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本项目得到了美国国家科学基金会生物介导与生物启发岩土工程研究中心（ERC-1449501）、瑞士国家科学基金会（200021_188546）以及美国国家科学基金会（MCA-2322428、EAR-1847689、DMR-2003849）的支持。部分&#160;本研究在加州大学戴维斯分校纳米与微米研究中心进行&#160;制造（CNM2）。我们感谢 Steven Lucero 以及加州大学戴维斯分校技术工坊（UC Davis Tech Foundry）在显微镜培养箱和UVC辐照系统的设计与制造方面提供的支持。我们还感谢王宇泽博士和 Jason DeJong 博士提供了用于微流控反应器制造的多孔介质结构，以及 Arunima 博士&#160;感谢 Noah Goshi 博士、Gregory Girardi 博士和 Hyehyun Kim 博士在光刻和软光刻技术方面的有益讨论和/或培训指导。最后，感谢 Gaitan Gehin 博士、Tonya Kuhl 博士、Filippo Miele 博士和 Charles Graddy 博士在实验设计和图像分析方面提供的宝贵意见。

作者声明无利益冲突。

该实验平台为研究多孔环境中生物地球化学过程的时空动态提供了独特的机会，且可避免因人为假象而影响高保真数据的获取。该方法特别适用于锰和铁的生物矿化研究，因为这些过程会生成具有特征性赭色、棕色和黑色的矿物沉淀物，可通过光学显微镜和图像分析技术轻松进行分割识别。以锰的生物矿化为例进行案例研究，可有效评估矿物沉淀的模式与速率 原位&#160;具有高空间和时间分辨率。
本方案的多个方面使得生物地球化学转化过程的可重复测量得以实现。首先，采用死体积较小的顺序注射阀，可在不干扰微流控孔隙空间内生物膜的情况下，实现多种流体的实验操作。该装置通过防止在切换注入流体时产生压力突增，避免了生物膜的剥落或位移（此类现象在使用注射泵等其他仪器时可能发生），从而保持了初始生物膜的空间分布。此外，该系统还为使用者提供了灵活调节施加于原位微生物的地球化学条件的能力。最后，由于该装置能够保持初始生物膜分布不变，使用者可系统地检验不同生物膜形态或生物量大小对二氧化锰氧化物沉淀分布与沉淀速率的影响。
其次，通过减少微流控孔隙空间中气泡的形成和侵入，实现了持续多天的实验，从而捕捉到与环境相关的锰生物矿化时间尺度。气泡是长时间实验中常见且往往不可避免的问题，尤其在高于室温的条件下62,63，气泡会分割或堵塞单个孔隙、改变流体流动路径，并干扰反应进程。为防止气泡在孔隙中滞留，反应器在接种前已完全饱和。为最大限度减少通过流动控制系统引入的气泡，显微镜培养箱在实验开始前已提前设定至30 °C，并在连接接种后的反应器之前，预先用多倍体积的进样溶液冲洗系统。该步骤可清除管路和接头中滞留的空气，降低实验过程中液体脱气的风险。此外，在流动控制系统中集成了一个气泡捕集装置，并在捕集器出口连接一段内径为200 µm的PTFE管，以增加流动阻力，提高气泡去除效率。最后，为防止进样管路与反应器入口孔之间的界面处滞留或泄漏空气，所有连接操作均在管路两端及打孔处滴加液滴后进行；疏水性的PTFE管表面涂覆1% PEG-DA，且在整个实验过程中始终保持插入管的末端与PDMS表面垂直。
第三，将定制的UVC辐照系统整合到实验平台中，可维持明确的地球化学边界条件，并在微流控孔隙空间内可重复地限制锰的生物矿化。初步实验表明，反应器入口区域的外来生物膜会在孔隙空间上游沉淀锰氧化物，从而限制了下游Mn(II)的可用性。在无流动沉降期结束后，对反应器的入口和出口区域进行短暂且准确定位的辐照&#160;，可防止最初沉积的细菌形成生物膜。持续的单向流体流动可防止该初始UVC处理后反应器入口区域的再次定植。在t = 17.5 h（即进入稳定期并出现可见的锰氧化物沉淀之前）对反应器出口区域进行辐照，可最大限度减少孔隙空间下游的矿物积累量。这有助于将明场彩色图像数据与通过ICP-MS消解并测定的锰质量进行直接比较。
图像相减与终点质量测量相结合，为评估二氧化锰沉淀动力学提供了一种半定量方法 原位 然而，需要注意的是，由于相机对深色的敏感度有限，在矿物密度非常高时，像素强度不再与 Mn 氧化物质量呈直接正比关系。61通过在特定时间点对样品进行酸消化，并将消化后的质量与按最终实验时间点缩放的原始质量进行比较，可改进对此非线性行为的评估。若需精确量化矿物质量，用户可使用已知强度和质量的矿物样品绘制校准曲线，该方法此前已在 Fadely 等人的研究中得到验证。61或使用基于同步辐射的X射线荧光进行直接测量。
本文介绍的微流控平台可用于在多种环境条件下研究生物矿化过程。尽管代表性实验已针对P. putida&#160;GB-1进行了优化，但该装置可系统性地测试多种进液溶液化学条件（如Mn或Fe浓度、碳源、共存金属的存在）、流速、温度或微生物群落的存在。通过降低进液pH值或将PDMS涂覆一层透氧性低的聚合物，可模拟特定的酸性或亚氧化条件（例如有利于铁氧化细菌生长的环境）。通过使用报告基因融合菌株并追踪其产生的光学荧光信号，可深入了解微生物对生物矿化的调控机制59,64。通过改变颗粒粒径分布、颗粒形状或孔隙率，或对PDMS进行功能化修饰以模拟黏土颗粒或天然有机质的表面电荷，可重新设计微流控反应器以模拟多种多孔环境&#160;。通过进一步改造（例如将玻璃反应器基底替换为塑料材料），反应器可支持对金属氧化态、矿物学特征、有机-矿物结合物，以及次生金属的吸附或共沉淀过程进行直接光谱检测。最后，只要其他金属生物矿物（如磷酸盐、碳酸盐、硫化物）的光学特性足够显著以实现图像分割，该实验平台也可扩展用于研究其沉淀过程。因此，本实验方案为在相关多孔环境中全面研究生物矿化及微生物-矿物-流体相互作用提供了可行框架。

金属氧化物矿物在生物地球化学循环中起着关键作用1。在近中性pH条件下，锰（Mn）和铁（Fe）氧化物带负电荷，易于吸附阳离子金属2,3,4,5,6,7,8，从而调控根际和潜流带中微量元素的有效性及污染物的迁移性。这些矿物还影响有机质的稳定性与降解过程9,10,11,12，决定植物和土壤微生物对碳的吸收。在工程系统（如水处理滤池、人工湿地）中，常直接利用金属氧化物的沉淀作用去除Mn或Fe，并修复共存污染物13,14,15,16,17。这些金属氧化物可通过其特有的颜色进行识别，颜色范围从赭色、深棕色到黑色不等18,19。
在被称为生物矿化的过程中，微生物通常促进金属氧化物的沉淀20,21,22。许多氧化锰细菌和真菌在有氧条件下合成多铜氧化酶和过氧化物酶，催化电子从Mn(II)向Mn(III)和Mn(IV)转移，从而沉淀出类似钡镁锰矿的Mn(III, IV)氧化物矿物2,23,24。此外，多种氧化铁细菌可在中性或酸性且氧气受限的环境中通过酶促反应将Fe(II)氧化为Fe(III)，生成包括水铁矿和磁铁矿在内的Fe(II, III)（氧氢）氧化物25,26,27,28。这些生物成因矿物在细胞表面附近沉淀，并在胞外聚合物、鞘层及其他细胞结构上积累，形成微生物-矿物复合体2,23,25,27,29,30。
尽管锰（Mn）和铁（Fe）的生物矿化在复杂环境中普遍存在，但在孔隙尺度上的认识仍然不足。孔隙空间具有结构异质性，表现出优先流路径和非均匀的反应物传输，从而决定了地球化学反应的分布31,32,33,34,35。此外，微生物活动可能产生局部地球化学梯度，促进或限制生物矿化过程；而孔隙流体化学性质（如pH、溶解氧、氧化还原电位）的波动可能增强矿物沉淀或促进其溶解34,35。目前对Mn和Fe生物矿化的研究通常依赖于充分混合的批式反应条件30,36,37,38,39,40或柱实验41,42,43,44来量化氧化动力学或表征生物矿物沉淀物。然而，批式实验缺乏多孔体系固有的空间异质性。填充颗粒介质的柱系统虽提供了相关的物理结构，但其应用受限，因为需要在静态时间点进行破坏性取样，这会中断实验进程，无法实现对孔隙尺度过程的无扰动观测。因此，亟需新的实验方法来研究多孔介质中微生物介导的金属氧化物沉淀过程。
微流控系统是研究生物地球化学反应的工具 原位&#160;并可实时监测。微流控反应器能够快速、低成本地制备，具有可重复且可定制的几何结构，可模拟天然或多孔介质的理想化结构45所得装置具有光学透明性，便于对孔隙尺度过程（包括生物膜形成）进行无损观察和定量分析46,47,48,49热点开发50,51，非生物金属沉淀52,53，以及方解石生物矿化34,54,55,56此外，微流控系统允许用户控制并系统性地改变边界条件，包括金属浓度、溶解氧的有无以及流体流速。最后，根据反应器基底材料的不同，可利用X射线、拉曼或红外光谱直接测量微生物-矿物-流体相互作用57基于微流控技术的微生物金属氧化物沉淀研究平台的开发&#160;从而为研究多孔环境中驱动碳、营养物和污染物循环的锰或铁矿物相的形成与反应活性提供了新的研究途径。
本研究以锰的生物矿化为案例，定量研究在动态多孔环境中微生物介导的金属&#160;氧化物沉淀过程。以下实验方案展示了如何制备微流控反应器并接种模式细菌 Pseudomonas putida GB-1，该菌株在生长静止期可将 Mn(II) 氧化为 Mn(III, IV)58,59。利用基于压力的流体控制系统，依次注入富含营养的培养基和最低盐溶液，以分别促进生物膜形成和诱导锰氧化物沉淀。以固定时间间隔采集微流控孔隙空间的高分辨率彩色明场图像，记录 P. putida&#160;GB-1 生物膜与积累的锰氧化物之间的颜色对比。每次实验结束后，将反应器内全部锰氧化物进行消解，并采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定其总质量。通过将终点质量测量结果与图像相减算法相结合，可估算锰氧化物沉淀速率随时间的变化。该工作流程可便捷地适用于在多种环境条件下研究其他微生物或金属氧化物沉淀过程。

<table><tbody><tr><td>适配器接头（Elveflow，6-40 转 1/4-28）</td><td>达尔文微流控</td><td>LVF-KFI-08</td><td>用于连接流量传感器与无法兰接头。</td></tr><tr><td>琼脂（Fisher BioReagents）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744</td><td>用于倾注平板以划线接种冻存菌种。</td></tr><tr><td>空气压缩机（Jun-Air）</td><td>Elveflow</td><td>KCP-110</td><td>用于为流量控制器加压。</td></tr><tr><td>硫酸铵 ((NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，CAS：7783-20-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4915</td><td>用于实验培养基和溶液的配制。</td></tr><tr><td>斜口镊子</td><td>TDI 国际</td><td>7-SA</td><td>用于将管路连接至微流控反应器。</td></tr><tr><td>AutoCAD 软件</td><td>Autodesk&amp;nbsp;</td><td>--</td><td>用于设计微流控反应器的几何结构。</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Steris</td><td>--</td><td>用于对材料和液体进行灭菌。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME2002T</td><td>用于称量PDMS弹性体基液与固化剂。</td></tr><tr><td>带倒刺接头（1/4-28 旋转式转 3/32 英寸带倒刺）</td><td>Elveflow</td><td>KFI-06</td><td>用于连接聚醚聚氨酯管路与歧管及流体储液架。</td></tr><tr><td>活检打孔器（Rapid-Core，直径 1.2 mm）</td><td>达尔文微流控</td><td>PT-T983-12-25</td><td>用于在PDMS微流控通道中打孔以形成入口/出口。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>漂白剂（Chlorox）</td><td>ULINE</td><td>S-19719</td><td>用于对流控系统进行灭菌。用超纯水稀释至1%。</td></tr><tr><td>钝头针（Jensen Global，21 号）</td><td>QSource</td><td>JG21-10HPX-J004</td><td>用于连接导管与注射器。经高压灭菌30分钟。</td></tr><tr><td>本生灯</td><td>洪堡</td><td>H-5970</td><td>用于保持无菌的实验工作环境。</td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，Fisher Chemical，CAS：10035-04-8</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td>用于实验培养基和溶液的制备。</td></tr><tr><td>水解酪蛋白氨基酸（Fisher BioReagents，酸水解酪蛋白肽）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424</td><td>用于实验培养基。</td></tr><tr><td>细胞密度计（WPA Biowave CO8000）</td><td>Avantor</td><td>490005-906</td><td>用于测量 OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; 细菌培养物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>透明胶带（Scotch Magic）</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td>用于防止灰尘附着在PDMS微流控通道上。</td></tr><tr><td>六水合氯化钴(II)（CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，CAS：7791-13-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td>用于实验培养基和溶液的配制。</td></tr><tr><td>压缩氮气</td><td>Airgas</td><td>NIUHP300</td><td>用于干燥微流控反应器组件。</td></tr><tr><td>锥形管（Falcon，15 mL 容积，聚丙烯）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td>用于进水溶液和ICP-MS样品。预灭菌。</td></tr><tr><td>锥形管（Falcon，50 mL，聚丙烯）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>用于LB预培养。已预灭菌。</td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)（CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, CAS: 7758-99-8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8027</td><td>用于实验培养基和溶液的制备。</td></tr><tr><td>切割垫</td><td>ULINE</td><td>S-18543</td><td>用于切割PDMS微流控通道并打孔进样口/出样口。</td></tr><tr><td>比色皿（Fisherbrand，1.5 mL 容量，聚苯乙烯）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-955-127</td><td>用于测量 OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; 细菌培养物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>数码相机（Hamamatsu ORCA-Fusion）</td><td>尼康</td><td>77054115</td><td>用于微流控实验的延时彩色明场成像。</td></tr><tr><td>分配阀（MUX）</td><td>Elveflow</td><td>MUX-D-12</td><td>用于依次注入多种流体。</td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface (ESI) 软件</td><td>Elveflow&amp;nbsp;</td><td>--</td><td>用于控制流量控制器与流量传感器之间的流速/压力反馈，并执行分配阀切换。</td></tr><tr><td>锥形瓶（Fisherbrand，50 mL 容量）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50050</td><td>用于对数中期培养。经高压灭菌 30 分钟。</td></tr><tr><td>乙醇（Fisher Chemical，试剂级酒精，纯度90%，CAS: 64-17-5）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A962P-4</td><td>用于反应器制作过程中清洁PDMS和盖玻片。用超纯水稀释至70%。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA，CAS：60-00-4）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>用于实验培养基和溶液的制备。</td></tr><tr><td>无法兰接头（1/4-28，适用于1/16英寸外径管）</td><td>Elveflow</td><td>KFI-17</td><td>用于将管路连接至Elveflow硬件组件。套件包含卡套和螺纹螺母。</td></tr><tr><td>流量控制器（OB1 MK3+）</td><td>Elveflow</td><td>OB1-2000</td><td>用于为可控流体注射提供流速/压力反馈。</td></tr><tr><td>流量传感器（MFS2）</td><td>Elveflow</td><td>MFS-D-2</td><td>用于通过流量控制器的压力反馈，为微流控实验维持稳定的流速。</td></tr><tr><td>液体储液槽架&amp;nbsp;</td><td>Elveflow</td><td>KPT-4S</td><td>用于加压流入液体。可与15 mL Falcon离心管兼容。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（1.42 英寸 × 2.36 英寸，#1 厚度）</td><td>Ted Pella</td><td>260460-100</td><td>等离子体键合的PDMS微通道作为微流控反应器的基底。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃气密性注射器（5 mL 容量，鲁尔锁扣）</td><td>Hamilton</td><td>81520</td><td>用于反应器接种和酸消化（使用不同的注射器）。接种用注射器经高压灭菌30分钟。</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液 (CAS: 7365-45-9)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>用于实验培养基和溶液的配制。</td></tr><tr><td>热板</td><td>康宁</td><td>6795-420D</td><td>用于固化PDMS。</td></tr><tr><td>疏水性滤器（Elveflow，0.2-&amp;micro;m)</td><td>达尔文微流控</td><td>LVF-KXX-14</td><td>用于防止液体倒流进入流量控制器。</td></tr><tr><td>电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，7900）</td><td>安捷伦</td><td>--</td><td>用于测量微流控反应器消化液中的 Mn 浓度。</td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜（Nikon Ti2 Eclipse）</td><td>尼康</td><td>MEA54000, MEE59925, MEL51920, MEP59394, MEC56130</td><td>用于微流控实验的延时彩色明场成像。基本组件包括机身、透射光立柱、聚光镜转盘、物镜转盘和载物台。</td></tr><tr><td>六水合三氯化铁（FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, CAS: 10025-77-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44944</td><td>用于实验培养基和溶液的制备。</td></tr><tr><td>异丙醇（Fisher Chemical，100% 纯度，CAS: 67-63-0）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P-4</td><td>用于清洁流控系统。</td></tr><tr><td>垂直层流净化工作台（Air Science Purair FLOW Vertical，48英寸）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0875829</td><td>用于维持软光刻、反应器组装和反应器脱气过程中的低粉尘环境。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光源引擎（LIDA）</td><td>Lumencor</td><td>77060081</td><td>用于微流控实验的延时彩色明场成像。</td></tr><tr><td>Luria肉汤粉末（LB，Invitrogen，Miller配方）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td>用于从冻存菌种中培养 P. putida GB-1。经高压灭菌 20 分钟。</td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；CAS：10034-99-8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>用于实验培养基和溶液的配制。</td></tr><tr><td>四水合氯化锰(II)（MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，CAS：13446-34-9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td>用于实验培养基和溶液的配制。</td></tr><tr><td>多通管</td><td>Elveflow</td><td>KM9</td><td>用于将空气压缩机的压力分配至流体储液架。</td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>Mathworks</td><td>--</td><td>用于图像分析。</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>用于洗涤LB预培养物。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量离心管（Fisherbrand，1.5 mL 容量）</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-5</td><td>用于洗涤LB预培养物。经高压灭菌30分钟。</td></tr><tr><td>微量离心管（Fisherbrand，2 mL 容量）</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-271</td><td>用于制备反应器接种物。121°C高压灭菌30分钟。</td></tr><tr><td>微量离心管（Labcon，5 mL 容量）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LABC-3048-860-000-9</td><td>用于在时间序列实验期间收集反应器流出物。</td></tr><tr><td>微流控气泡捕获装置（25-&amp;micro;L 内部体积，EZMount</td><td>PreciGenome</td><td>PG-BT-REC25UL</td><td>用于在微流控反应器上游去除气泡。经高压灭菌30分钟以实现灭菌。</td></tr><tr><td>显微镜培养箱</td><td>--</td><td>--</td><td>由加州大学戴维斯分校技术工坊设计和制造。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微镜载物台插件（TI2-S-HU 通用支架）</td><td>尼康</td><td>MEC59140</td><td>用于在延时实验中安装UVC辐照系统并固定微流控反应器。</td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>尼康</td><td>--</td><td>用于自动进行延时图像采集。</td></tr><tr><td>硝酸（Fisher Chemical，70% 纯度，CAS: 7697-37-2）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A200-212</td><td>用于微流控反应器中二氧化锰的酸消解及ICP-MS样品稀释。</td></tr><tr><td>目标（Plan Apo &amp;lambda;D 4x/0.20)</td><td>尼康</td><td>MRD70040</td><td>用于微流控实验的延时彩色明场成像。</td></tr><tr><td>草酸二水合物（CAS: 6153-56-6）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>247537</td><td>用于微流控反应器中二氧化锰的酸消解。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK 管（63.5-&amp;micro;m ID，1/16 英寸外径</td><td>IDEX</td><td>1560XL</td><td>用于在流体控制系统中提供流体阻力。连接至流量传感器出口。</td></tr><tr><td>培养皿（Fisherbrand，100 mm 直径）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>用于倾注琼脂平板以及储存PDMS微流控通道/组装的微流控反应器。</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G, PDC-VPE, PDC-VCG</td><td>用于将PDMS微流控通道键合到玻璃盖玻片上。基本装置包括清洗器、真空泵和真空计。</td></tr><tr><td>塑料杯</td><td>ULINE</td><td>S-22541</td><td>用于混合PDMS弹性体基液与固化剂。</td></tr><tr><td>塑料刀</td><td>ULINE</td><td>S-7304B</td><td>用于混合PDMS弹性体基础剂与固化剂。</td></tr><tr><td>塑料注射器（10 mL 容量，鲁尔锁扣）</td><td>U.S. Plastic Corporation</td><td>87368</td><td>用于从反应器和管路中回收酸溶液。预灭菌。</td></tr><tr><td>塑料注射器（3 mL 容量，鲁尔锁）</td><td>U.S. Plastic Corporation</td><td>87366</td><td>用于饱和微流控反应器。已预灭菌。</td></tr><tr><td>平板培养箱（VWR）</td><td>Avantor</td><td>97025-630</td><td>用于在琼脂平板上以稳定温度培养细菌菌落。</td></tr><tr><td>气动聚氨酯管（内径4 mm，外径6 mm）</td><td>Legris-气动系统</td><td>1025U0601</td><td>用于连接空气压缩机与流量控制器。</td></tr><tr><td>气动聚醚聚氨酯管（内径2.5 mm，外径4 mm）</td><td>Legris-气动装置</td><td>1025U04R08</td><td>用于连接流量控制器与歧管及流体储液架。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS，Dow Corning，Sylgard 184）</td><td>埃尔斯沃思胶粘剂</td><td>4019862</td><td>用于通过软光刻技术制备微流控反应器。试剂盒包含弹性体基质和固化剂。</td></tr><tr><td>聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA，分子量 700，CAS：26570-48-9）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455008</td><td>用于将PTFE管连接至反应器入口时润湿管路。用超纯水稀释至1%，经滤膜除菌。</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，CAS：7778-77-0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>用于实验培养基和溶液的配制。</td></tr><tr><td>用于气泡捕集的PTFE膜过滤器</td><td>PreciGenome</td><td>PG-BT-FLT-Q5</td><td>与微流控气泡捕获装置兼容。</td></tr><tr><td>PTFE 管道（200-&amp;micro;m ID，1/16 英寸外径</td><td>达尔文微流控</td><td>BL-PTFE-1602-20</td><td>用于连接气泡捕集器出口与微流控反应器。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯管（500-&amp;micro;m ID，1/16 英寸外径</td><td>达尔文微流控</td><td>BL-PTFE-1605-20</td><td>用于连接分配阀与流量传感器，以及 PEEK 管路与气泡捕集器入口。</td></tr><tr><td>PTFE 管路（Elveflow，内径 1/32 英寸，外径 1/16 英寸）</td><td>达尔文微流控</td><td>LVF-KTU-15</td><td>用于连接液体储液架与分配阀。</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>ULINE</td><td>H-595B</td><td>用于切割PDMS微流控通道。</td></tr><tr><td>样品框（钢制，外框：35 x 60 mm，内框：25 x 50 mm，厚度：1 mm）</td><td>--</td><td>--</td><td>由加州大学戴维斯分校技术工坊设计和制造。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手术刀（Integra Miltex）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-456</td><td>用于从微流控模具中切割固化的PDMS。</td></tr><tr><td>摇床培养箱（Excella）</td><td>新不伦瑞克</td><td>E24</td><td>用于在恒定温度和转速下培养细菌培养物。</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH，1 M，CAS: 1310-73-2）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109137</td><td>用于调节 Fe-EDTA 和 HEPES 储存液的 pH 值。</td></tr><tr><td>二水合钼酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, CAS: 10102-40-6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058</td><td>用于实验培养基和溶液的配制。</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠二水合物（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O₂，Fisher Chemical，CAS：10028-24-7</td><td>Fisher Scientific</td><td>S472</td><td>用于实验培养基和溶液的配制。</td></tr><tr><td>注射器滤器（Fisherbrand，PES，0.22-&amp;micro;m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-720-511</td><td>用于过滤除菌储存液。已预灭菌。</td></tr><tr><td>注射泵（New Era）</td><td>注射泵</td><td>NE-4002X</td><td>用于反应器接种。</td></tr><tr><td>胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-953</td><td>用于固定管盖和管路。</td></tr><tr><td>Tygon 管（Masterflex Microbore，ND-100-80，内径 0.02 英寸，外径 0.06 英寸）</td><td>Avantor</td><td>MFLX06419-01</td><td>用于反应器接种及实验期间的出液管路。经高压灭菌30分钟。</td></tr><tr><td>超纯水（Milli-Q）</td><td>Millipore Sigma</td><td>--</td><td>用于制备实验培养基/溶液及清洗流控系统。经高压灭菌 30 分钟。</td></tr><tr><td>紫外线-C（UVC）辐照系统</td><td>--</td><td>--</td><td>由加州大学戴维斯分校技术工坊设计和制造。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>接头（Elveflow，1/4-28 至 1/4-28）</td><td>达尔文微流控</td><td>LVF-KFI-10</td><td>用于连接PEEK和PTFE管。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>真空干燥器（Bel Art）</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-16C</td><td>用于PDMS和反应器脱气。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>用于干燥器的真空泵（Welch DryFast）</td><td>Fisher Scientific</td><td>1257156</td><td>用于维持干燥器内的真空压力。</td></tr><tr><td>酵母提取物（Fisher BioReagents）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP1422</td><td>用于实验培养基。</td></tr><tr><td>七水合硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, CAS: 7446-20-0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td>用于实验培养基和溶液的制备。</td></tr></tbody></table>

一种用于研究多孔介质中微生物介导金属氧化物沉淀的微流控平台

A Microfluidic Platform to Investigate Microbial Precipitation of Metal Oxides in Porous Media

微生物通常在土壤、沉积物及其他环境相关的多孔介质中沉淀金属氧化物纳米颗粒。然而，在物理结构复杂的环境中，锰（Mn）和铁（Fe）氧化物的形成过程及其反应活性仍缺乏充分表征。尽管实验室系统可将多孔介质作为基质使用，但通常需要进行破坏性取样，难以直接适用于孔隙尺度的分析。因此，针对动态且难以接近的多孔介质，亟需具备解析微生物介导矿物沉淀过程的能力。 原位 并实时进行。为弥补这一空白，开发了一种微流控平台，用于在模型孔隙空间中评估微生物介导的金属氧化物沉淀。该平台利用锰氧化细菌进行验证 Pseudomonas putida GB-1. 在连续流动条件下，通过延时彩色明场显微镜观察生物膜的发育及其相关的二氧化锰沉淀过程。随后结合图像差分算法与终点质量测量，估算二氧化锰沉淀速率。该方法为系统检验微生物介导的金属氧化物沉淀如何响应物理化学条件变化提供了工具。

本方案提供了一个用于时空分辨成像生物膜形成及锰生物矿化过程的实验平台。彩色明场图像显示，在锰氧化物沉淀开始前的 t = 18.5 h 时，P. putida GB-1 生物膜在整个微流控孔隙空间中均匀分布（图 5A）。随后，锰氧化物优先在靠近进水 Mn(II) 源的孔隙入口侧积累（图 5B）。参考图像与后续时间点图像之间的差异揭示了锰氧化物沉淀物对整体图像强度的独立贡献（图 5C），并实现了对反应器尺度上矿物积累梯度的定量分析（图 5D）。在生物膜尺度上，该图像相减方法捕捉到了锰氧化物在生物膜表面逐渐沉淀以及矿物在与孔隙液接触的生物膜边缘处积累的过程（图 6）。
该方案进一步提供了一种通过图像相减与ICP-MS测量来估算Mn氧化物沉淀动力学的工作流程。在最终实验时间点，三个平行的微流控反应器中含有4.29 ± 0.22 µg的Mn。此前已通过基于同步辐射的Mn氧化物质量测量验证了反应器内容物的酸消解方法，结果显示误差小于18%61。因此，对强度校正后的矩阵数据按此最终质量进行了重缩放。所得到的Mn氧化物沉淀速率估算值呈非单调变化，在t = 19.5 h至t = 21 h期间迅速上升，于0.29 ± 0.04 µg·h-1处达到峰值，随后逐渐减缓，直至t = 43.5 h（图7）。需要注意的是，该速率计算未考虑光学显微镜分辨率以下的纳米级Mn氧化物颗粒，也未计入实验持续过程中因迁移而损失的氧化物质量，但预计此类损失极小。因此，该方法利用易于获取的显微技术，对生物矿化动力学的时间趋势进行半定量评估。
<img alt="土壤孔隙度分析：显微图像、像素强度映射、强度与距离关系图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71047/71047fig5v4.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图 5"> 
图 5：反应器尺度上生物膜与锰氧化物的分布。（A）在静止期初期（t = 18.5 h，tref），微流控孔隙空间内 P. putida GB-1 生物膜的彩色明场图像。（B）在实验终点（t = 43.5 h），P. putida GB-1 生物膜表面及周围形成的锰氧化物沉淀的彩色明场图像。（C）实验终点（t = 43.5 h）经强度校正后的矿物积累矩阵图，其中颗粒显示为灰色，孔隙显示为白色。比例尺为 1 mm。（D）从孔隙空间入口（左侧）到出口（右侧）的总校正强度的一维空间分布（t = 43.5 h）。实线表示在三个重复实验中，沿流动方向（从入口到出口）每 1 mm 滑动平均所得的平均值，阴影区域表示标准偏差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/71047fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间推移的细胞生长；多个时间点的显微镜图像及增强对比分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71047/71047fig6.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图6"> 
图6：生物膜尺度的锰氧化物积累。（A）代表性P. putida GB-1生物膜的选彩色明场图像。锰氧化物最初表现为生物膜表面颜色由灰色变为棕色（显示于t = 20 h和t = 21 h），随后表现为生物膜边缘深棕色沉淀物的积累（显示于t = 33 h和t = 43 h）。（B）经强度校正的矿物积累矩阵图，其中颗粒呈深灰色，孔隙呈白色，底层生物膜呈浅灰色。比例尺为150 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/71047fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="沉淀速率随时间变化的曲线图；反应动力学和速率波动的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71047/71047fig7.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图 7"> 
图 7：随时间推移的 Mn 氧化物沉淀速率估算。 速率（µg·h-1）通过将每个时间点的总校正强度重新缩放至使用 ICP-MS 测量的终点 Mn 质量，然后对时间求导数来量化。数据点表示三次重复实验的平均值，阴影区域表示标准偏差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/71047fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1：Step1_ImageRegistration.m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/Step1_ImageRegistration.m" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：Step2_ImageSubtraction.m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/Step2_ImageSubtraction.m" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：Step3_Figures.m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/Step3_Figures.m" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了一种用于研究微生物介导的锰氧化物矿物沉淀的微流控系统。生物矿化过程的形成通过测量 原位 通过光学显微镜和图像分析. 该方法可适用于研究其他具有明显颜色的生物矿物在多孔环境中的沉淀过程。

微生物通常在土壤、沉积物及其他与环境相关的多孔介质中沉淀金属氧化物纳米颗粒。然而，其形成过程……

We've developed a microfluidic platform to study the dynamic precipitation of metal oxides by bacteria in a porous environment. This protocol enables in situ and real-time measurement of mineral precipitation, unlike conventional methods such as batch or column systems. To begin, add 10 milliliters of LB medium to a 50 milliliter conical tube.Inoculate the medium using a single colony of Pseudomonas putida GB-1, obtained from a plate that was streaked 20 hours earlier. Incubate the LB pre-culture in a shaker incubator at 30 degrees Celsius and 180 revolutions per minute for 16 hours to reach the stationary phase. Then, pellet one milliliter of LB pre-culture by centrifugation at 8, 000 G for one minute.After washing the pellet three times, re-suspend the final pellet in one milliliter of salt solution without manganese. Then, dilute the washed cell suspension fivefold in salt solution without manganese in a cuvette, and measure the optical density at 600 nanometers using a cell density meter. Inoculate 20 milliliters of growth medium without manganese with the washed cell suspension to an optical density of 0.01 in a 50 milliliter Erlenmeyer flask.Incubate at 30 degrees Celsius and 180 revolutions per minute for six hours to reach mid-exponential phase. Before beginning the experiment, verify that the microscope incubator is maintained at 30 degrees Celsius and prime the flow control system. Pour 10 milliliters of growth medium and salt solution with manganese into a 15 milliliter conical tube, and connect both tubes to the fluid reservoir rack.Degas the prepared microfluidic reactor in a vacuum desiccator for 20 minutes. Draw one to two milliliters of salt solution with manganese into a three milliliter plastic syringe. Attach a blunt tip needle and 20 centimeters of 0.02 inch inner diameter Tygon tubing, press the syringe plunger until the tubing is fully saturated.After de-gassing, use angled tweezers to attach the tubing to the reactor outlet hole. Manually saturate the reactor with the syringe until a droplet forms at the reactor inlet hole. Next, attach 20 centimeters of 0.02 inch inner diameter Tygon tubing to the reactor inlet hole.Continue dispensing salt solution with manganese into the reactor until all air bubbles are removed. To prepare the reactor inoculum, remove the mid-exponential culture from the shaker incubator six hours after inoculation. Dilute fourfold in salt solution without manganese in a cuvette.And measure the optical density. Then, dilute the mid-exponential culture in two milliliters of salt solution with manganese to an initial optical density of 0.005 in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert the tube several times to mix.Next, place the reactor inlet tubing in the microcentrifuge tube, ensuring that a droplet of fluid contacts the inoculum to prevent air introduction in the tubing. Partially close the microcentrifuge tube and secure the lid with tape to prevent contamination. Next, withdraw four to five milliliters of salt solution with manganese into a five milliliter glass gas tight syringe to wet the barrel.Dispense the solution until 0.5 milliliters remain in the syringe and load the syringe into a syringe pump. After disconnecting the plastic syringe from the needle, attach the needle to the glass syringe while avoiding trapping air in the needle hub. To inoculate the reactor, withdraw the inoculum into the reactor for 20 minutes at a flow rate of 8.33 microliters per minute.Turn off the syringe pump following inoculation and allow the bacteria to settle and attach for one hour with no flow. Then, remove the glass syringe from the syringe pump while leaving it connected to the outlet tubing. Next, move the reactor and syringe from the bench top to the microscope incubator.On the microscope stage, remove the inlet tubing from the reactor and push gently on the syringe plunger to create a droplet at the reactor inlet hole. Gently bend the polytetrafluoroethylene, or PTFE tubing, from the flow control system at a right angle. Dip the end of the PTFE tubing into a 1%polyethylene glycol diacrylate solution to wet the exterior of the hydrophobic tubing.Ensure a droplet of growth medium with manganese is present at the end of the PTFE tubing, and attach the tubing to the reactor inlet hole. After disconnecting the syringe, place the outlet tubing into a five milliliter microcentrifuge tube to collect the reactor effluent. Set the flow rate to 1.33 microliters per minute in the flow control system software.Program the system to supply growth medium with manganese for 15 hours to promote biofilm formation, followed by salt solution with manganese for 28.5 hours to induce manganese biomineralization. Next, place a sample frame underneath the reactor for stability. Rigidly mount the frame and reactor in the microscope stage insert to ensure full immobilization.Affix the PTFE tubing to the stage insert with a piece of tape to prevent its detachment from the reactor inlet hole. Align the ultraviolet C-arms two millimeters from the pore space edge on the outlet side and three millimeters on the inlet side to minimize UV light scattering and biofilm damage. Set up a program for reactor irradiation to treat the reactor inlet and outlet regions for five minutes at the experiment onset, then treat only the outlet region for five minutes, 17.5 hours after the experiment onset to inactivate remaining biofilms.Manually adjust the Kohler alignment, following the manufacturer's instructions to ensure even illumination. To prevent quilting artifacts, select Acquire and open the shading correction panel, then capture a shading image and set it as the current shading image. Select ND Acquisition and choose XY to set the center coordinate of the stitched image.Next, choose Large Image and set up the stitched image scan area as five by four fields of view, and apply a 1%overlap. Select Lambda and set up the acquisition of Color Brightfield images using the 4X objective. Select time and set the imaging frequency with intervals of one hour for 15 hours and 0.5 hours for 28.5 hours, then run the time lapse program.Brightfield images demonstrated that Pseudomonas putida GB-1 biofilms were uniformly distributed throughout the microfluidic pore space at 18.5 hours before the onset of manganese oxide precipitation. Subsequently, manganese oxides preferentially accumulated on the inlet side of the pore space closest to the influent manganese source. The difference between the reference image and subsequent image time points revealed the contribution of manganese oxide precipitates to the overall image intensity.Quantification of the observed mineral accumulation gradient was enabled at the reactor scale. At the biofilm scale, the image subtraction approach captured the gradual precipitation of manganese oxides on biofilm surfaces and accumulation of minerals at the edges of biofilms in contact with pore fluid. The resulting estimated rate of manganese oxide precipitation was non-monotonic, increasing steeply between 19.5 hours and 21 hours, peaking at 0.29 micrograms per hour and decelerating gradually until 43.5 hours.This protocol allows researchers to study the timing and location of mineral precipitation in a porous medium. It's critical to prevent biofilm growth in the reactor inlet region. This ensures a constant boundary condition and restricts precipitation to the pore space.Future studies can explore coupled microbe mineral fluid interactions under conditions relevant for environmental and engineering applications.

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环境

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