一种用于模拟生理脉动剪切应力与振荡性高血糖共同作用下内皮功能障碍的微流控系统

本研究探讨了同步振荡性高血糖与脉动性剪切应力如何共同驱动糖尿病血管病变中的内皮功能障碍。现有模型通常采用持续高浓度葡萄糖或稳定层流作为起始条件。我们研究了脉动性剪切应力如何拮抗振荡性葡萄糖所造成的损伤。

首先，使用计算机辅助设计软件设计微流控芯片结构。通过商业公司制备SU-8母模。在洁净的混合杯中，按10:1的质量比混合聚二甲基硅氧烷固化剂与预聚物，并手动充分搅拌五分钟。

然后将容器置于真空室中，在0.08兆帕的压力下至少保持15分钟，以去除混合过程中截留的气泡。将聚二甲基硅氧烷倒入放置在玻璃培养皿中的硅片上。将浇注在硅片上的聚二甲基硅氧烷置于干燥器中再次脱气15分钟，以去除浇铸过程中产生的任何气泡。

将含有模具和聚合物的培养皿放入设定为 80 摄氏度的烘箱中加热两小时。使用解剖刀，小心地将固化的聚合物块从母模上剥离。使用打孔工具，在聚合物块上指定的通道末端处制备进样口和出样口。

用胶带清洁玻璃盖玻片和聚合物平板的图案面。接着，在室温空气条件下，将聚合物平板和玻璃盖玻片置于65瓦功率的等离子清洗仪中处理60秒。随后立即将聚合物通道面与玻璃盖玻片的处理面进行对齐。

然后轻轻按压，形成永久封闭的微流控通道。将键合好的微流控芯片放入装有去离子水的硼硅酸盐玻璃瓶中，在121摄氏度、15磅每平方英寸的条件下高压灭菌20分钟以进行灭菌。

将灭菌后的芯片放入盛有等摩尔浓度 PBS 和低糖 DMEM 混合液的 60 毫米培养皿中。然后使用 1 毫升注射器将 100 微克/毫升的纤连蛋白注入通道，在 37 摄氏度下孵育 4 小时。接着，向低糖 DMEM 中加入 24.5 毫摩尔的甘露醇以提高渗透压。

向高糖DMEM中加入5毫摩尔的D-葡萄糖，以获得终浓度为30毫摩尔的葡萄糖。配制含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的正常糖培养基和高糖培养基。随后将PBS、胰蛋白酶、正常糖培养基和高糖培养基在37摄氏度水浴中预热。

在细胞融合度达到90%时，从培养皿中收获人脐静脉内皮细胞。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。在37摄氏度孵育30秒后，计数收获的细胞，并分别重悬于正常葡萄糖和高葡萄糖培养基中，浓度为每毫升1×10⁶个细胞。

使用1毫升注射器，将100微升细胞悬液分别注入微流控芯片的进样口，对照组使用正常葡萄糖培养基，实验组使用高葡萄糖培养基。将微流控芯片置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润化培养箱中培养48小时。利用所提供的公式计算实现目标脉动剪切应力所需的流速。

将压力源连接至压力控制器，然后将压力控制器连接至与计算机相连的阀门控制器，以实现对压力波形的自动控制。准备两个100毫升的储液瓶，分别装入正常葡萄糖培养基和高葡萄糖培养基。

将储液器连接到压力控制器的相应通道，然后使用硅胶管将储液器与两位三通电磁阀连接。设定目标生理脉动剪切应力，对应流速约为 200 微升每分钟。

将可编程空气泵设置为生成正弦波函数，以维持脉动剪切应力。接下来，将阀门控制器设置为每五分钟切换一次通道，以在动态刺激期间产生方波形式的葡萄糖振荡。使用硅胶管将两位三通电磁阀与微流控芯片连接。

然后启动可编程泵系统以对管路进行预灌注。接下来，使用直径为1.3毫米、呈90度角的不锈钢连接件，将微流控芯片的入口和出口端口连接至管路。将微流控芯片的出口连接至废液储液池，然后再次启动泵，以共同施加振荡葡萄糖和脉动剪切应力，持续30分钟。

完成流场验证后，根据制造商说明书，在实验终点配制钙黄绿素 AM 和碘化丙啶工作液。用 PBS 冲洗微流控通道一次后，将钙黄绿素 AM 和碘化丙啶工作液引入通道中，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下避光孵育 30 分钟。随后立即使用配备 10 倍物镜的倒置荧光显微镜采集染色细胞的荧光图像。

使用配备10倍物镜的倒置荧光显微镜立即采集染色细胞的荧光图像。Calcein AM 使用异硫氰酸荧光素绿色滤光片，碘化丙啶使用四甲基罗丹明或罗丹明红滤光片。用 PBS 冲洗微流控通道三次后，将活细胞氧化应激荧光探针溶液引入通道，并按照之前所述方法进行孵育。

用 PBS 冲洗通道三次，以去除未结合的探针。使用 20 倍物镜，通过远红滤光片组立即采集荧光图像，并保持所有组别的曝光参数一致。在 ImageJ 中打开所获得的钙黄绿素 AM 绿色图像和碘化丙啶红色图像。

手动调节每个通道的阈值，以区分荧光信号与背景。使用细胞计数器对荧光细胞进行定量，并根据观察结果调整最小细胞大小，以确定多个视野下的活细胞与死细胞数量。利用电子表格软件计算每种实验条件下活细胞的百分比。

然后使用统计分析软件计算多个视野下的平均值和标准差，以比较各组之间差异。将所选图像拖入 ImageJ 中。选择“分析”并点击“设定尺度”，利用显微镜元数据校准像素大小。

然后，通过选择“Process”并选择“Subtract Background”，使用背景扣除功能去除整个图像的非特异性均匀背景信号。接下来，选择“Image”，然后选择“Adjust”中的“Threshold”，手动调节阈值滑块以定义细胞内活性氧信号。通过选择“Analyze”并选择“Set Measurements”来设置测量参数，包括面积和平均灰度值。

选择“分析”中的“分析颗粒”功能，根据观察到的细胞尺寸确定最小细胞大小，并测量细胞单层ROI内分割信号的平均强度。以每张芯片至少随机选取三个视野所获得的测量值的平均值，报告每种实验条件下活性氧水平。将定量结果输入数据分析和绘图软件中进行处理。

通过双因素方差分析，随后采用 Tukey 事后检验（显著性水平为 0.05），将实验组与对照组进行比较，以确定统计学显著性。使用软件进行数据分析，并生成以标准差表示误差线的图表。代表性荧光图像显示，所有组中均有较高比例的活细胞；在正常葡萄糖组以及正常葡萄糖联合脉动剪切应力组中，观察到的细胞死亡极少；而振荡葡萄糖组及振荡葡萄糖联合脉动剪切应力组则表现出明显的死细胞增加。

定量分析显示，与对照组相比，振荡性葡萄糖暴露导致细胞活力显著降低；而在振荡性葡萄糖条件下施加脉动性剪切应力，与单独振荡性葡萄糖处理相比，细胞活力显著提高。在正常葡萄糖条件下，细胞内活性氧水平较低，施加剪切应力后进一步降低。而振荡性葡萄糖条件则引起红色荧光强度明显增强，提示活性氧水平升高。

在施加剪切应力后，葡萄糖诱导的细胞内活性氧的振荡性升高受到抑制。定量分析显示，在正常葡萄糖条件下，剪切应力显著降低了活性氧水平。相比之下，与正常葡萄糖条件相比，振荡性葡萄糖条件导致活性氧水平显著升高。

此外，在振荡性葡萄糖条件下，剪切应力仍显著降低了活性氧（ROS）水平。该方案可实现对活性氧水平及细胞活性的定量分析，用于研究振荡性高血糖和脉动性剪切应力条件下的内皮功能障碍。通过该流程，可进一步开展分子水平分析，例如NRF2通路或iNOS信号通路，以阐明内皮保护机制。

未来的研究可利用该系统探索力学生物学通路，引入流动几何结构的扰动，或进行平滑肌细胞的共培养。