>&amp;nbsp;Pivetal</td><td>78949580</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>SurgiVet</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Goldbio.com</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5131-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号：026051</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 琼脂</td><td>Difco</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 肉汤</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC 增菌液</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>小鼠呼吸机</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-02</td><td>PhysioSuite</td></tr><tr><td>Nair</td><td>教堂 &amp;amp; Dwight Co., Inc.</td><td>40002957</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>康宁</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PETG 培养基墨水瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>342020</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-5623</td><td>监测小鼠&amp;rsquo;手术期间经气管插管给予的潮气量</td></tr><tr><td>质粒 pYUB1169</td><td>定制质粒</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rag2 基因敲除小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号：008449</td><td></td></tr><tr><td>小型动物肺部膨胀球囊</td><td>哈佛仪器</td><td>72-9083</td><td></td></tr><tr><td>丙酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A17440.36</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB705</td><td></td></tr><tr><td>Sorval 离心机 X pro 系列</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75009020</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计 Genesys 10 UV</td><td>赛默飞世尔光谱公司</td><td>335903</td><td></td></tr><tr><td>SurgiSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M02</td><td>用于小鼠的多功能手术平台（带加热功能）</td></tr><tr><td>气管导管</td><td>Exelint International</td><td>26746</td><td>22G</td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0307-50G</td><td></td></tr><tr><td>真空拾取系统金属探针&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>528-112</td><td></td></tr></tbody></table>

衰减营养缺陷型的活体成像 结核分枝杆菌 小鼠肺脏在早期血管内感染期间的变化

Intravital Imaging of Attenuated Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis in Murine Lung during Early Intravascular Infection

活体显微技术可直接可视化完整组织内动态的细胞过程。然而，由于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）需要在生物安全三级（BSL-3）条件下进行 containment，且肺组织在高分辨率成像过程中存在技术上的稳定难题，该技术在Mtb研究中的应用受到限制。本文介绍了一种结合小鼠胸腔高分辨率肺成像窗（WHRIL）与mc27902菌株的实验方案，后者是一种基因定义的三重营养缺陷型Mtb菌株，可在生物安全二级（BSL-2）条件下使用。我们还描述了mc27902的tdTomato荧光标记衍生菌株mc28471的构建方法、静脉感染前的制备流程，及其在报告基因小鼠中用于活体成像的应用。该系统可实现对感染早期动态过程的实时可视化，包括细菌快速进入肺血管系统、聚集、扩散至肺实质以及在感染后前&#160;3天内同一肺微环境中被巨噬细胞摄取等过程。通过实现对细菌及宿主-病原体相互作用的单细胞分辨率纵向成像，该方法克服了传统成像技术和高防护等级模型的关键局限性。本方案提供了一个实用的、符合BSL-2标准的平台，用于肺部减毒分枝杆菌的实时活体成像，并为研究细菌生理学、宿主识别机制及免疫介导的清除过程奠定了基础。

经过电穿孔和卡那霉素筛选后，mc28471 的分离菌落表现出明亮的红色荧光，证实了 tdTomato 的稳定表达。扩增 mc28471 杆菌，制备成单细胞悬液，并通过静脉注射给予携带手术植入 WHRIL 的小鼠。通过活体成像技术观察肺微环境中早期结核分枝杆菌（Mtb）感染的动态过程。在本研究中，感染前首先获取肺血管系统的基线图像（图 1A），随后在注射 mc28471 后 60 分钟内、6 小时和 3 天时对 Rag2-/- × MacBlue 小鼠进行活体成像（图 1B-D，图 2A-B，图 3A-C，补充视频 1，补充视频 2，补充视频 3）。选择这些时间点旨在捕捉杆菌在肺部定位、重新分布以及与巨噬细胞结合的最...

本文介绍了一种利用永久性肺窗对小鼠肺部经减毒且获得生物安全二级（BSL-2）许可的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）菌株进行活体成像的实验方案。该方法可在同一肺部微环境中，实现对宿主与病原体早期相互作用的长期、单细胞分辨率的动态分析，包括杆菌定位、血管动力学变化以及巨噬细胞摄取过程的观察。

活体显微镜技术可实现对完整组织内动态细胞过程的直接可视化。然而，该技术在结核分枝杆菌……的应用中仍存在挑战。

intravital-imaging-attenuated-auxotrophic-mycobacterium-tuberculosis

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

早期血管内感染期间，鼠肺中减弱型辅助营养 分枝杆 菌结核的生命体影像

来源：Niu, L., et al. 通过活体显微镜观察结核分枝杆菌感染期间斑马鱼胚胎中巨噬细胞的溶细胞性死亡。 J. Vis. Exp. (2019)本视频展示了利用活体共聚焦显微镜观察斑马鱼胚胎中巨噬细胞裂解性细胞死亡的过程 Mycobacterium marinum...

活体成像斑马鱼胚胎中巨噬细胞在分枝杆菌感染过程中的细胞死亡

来源： 贝尔努特，A. 等解析与成像病原性及索状结构 脓肿分枝杆菌 在斑马鱼胚胎中。 视频实验杂志 (2015)本视频展示了一种利用表达荧光巨噬细胞并感染了荧光标记病原体的转基因斑马鱼胚胎的实验方案 脓肿分枝杆菌...

斑马鱼胚胎感染后宿主-病原体相互作用的活体成像 脓肿分枝杆菌

人巨细胞病毒（HCMV）感染新生儿是导致智力障碍的重要原因，然而病毒引发致病的分子机制仍不甚清楚。为了研究脑部感染的动态过程，我们改进了整体动物 体内...

使用 体内 利用成像技术监测新生小鼠巨细胞病毒感染进展

结核病和疟疾是人类中最常见的两种感染性疾病，也是热带地区贫困人群中发病和死亡的主要原因。我们建立了一个实验模型系统，用于研究小鼠经自然感染途径同时感染疟原虫和结核分枝杆菌后，疟疾-结核共感染的结果。...

一种用于研究结核病与疟疾共感染的实验模型——基于自然传播途径 结核分枝杆菌 和 疟原虫伯氏疟原虫

利用生物发光细菌实时观察肺炎链球菌毒力因子在急性小鼠肺炎模型中的影响

光学透明的斑马鱼胚胎被广泛用于实时研究和观察病原微生物与先天免疫细胞之间的相互作用。通过将脓肿分枝杆菌（Mycobacterium...

解析与成像Mycobacterium abscessus在斑马鱼胚胎中的致病机制及索状结构

我们描述了利用报告酶荧光（REF）对感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）的小鼠进行光学成像的方法。该方案有助于在结核病发病机制、治疗及疫苗研究的临床前动物模型中，实现对M.

成像 结核分枝杆菌 在携带报告酶荧光的小鼠中

本研究中，我们介绍了一种在流感病毒感染后对小鼠气管黏膜进行双光子活体成像及细胞相互作用分析的实验方案。该方案对于研究呼吸道感染过程中免疫细胞动态变化的研究人员具有重要意义。...

利用双光子活体显微镜成像流感病毒感染期间气管黏膜中的细胞相互作用

本方案描述了一种在Mycobacterium...

通过活体显微镜观察斑马鱼胚胎中分枝杆菌感染期间巨噬细胞的裂解性细胞死亡

本文介绍了一种利用双光子显微镜对移植的小鼠左肺进行活体成像的实验方案。该方法为实时研究小鼠肺移植后细胞动态变化及细胞间相互作用提供了有力工具。...

活体小鼠肺移植的双光子显微成像

本文介绍一种在小鼠耳部进行低剂量Mycobacterium...

小鼠耳部皮内接种Mycobacterium avium

Albert Einstein College of Medicine.  本文介绍了一种减毒BSL-2批准结 核分枝 杆菌的活体内影像方案。利用永久肺窗对小鼠肺部进行压力检测。该方法能够对早期宿主-病原体相互作用进行纵向单细胞分辨率分析，包括同一肺部微环境中的菌体定位、血管动态和巨噬细胞摄取。

衰减营养缺陷型的活体成像结核分枝杆菌小鼠肺脏在早期血管内感染期间的变化

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