阿米卡星保护法用于定量与可视化 大肠杆菌 细胞侵袭

我们重点研究黏附侵袭性大肠杆菌（E.coli）侵入肠上皮细胞的机制，并鉴定参与该过程的细菌因子。由于传统侵袭实验受到庆大霉素抗性菌株的限制，本实验采用基于阿米卡星的方案，可实现对细胞内细菌的准确定量。

首先，准备好侵袭实验所需的所有试剂和培养基。接着，从-80摄氏度冰箱中取出黏附侵袭性大肠埃希菌（adherent-invasive Escherichia coli，简称AIEC）菌株的甘油冻存管。使用无菌的木签或移液器吸头，轻轻刮取菌种管中的细菌，并在Luria-Bertani（简称LB）琼脂平板上划线，以获得单菌落。

将培养板在37摄氏度下孵育过夜。第二天，使用无菌的木棒或移液器吸头，从平板上挑取单个菌落。将该菌落接种至3毫升LB液体培养基中，并在37摄氏度、200转/分钟的条件下振荡培养过夜。

然后将过夜培养物在1毫升LB液体培养基中进行1:10稀释。使用分光光度计测定稀释后培养物在600纳米处的光密度。取100微升过夜培养物转移至1.5毫升微量离心管中，在4摄氏度下以6,000 G离心10分钟。

小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并将沉淀重悬于 1 毫升无血清且不含抗生素和抗真菌剂的培养基中。根据提供的公式计算所需细菌悬液的体积，以达到感染复数（MOI）为 10 的条件。为制备感染用培养基，将计算好的细菌悬液体积转移至一支无菌的 1.5 毫升微量离心管中，并用无血清且不含抗生素和抗真菌剂的培养基补足体积至 1 毫升。

用移液器轻轻吹打数次以混匀。准备一个96孔板，通过在无菌1×PBS中进行10倍系列稀释，测定稀释后过夜培养的细菌培养物每毫升的菌落形成单位。将200微升稀释后的过夜培养物转移至板中的第一个孔。

取20微升菌液加入下一列含有180微升1×PBS的孔中。用移液器吹打混匀10次，每次稀释均使用新的枪头，重复该稀释步骤直至获得10⁶倍稀释液。随后，将10²至10⁶倍稀释度的菌液各取10微升，分别以三个重复点样接种于LB琼脂平板上。

将点样物置于火焰附近，使其被螺旋推进器吸收。将培养皿在27至30摄氏度下孵育过夜，以防止菌落过度生长，获得清晰的单菌落。从培养箱中取出在胶原蛋白包被的24孔培养板中培养的健康融合的Caco-2上皮细胞单层，吸去每孔中的完全培养基。

用移液器将一毫升不含血清和抗生素-抗真菌剂的培养基加入每个孔中。吸去培养基以去除残留液体，并重复洗涤一次，共洗涤两次。随后，向含有Caco-2细胞的24孔板的每个孔中加入1毫升先前配制好的含有AIEC的感染培养基。

将24孔板在室温下以500 × g离心15分钟，以同步细菌与上皮单层细胞的接触，并将该板在37°C、5%二氧化碳条件下孵育3小时，以允许细菌侵袭发生。通过向预热的不含血清和抗生素-抗真菌剂的培养基中加入240 µg/mL的阿米卡星，制备含抗生素的培养基。感染期结束后，吸除Caco-2细胞单层上的培养基，并用1 mL不含血清和抗生素-抗真菌剂的培养基洗涤每个孔。

吸弃培养基，再重复洗涤一次，共洗涤两次。随后，向每个孔中加入1毫升含240微克/毫升阿米卡星的培养基。同时，另设一组细胞用100微克/毫升庆大霉素处理作为对照，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时，以清除胞外细菌。

孵育后，吸去每孔中的培养基。加入1毫升PBS以洗去黏附的细菌。吸去PBS，再重复洗涤一次，共洗涤两次。

向每个孔中加入200 µL用PBS稀释的1% Triton X-100，置于摇床上，以每分钟90转的速度孵育10分钟，以裂解上皮细胞。每个孔上下吹打约30次，使细胞从培养板上脱离。接着，在96孔板中用PBS对细胞裂解液进行10倍系列稀释。

将未稀释至10的3次方稀释度的样品，以每稀释度3个重复，每个重复点样10微升，接种于LB琼脂平板上。点样液干燥后，于27至30摄氏度培养过夜，以获得清晰的单菌落。培养结束后取出平板，从适当的稀释度点样区域中计数分离良好的菌落，要求每个点样区域在3个重复中均有超过7个菌落。

最后，使用公式计算接种物和回收的每毫升菌落形成单位数以及侵袭百分率。在用侵袭性 AIEC 菌株 NRG857c 或非侵袭性大肠杆菌 DH5 alpha 对照菌株感染 Caco-2 细胞单层后，分别采用庆大霉素或阿米卡星处理，结果显示出相似的侵袭曲线。这些结果表明，阿米卡星在清除细胞外细菌方面与庆大霉素同样有效，并能准确反映细胞内细菌负荷量。

对从炎症性肠病患者中分离获得的庆大霉素耐药性大肠埃希菌临床菌株使用庆大霉素处理，结果显示细菌回收率差异极大，范围约为21%至2,788%。相比之下，阿米卡星处理在所有菌株中均显著降低了细菌回收率，显示出其更高的有效性，并能够实现更可靠的侵袭性测量。本方案可实现对上皮细胞内细菌的精确定量，并评估细菌的侵袭能力。此外，可采用免疫荧光显微镜等其他方法进一步验证细菌侵袭性及确认细菌在细胞内的定位。

未来的研究可以鉴定新的毒力因子，并探究黏附侵袭性大肠杆菌感染过程中所靶向的宿主通路。