Name: 一个 体外 膜结合蛋白酶 FtsH 及其适配蛋白 LapB 介导的 LpxC 降解检测方法 大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 了解利用FtsH和LapB在蛋白脂质体中降解LpxC的荧光定量检测方法。该技术通过Atto488标记和TCA沉淀实现高灵敏度动力学分析，适用于研究膜结合AAA+蛋白酶活性及其调控机制。

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所有研究均在耶鲁大学进行。W.M. 获得美国普通医学科学研究所资助，资助编号为 R01GM137068 和 RM1GM149406，并获得理查德和苏珊·史密斯家庭基金会通过奥德赛奖提供的支持。

1. 使用 Atto488 标记 LpxC
<ol>
	<li>LpxC 的制备
	<ol>
		<li>按先前报道的方法表达并纯化LpxC蛋白18. 将纯化的 LpxC 缓冲液从 Tris 缓冲液置换为 50 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.6（6 mM NaH₂PO₄，44 mM Na₂HPO₄）2PO4，44 mM Na2HPO4，150 mM NaCl）通过使用高分辨率凝胶过滤柱（例如 Superdex 200 Increase 10/300 GL 柱）进行凝胶过滤纯化。</li>
		<li>使用超滤柱在 4 ℃ 下将 LpxC 浓缩至终浓度至少为 5 mg/mL &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 Atto488 标记 LpxC
	<ol>
		<li>将0.5 mg的LpxC用50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.6）稀释至终体积225 μL &#181;L. 加入25 &#181;1 M 碳酸氢钠溶液，用于将 pH 调至约 8.3。</li>
		<li>将 0.24 mg 的 Atto488 活性染料溶解于 20 &#181;0.1 M 碳酸氢钠缓冲液 L，用于制备储备液（0.012 mg/&#181;L）。通过稀释 2 配制工作溶液 &#181;将18升的储备溶液与 &#181;L 的 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液，终浓度为 0.0012 mg/&#181;L.</li>
		<li>立即加入 4 &#181;将 Atto488 工作溶液加入蛋白溶液中（LpxC : Atto488 的摩尔比为 3:1）。用铝箔包裹离心管，并于 4 ℃ 孵育 &#176;在 2 小时内以温和振荡（18 rpm）处理。 
		注意：Atto488 储备液和工作溶液均可在液氮中速冻，并于 -80 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LpxC–Atto488 与游离染料的分离
	<ol>
		<li>用10 mL超纯水平衡PD-10脱盐柱，随后用15 mL 50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.6）平衡。</li>
		<li>将标记反应混合物上样至柱中，并使其完全进入树脂。</li>
		<li>用5 mL pH 7.6的50 mM磷酸盐缓冲液洗脱。应出现两个明显条带，分别对应LpxC–Atto488（第一条带）和游离Atto488染料（第二条带）。收集第一条带的组分，每份约0.5 mL。</li>
		<li>通过 SDS-PAGE 分析洗脱组分。在考马斯亮蓝（CBB）染色前，于紫外光照射下观察荧光。</li>
		<li>合并含有 LpxC–Atto488 的洗脱组分，并将标记蛋白浓缩至约 2 mg/mL。</li>
		<li>使用微量分光光度计测定蛋白质浓度和Atto488浓度，以估算标记效率。 
		注意：Atto488 浓度（以 pmol/μL 计）与 LpxC 蛋白浓度（以 pmol/μL 计）之比&#181;LpxC 浓度（单位为 mg/mL）在 2–5 范围内时，表明标记水平适当。这对应于标记后 Atto488 与 LpxC 的摩尔比为 1:15 至 1:6。</li>
		<li>将 LpxC–Atto488 分装至 1.5 mL 微量离心管中，液氮速冻后于 -80 ℃ 保存 &#176;C. &#65279;此时，该实验方案可暂停长达3个月。 
		警告：液氮温度极低，操作时须佩戴适当的防护装备（耐低温手套、护目用具）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将 FtsH/LapB 重组到蛋白脂质体中
<ol>
	<li>脂质体的制备
	<ol>
		<li>将100 mg的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）氯仿溶液转移至玻璃试管中。在温和的氮气流下蒸发溶剂。&#8322;，随后在真空条件下过夜干燥。 
		注意：POPC 的相变温度约为 -2 &#176;C，广泛应用于膜生物物理学、脂质体配方及细胞模型系统中。 
		注意：氯仿可能对眼睛、皮肤、肝脏、肾脏和神经系统造成损害。操作时必须佩戴适当的防护装备（手套、眼部保护装置、口罩），并在通风橱中使用玻璃注射器进行操作。</li>
		<li>加入 1,315 &#181;将缓冲液A（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl）加入干燥的POPC薄膜中。通过水浴超声1分钟与最大速度涡旋1分钟交替进行，总时间约15分钟，直至脂质完全分散。（最终脂质浓度：100 mM）。 
		注意：为改善脂质重悬效果，可调节玻璃试管在水浴超声仪中的浸入深度以最大化振荡效果。重悬后的脂质可在 -20 ℃ 长期保存。 &#176;C. 此时，该实验方案可暂停，最长可达1个月。</li>
		<li>将脂质体悬液分装至200 &#181;L 部分并储存在 -20 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂质体挤出
	<ol>
		<li>解冻一份200 &#181;L 脂质体等分试样于室温水浴中解冻，并用 800 &#181;缓冲液A定容至1 mL。</li>
		<li>将脂质体在液氮和室温水浴之间交替进行三次冻融循环。</li>
		<li>用缓冲液 A 冲洗注射器、两个滤器支撑架和一张 200 nm 聚碳酸酯膜。组装微型挤出器，并将脂质体挤出 20 次。 
		注意：挤出后，脂质体悬液应呈透明状。</li>
		<li>将1 mL挤出的脂质体悬液均分为三份，每份330 μL，分装至三个离心管中。 &#181;每管 L）并用 600 稀释各管 &#181;缓冲液A的L</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Triton X-100 肿胀滴定 
	注意：Triton X-100 是一种 &#65279;低临界胶束浓度（CMC）去垢剂，以及 &#65279;在许多情况下，该方法已被证明最为成功21 
	警告：Triton X-100 为危险化学品，主要可造成严重眼损伤、皮肤刺激，以及吞咽后产生有害作用。操作时须佩戴适当的个人防护装备（手套、护目用具）。
	<ol>
		<li>按体积比配制10%的Triton X-100溶液，通过混合100 &#181;L Triton X-100 与 900 &#181;L超纯水，并在摇床中孵育以充分溶解Triton X-100。</li>
		<li>在540 nm处测定脂质体的吸光度（A&#8325;&#8324;&#8320;) 使用分光光度计。</li>
		<li>加入5 &#181;依次加入10% Triton X-100的L等分试样，每次加入后轻轻混匀，并测定A&#8325;&#8324;&#8320;继续逐滴加入Triton X-100，直至A&#8325;&#8324;&#8320; 达到最大值后，再分4至5次加入Triton X-100，直至吸光度下降至峰值的约60%。</li>
		<li>根据滴定曲线，通过加入 35 使脂质体膨胀 &#181;加入10% Triton X-100溶液L，室温下轻柔振荡孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 FtsH/LapB 重组至脂质体中
	<ol>
		<li>表达并纯化FtsH和LapB蛋白，方法如前所述18.</li>
		<li>用10倍体积的甲醇洗涤约2 g非极性聚苯乙烯吸附剂（例如Bio-Beads SM-2）一次，再用10倍体积的乙醇洗涤一次，随后用10倍体积的超纯水洗涤十次。将洗涤后的吸附剂置于缓冲液A中，4 ℃保存 &#176;C.</li>
		<li>对于每管经Triton X-100膨胀的脂质体，加入3 &#181;500 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）22.5 L &#181;克 FtsH 和 22.5 &#181;g LapB。用缓冲液A调总体积至1 mL，室温下轻柔振荡孵育1 h。 
		注意： &#65279;蛋白质与脂质的质量比为 1:20 至 1:200（wt/wt） &#65279;在蛋白脂质体重组过程中常规使用21. 此处采用1:100的比例。</li>
		<li>通过非极性聚苯乙烯吸附剂的连续孵育去除去垢剂：室温下加入40 mg孵育0.5 h，随后再加入40 mg于室温孵育1 h，然后加入40 mg于4 °C孵育过夜 &#176;C过夜，最后在4℃加入40 mg &#176;C 下反应 1 小时。</li>
		<li>短暂离心，以在 4℃ 下沉淀非极性聚苯乙烯吸附剂 &#176;C（400 &#215; g 离心3秒，将上清液转移至超速离心管中。用1 mL缓冲液A洗涤非极性聚苯乙烯吸附剂，并将洗涤液与上清液合并。再加入缓冲液A，使终体积约为6 mL。 
		注意：出于安全考虑，超速离心管中必须至少含有 6 mL 液体。</li>
		<li>平衡离心管，并在250,000 × g下超速离心 &#215; g 在 4 &#176;在固定角转子（例如 MLA-80）中于 4°C 离心 45 分钟，使蛋白脂质体沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，将蛋白脂质体沉淀重悬于 70 &#181;L 缓冲液 A，补充 1 mM&#160;TCEP 
		注意：最终蛋白脂质体体积约为 100 &#181;L.</li>
		<li>将蛋白脂质体在液氮中快速冷冻，并于 -80 ℃ 保存 &#176;C. &#65279; 
		注意：此步骤可暂停最多1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白脂质体的SDS-PAGE分析
	<ol>
		<li>充分混匀蛋白脂质体，并取 5 &#181;样品的 L 与 5 &#181;2 L&#215; SDS上样缓冲液（0.1 M Tris-HCl，pH 6.8，5% SDS，20%甘油，0.01%溴酚蓝，200 mM DTT）</li>
		<li>将蛋白脂质体样品与525 ng的FtsH（相当于0.06 &#181;20 中的 M FtsH 六聚体 &#181;在4–20% SDS-PAGE凝胶上</li>
		<li>用考马斯亮蓝染色凝胶。</li>
		<li>扫描凝胶并量化每个样品中 FtsH 条带的强度。计算相当于 525 ng FtsH 的蛋白脂质体悬液体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 体外 LpxC–Atto488的降解
<ol>
	<li>执行 体外 在20中的降解实验 &#181;含 FtsH/LapB 蛋白脂质体（相当于 0.06 &#181;M FtsH) 以及 0.5、1、2、2.5、5、10、20、40 &#181;50 mM Tris-乙酸盐缓冲液（pH 8.0）、10 mM Mg-乙酸盐、5 mM ATP、25 mM LpxC-Atto488 &#181;M Zn-乙酸盐，80 mM NaCl，1.4 mM &#946;-巯基乙醇）</li>
	<li>对于每个底物浓度的测定，准备70 μL的反应体系 &#181;L.
	<ol>
		<li>取20 &#181;L 分数并立即与 48 混合以终止反应 &#181;在1.5 mL微量离心管中加入5%三氯乙酸（TCA）以终止反应（0 min）。分别在10和20 min时取第二和第三份样品并终止反应。</li>
		<li>同时，制备不含蛋白脂质体的相应对照反应，用于背景扣除。 
		注意：建议进行三次重复测量，以获得可靠的结果。 
		处理 LpxC–Atto488 时应尽量减少光照暴露。 
		警告：三氯乙酸（TCA）是一种强腐蚀性化学品，可导致严重皮肤灼伤、永久性眼损伤，并在吸入时引起强烈呼吸道刺激。操作时应佩戴适当的个人防护装备（手套、护目镜、口罩）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 37 °C 下孵育样品 &#176;C 下孵育 30 分钟以沉淀蛋白质，然后在 18,800 &#215; g 室温孵育 20 分钟。</li>
	<li>通过转移50 μL样品至中和液中以中和样品 &#181;将上清液的 L 加入含有 60 的试管中 &#181;500 mM Tris-HCl 溶液，L&#160;pH 8.8。充分混匀后转移 100 &#181;将样品转移至黑色96孔板中。使用酶标仪在激发波长498 nm、发射波长520 nm条件下测定荧光信号。</li>
</ol>

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</ol>

&#65279;作者声明不存在任何竞争性财务利益。

本方案的第一个关键步骤是LpxC的Atto488标记。适度的标记对于准确测量至关重要 体外 降解活性。根据我们的优化实验，LpxC与Atto488的摩尔比在9:1至3:1之间为最佳。过量的Atto488会导致过度标记，可能干扰LpxC的天然状态。在此条件下，FtsH单独作用与FtsH/LapB联合作用对LpxC–Atto488降解的差异显著减小（数据未显示）。相反，标记不足则会产生过弱的荧光信号，难以进行灵敏的动力学测量。当将本方案用于检测其他水溶性底物的降解时，底物与Atto488的摩尔比为3:1可作为有效的起始点。
确定FtsH/LapB在蛋白脂质体中重建效率是本实验方案的第二个关键步骤。为了定量评估FtsH/LapB介导的LpxC降解，必须测定蛋白脂质体中FtsH的浓度。在本方案中，通过比较标准FtsH样品与蛋白脂质体样品中FtsH条带的强度来估算FtsH的浓度。
值得注意的是，即使在不存在 FtsH/LapB 的情况下，LpxC–Atto488 也会发生部分自降解或变性。因此，在使用该检测方法时，背景...

&#65279; AAA+ 蛋白酶是一类保守的、依赖 ATP 的分子机器，在蛋白质质量控制和调控性蛋白水解中发挥核心作用1,2这些机器包含一个由AAA+ ATP酶结构域组成的六聚体环，可水解ATP，并识别、解折叠和 &#65279;将底物转运至区室化的蛋白酶结构域以进行降解1. 尽管细胞质中的AAA+蛋白酶（如ClpXP）3 和 Lon4 已通过成熟可靠的方法进行了广泛表征 体外 检测方法，膜结合型AAA+蛋白酶仍相对知之甚少。这一空白主要源于将膜蛋白重构到明确脂质环境中的技术挑战，以及对其蛋白水解活性进行定量测量的困难。 体外该方法的总体目标是建立灵敏且定量的检测体系，用于研究膜结合蛋白酶的蛋白水解活性。
FtsH 是 Escherichia coli 中唯一必需的 AAA+ 蛋白酶，是典型的膜结合型 AAA+ 蛋白酶5,6,7。FtsH 通过其 N 端跨膜螺旋锚定于内膜，可降解多种胞质和膜相关底物，从而调控膜蛋白质量控制、应激反应以及脂质稳态8,9,10,11。其中研究最清楚的底物之一是 LpxC，这是一种可溶性去乙酰化酶，催化脂多糖（LPS）生物合成的第一步限速反应12,13。FtsH 对 LpxC 的高效降解依赖于膜蛋白 LapB，后者作为衔接蛋白特异性识别 LpxC 并将其递送至蛋白酶进行降解14,15,16,17,18。
尽管FtsH介导的蛋白水解具有重要的生理意义，其定量分析仍面临挑战 体外 尤其是对于LpxC等胞质底物而言，相关研究仍十分有限。传统的 体外 降解实验采用在去垢剂胶束中纯化的 FtsH13,19，无法为膜锚定的蛋白酶提供膜环境。此外，降解检测通常依赖于通过SDS–PAGE检测底物的减少13，该方法可能耗时较长、通量较低，且对动力学分析的灵敏度不足。最近，Heedeok Hong 团队开创性地利用将 FtsH 重组至双层胶束（bicelles）中的体系，用于研究膜底物的降解。20然而，用于分析胞质底物的可比系统仍付之阙如。在此，我们将 Heedeok Hong 的bicelle重组技术改造用于蛋白脂质体重组，以模拟膜环境。此外，将水溶性底物LpxC进行荧光标记，从而实现对FtsH/LapB依赖性LpxC降解动力学的高灵敏度和定量检测 体外.
当研究人员需要定量测量FtsH介导的水溶性底物蛋白水解时，应使用本方法。该方法相较于现有方法具有多项优势。首先，基于荧光检测蛋白水解产物而非底物减少，显著提高了检测灵敏度和动态范围，有利于对蛋白水解活性进行定量比较。其次，使用蛋白脂质体可在维持FtsH功能所需膜环境的同时，精确控制蛋白质和脂质组成18。最后，尽管本方案基于FtsH–LapB–LpxC系统开发，但可轻松适用于其他膜结合AAA+蛋白酶及其需要膜相关降解机制的胞质底物。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>USA scientific</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>200 nm 聚碳酸酯膜</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>4-20% SDS-PAGE</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>腺苷-5&amp;prime;-三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Atto 488 蛋白标记试剂盒</td><td>Sigma</td><td>38371</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-8920</td><td>非极性聚苯乙烯吸附剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>黑色 96 孔板&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R250</td><td>Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>滤膜支撑架</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610017</td><td></td></tr><tr><td>玻璃试管</td><td>KIMBLE</td><td>45066-16150</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Avantor</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>乙酸镁四水合物</td><td>Sigma</td><td>228648</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75-002-436</td><td></td></tr><tr><td>小型挤出器</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MLA-80 转子&amp;nbsp;</td><td>Beckman</td><td>367096</td><td>固定角转子&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Tecan</td><td>Infinite&amp;nbsp;M1000 PRO</td><td></td></tr><tr><td>POPC&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>制冷微量离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002559</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>American Bio</td><td>AB01920-00500</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>38400100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>567547</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-11201</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>SCILOGEX</td><td>SCI-V1000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>Cytiva&amp;nbsp;</td><td>28990944</td><td>高分辨率凝胶过滤柱&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台式超速离心机</td><td>Beckman</td><td>Optima MAX-XP</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管&amp;nbsp;</td><td>Beckman</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>超滤柱&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 混匀器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锌二水合物</td><td>Sigma</td><td>379786</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

一个 体外 膜结合蛋白酶 ftsh 及其适配蛋白 lapb 介导的 lpxc 降解检测方法 大肠杆菌

An In Vitro Assay For LpxC Degradation By The Membrane-Bound Protease FtsH And Adaptor LapB From Escherichia coli

本方案提供了一种灵敏、定量的方法 体外 使用在蛋白脂质体中重建的AAA+（与多种细胞活动相关的ATP酶）蛋白酶FtsH及其适配蛋白LapB降解LpxC的检测方法。AAA+蛋白酶是一类依赖ATP的分子机器，可在细胞质或细胞膜上维持蛋白质稳态并调控多种细胞过程。与胞质中的同类蛋白酶相比，膜结合型AAA+蛋白酶由于在活性重建与检测方面存在技术挑战，其特性仍知之甚少。 体外在此，我们以 FtsH–LapB–LpxC 系统为模型，开发了一种基于荧光的蛋白脂质体降解检测方法。将 FtsH 和 LapB 重组至蛋白脂质体中以模拟天然膜环境，同时将 LpxC 共价标记荧光染料 Atto488。通过将蛋白脂质体与标记的 LpxC 及 ATP 混合启动降解反应，并以三氯乙酸（TCA）终止反应。成功的检测表现为 TCA 沉淀后可溶性上清液中荧光信号随时间递增，该信号对应于 LpxC 蛋白水解产生的荧光肽片段的释放。此信号可用于在特定条件下直接定量初始降解速率。与传统的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测方法相比，本方法显著提高了灵敏度，并可实现定量动力学分析。此外，蛋白脂质体系统可系统性地研究蛋白组分（如适配蛋白和抗适配蛋白）以及脂质组成对 LpxC 降解的影响。尽管该检测方法针对 FtsH–LapB–LpxC 系统开发，但其可便捷地适用于其他膜结合的 AAA+ 蛋白酶及其底物，为研究膜相关蛋白水解提供通用平台 体外.

为了提高该方法的灵敏度 体外 降解实验中，底物LpxC用荧光染料Atto488标记。Atto488的琥珀酰亚胺酯基团在弱碱性条件下可高效地与LpxC的伯氨基发生反应。由于Tris缓冲液含有会干扰该反应的伯氨基，因此将在Tris缓冲液中纯化的LpxC通过凝胶过滤置换至磷酸盐缓冲液后再进行标记。标记反应中，LpxC与Atto488的摩尔比为3:1，以实现适度标记并避免过度标记（见讨论部分）。去除游离染料后，通过SDS-PAGE分析LpxC–Atto488组分，并在紫外光下观察荧光图1A）。随后用考马斯亮蓝（CBB）对同一凝胶进行染色，以确认LpxC蛋白的存在（图1B). 荧光条带与蛋白质条带的位置重合，表明游离染料已从标记的LpxC制备物中有效去除（图1).
为了实现FtsH和LapB高效地重组到脂质体中，使用Triton X-100对预先形成的脂质体进行部分去稳定化处理。随着Triton ...

大肠杆菌 主要通过调控LpxC（催化脂多糖合成第一步的关键脱乙酰酶）的降解来调节脂多糖（LPS）的生物合成。本实验方案的目标是建立一种灵敏、定量的方法 体外 使用重组的AAA+蛋白酶FtsH和适配蛋白LapB在蛋白脂质体中进行LpxC降解实验。

一个 体外 膜结合蛋白酶 FtsH 及其适配蛋白 LapB 介导的 LpxC 降解检测方法 大肠杆菌

本方案介绍了一种利用重建的AAA+（与多种细胞活动相关的ATP酶）蛋白酶对LpxC进行高灵敏度、定量的体外降解检测方法。

大肠杆菌通过调控脂多糖的降解来调节脂多糖的合成。本研究重点在于建立一种体外脂多糖降解检测方法。该方案可用于定量测定FtsH介导的水溶性底物的蛋白水解作用。首先，获取 LpxC 蛋白。将 0.5 毫克蛋白溶于 pH 7.6 的 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液中，定容至 225 微升。加入 25 微升 1 摩尔碳酸氢钠溶液，将 pH 调整至约 8.3。通过将 2 微升预先配制的储备液与 18 微升 0.1 摩尔碳酸氢钠缓冲液混合，配制 Atto488 工作液，使其终浓度为 0.0012 毫克/微升。立即将 4 微升 Atto488 工作液加入蛋白溶液中。将离心管用铝箔包裹后，置于 4 摄氏度条件下轻柔振荡反应 2 小时。用 10 毫升超纯水清洗 PD-10 脱盐柱，再用 15 毫升磷酸盐缓冲液平衡层析柱。将标记反应混合物加至已平衡的层析柱上，并使其完全进入树脂。向柱中加入 5 毫升 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液，观察到两个明显分离的条带，分别对应 LpxC--Atto488 和游离的 Atto488 染料。收集第一条带的组分，每份约 0.5 毫升。使用 SDS-PAGE 分离洗脱组分。在紫外光照射下或使用荧光成像仪观察 Coomassie brilliant blue（CBB）染色前的荧光信号。合并含有 LpxC--Atto488 的组分。将标记后的蛋白浓缩至约 2 毫克/毫升，使用 Nanodrop 测定蛋白和 Atto488 的浓度，以评估标记效率。将 LpxC--Atto488 分装至 1.5 毫升微量离心管中。经液氮速冻后，于 -80 摄氏度保存样品。在通风橱内，将100毫克溶于氯仿中的POPC转移至玻璃试管中。在温和的氮气流下蒸发溶剂后，于真空条件下过夜干燥。向干燥的POPC薄膜中加入1.315毫升缓冲液A（含20毫摩尔/升Tris-盐酸，pH 7.5，以及100毫摩尔/升氯化钠）。通过水浴超声1分钟与最大转速涡旋振荡1分钟交替进行的方式，重悬脂质约15分钟，直至脂质完全分散。将脂质体悬液分装为每份200微升。取一份200微升的脂质体等分试样，加入800微升缓冲液A进行稀释。将脂质体在液氮和室温水浴之间交替进行三次冻融循环。用缓冲液A冲洗注射器、两个滤器支撑装置以及一张200纳米聚碳酸酯膜后，组装小型挤出器。将脂质体挤出20次，直至溶液呈现透明状。将1毫升挤出后的脂质体悬浮液均分至三个离心管中，每管加入600微升缓冲液A进行稀释。将100微升Triton X-100与900微升超纯水混合，并在摇床上孵育。使用分光光度计在540纳米处测定脂质体悬液的吸光度。依次向脂质体悬液中加入5微升10% Triton X-100等分试样。每次加入后轻轻混匀悬液，并在540纳米处测定吸光度。持续添加Triton X-100，直至吸光度达到最大值，然后下降至峰值的约60%。根据滴

an-vitro-assay-for-lpxc-degradation-membrane-bound-protease-ftsh

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

一项体外测定法，用于膜结合蛋白酶FtsH和大肠杆菌的转接器LapB降解LpxC。

通过将底物L-赖氨酸和产物尸胺与2,4,6-三硝基苯磺酸反应生成在甲苯中溶解度不同的加合物，来监测可诱导赖氨酸脱羧酶的活性。...

一种用于测量活性的检测方法 大肠杆菌 可诱导赖氨酸脱羧酶

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磁性激活细胞分选介导的脂质囊泡亲和层析（LIMACS）：一种分析蛋白质-脂质相互作用的新方法

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我们描述了一种用于追踪由胞内细菌引发的内膜系统破裂的方法 志贺氏菌 福氏 和 结核分枝杆菌...

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利用重组融合蛋白进行荧光蛋白酶检测平台及其凝胶内复性

本文介绍了一种灵敏的荧光检测方法，利用二酰基甘油肽和炔基磷脂作为底物，结合点击化学反应，用于监测载脂蛋白N-酰基转移酶的活性。...

基于点击化学的荧光检测法用于载脂蛋白N-酰基转移酶的酶学表征及高通量筛选

了解利用FtsH和LapB在蛋白脂质体中降解LpxC的荧光定量检测方法。该技术通过Atto488标记和TCA沉淀实现高灵敏度动力学分析，适用于研究膜结合AAA+蛋白酶活性及其调控机制。

一个体外膜结合蛋白酶 FtsH 及其适配蛋白 LapB 介导的 LpxC 降解检测方法大肠杆菌

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