表征 Riboglow 探针 体外 作为活体哺乳动物细胞及三维细胞模型中荧光寿命成像的基础

我们的研究重点是在活细胞中可视化RNA，以研究RNA的时空动力学。Riboglow平台在多细胞系统中使用定量荧光寿命成像显微镜，适用于健康和疾病的生物系统。首先，获取RNA样品或带有珠子装载的Riboglow探针的细胞。

打开共聚焦激光扫描显微镜系统，然后是显微镜控制单元。打开基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微镜或FLIM系统，包括激光组合单元、光倍增器探测器和事件计时器。打开NIS图像采集和分析软件后，在设置和配置窗口下，选择AX with PicoQuant。

一旦软件启动，选择AX FLIM和FCS。要设置显微镜以获取荧光寿命数据，请确认在AX面板部分中选择了Galvano。将平均值设置为1，将停留时间设置为2。

在激光功率部分，将单个激光滑块降低到3至4%。将所有激光滑块设置为1。选择20X物镜后，在扫描区域设置中选择512乘以512并打开探测器。要定义数据文件路径，请转到控制器部分底部并选择配置。

点击PicoQuant或FLIM FCS选项卡后，在工作区路径下，选择右侧的文件夹符号。在存储位置处，为当天的实验创建一个新文件夹，然后关闭配置窗口。一旦选择了实时并出现图像采集窗口，再次选择实时以暂停光子收集。

要设置荧光寿命成像显微镜或FLIM数据收集窗口，右键单击实时图像窗口并选择PicoQuant插件。启用显示衰减曲线、显示时间轨迹和显示FLIM统计。要设置细胞实验的激光安排，请转到页面右上角的实验设置，旁边是激光。

在点击多通道染料框旁边的添加后，添加所需的染料。选择专家模式。调整每个发射光谱的探测器分配。

将重叠的激发和发射光谱引导至不同的探测器。在左侧面板上，调整通过顺序以最大程度地减少具有重叠激发和发射光谱的染料之间的串扰。保存并命名新的激光配置后，选择实验的保存配置。

右键单击实时采集窗口。选择采集控件，然后选择XYZ概述。在加载FLIM用于成像的细胞培养皿之前，添加活细胞核染料并通过在桌面上轻轻旋转进行彻底混合，然后放置30秒。

将成像皿放在显微镜舞台上。将皿推向显微镜舞台的左下角。使用非空气物镜时，将样品粘贴到舞台上以防止XY偏移。

切换到4'6-二氨基-2-苯基吲哚或DAPI通道。使用控制旋钮，直到细胞核进入焦点。如果需要，调整Z高度旋钮的灵敏度，如果看不到细胞，请调整XY坐标。

要启用完美焦点系统或PFS自动焦点，在AX面板的右侧，选择PFS按钮旁边的放大镜。一旦显微镜自动归一化Z高度，确认PFS按钮发光并显示为对焦。使用AX探测器，通过DAPI通道查找所需的细胞。

然后切换到ATO 590通道以有效地识别装载珠子的细胞。一旦通过双击确定并居中了一个细胞，切换到AX FLIM和FCS。确保选择了512乘以512，通过单击并拖动角来调整帧大小以适应细胞。

让调整大小的框变红。在框内右键单击或选择实时，直到框变为绿色以确认调整。在将捕获次数调整为所需值后，选择捕获。

观察新的捕获窗口和屏幕右侧的捕获进度框。打开FLIM分析软件后，导航到正确的文件路径。观察采集自动填充分析软件窗口。

收集时重命名采集。当捕获完成时，切换回AX探测器。选择实时搜索新细胞。

根据需要调整AX FLIM和荧光相关光谱或FCS窗口的大小，以适应更大或更小的细胞。在三小时成像期间获得新细胞后，导出创建的sptw文件。进行FLIM数据处理和分析，以从收集的样品中提取荧光寿命测量。

代表性衰减曲线显示，RNA A标签的存在增加了体外提取的荧光寿命，而没有RNA A标签的样品显示左移的衰减曲线，表明平均寿命值较短。装载3xGly的细胞的细胞荧光寿命显著低于装载5xGly的细胞。代表性衰减曲线显示，装载3xGly的细胞比装载5xGly的细胞的衰减曲线左移，表明平均荧光寿命值较低。

装载Riboglow探针的细胞核显示的荧光寿命总是高于同一细胞的细胞质。虚假颜色比例窗口、衰减曲线和提取的tau平均振幅值都显示了相同的荧光寿命趋势。该协议允许研究人员在不同的生物学环境中确定荧光分子的荧光寿命。

研究人员可以执行定量数据分析并评估感兴趣的变量，包括RNA配体的添加。未来的研究可以将Riboglow FLIM应用于疾病模型，扩展多路复用功能，并在活体动物系统中跟踪RNA动力学。