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我们感谢实验室所有成员对本工作相关问题提出的宝贵意见和讨论。我们还要感谢并致谢加拿大安大略省多伦多市伦德尔-塔嫩鲍姆研究所（LTRI）表型基因组中心在小鼠实验方面提供的全部帮助与专业支持。本研究获得了加拿大卫生研究院项目资助（PJT462506）、特里·福克斯研究研究所项目资助（TFRI 项目 #1107）以及尼科尔家族基金会对 D.S. 的资助。E.R.L. 获得了加拿大癌症协会研究培训奖和弗兰克·弗莱彻纪念基金的支持。&#160;K.N.A. 获得了 H.L. 霍姆斯博士后奖以及加拿大癌症研究协会资助（编号 1318698 和 26089）的支持。J.N. 获得了加拿大卫生研究院加拿大研究生奖学金—硕士阶段以及加拿大卫生研究院博士研究奖（#193389）的支持。Y.L. 获得了加拿大卫生研究院研究卓越、多样性与独立性博士后奖学金（#ED6-190718）的支持。

D.S. 是 ViVerita Therapeutics 的顾问及创始人，其实验室与 ViVerita Therapeutics 拥有赞助研究协议和服务协议。

混合池构建中的一个关键考虑因素 体内 CRISPR筛选的关键在于实现足够的文库覆盖，同时保持稀疏的单细胞转导，以维持克隆分辨率2在小鼠乳腺中，上皮区室保守地包含约 3.5 × 105 每腺体细胞数36在平均慢病毒转导率为15%的条件下（该转导率可最大限度降低单个细胞多重感染的频率），导管内递送可实现约5 × 104 每腺体转导的上皮细胞36,55因此，同时对第三胸段和第四腹段乳腺进行双侧注射，可获得约 2 × 105 每只小鼠转导的上皮细胞36,55根据这些参数，包含 4,000 个 gRNA 的文库（相当于 CRISPR-KO 筛选约 1,000 个基因或 CRISPR-A 筛选约 500 个基因）需要约 4 × 10<sup...

功能基因组学筛选为大规模研究基因功能提供了强大的研究框架1CRISPR-Cas 基因编辑技术的发展使得可并行系统性地扰动数百至数千个基因，基于混合池的 CRISPR 筛选在哺乳动物细胞系中已成为现代癌症生物学研究的核心手段2。这些 体外 方法已鉴定出必需基因3肿瘤抑制因子4，以及合成致死相互作用5 在多种癌症背景下均如此。然而，一个主要局限在于无法捕捉肿瘤复杂的生物学特征 体内，包括与免疫系统和间质的相互作用、微环境中的营养梯度以及组织结构2. 与此局限性一致，近期研究已表明许多 真正有效的 癌症驱动基因未能产生可测量的影响 体外，尤其是当其功能依赖于细胞培养中所缺乏的微环境信号时6,7,8,9,10.
小鼠乳腺为研究提供了独特且极具优势的组织环境 体内 功能基因组学筛选。乳腺上皮细胞具有很强的再生能力，在动情周期中经历多轮克隆扩增，并形成分支状的导管网络结构，该结构易于接触且可进行遗传操作11,12,13这些特性支持了数十年的嵌合体遗传分析和谱系示踪实验，使乳腺成为研究组织稳态及疾病过程中细胞自主性及微环境依赖性基因功能的可操作体系。14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33重要的是，基因扰动可被限制在上皮细胞区室中，从而能够在完整的组织环境中直接研究上皮细胞特异性的转化驱动因素、细胞竞争、谱系保真度以及肿瘤进展。
尽管已开发出多种策略用于将基因扰动直接递送至成年乳腺组织 原位，但在高通量应用方面仍存在重大的技术障碍。腺病毒介导的Cre重组酶递送已广泛用于在成年乳腺中诱导条件性等位基因的体细胞重组34,35,36,37，提供了一种高效调控基因功能的方法，无需传统基因工程小鼠模型（GEMMs）所必需的复杂生殖系育种过程。尽管高滴度腺病毒也可将CRISPR-Cas9组分递送至组织驻留细胞，但这类载体不会整合到宿主基因组中38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49这严重限制了筛选规模至约10–55个基因，因为每个gRNA靶位点都必须使用分子倒置探针进行 individually 测序38,39,40,41,42,43,44,45,46,47此外，目前现有的导管内递送方法虽可直接进入乳腺导管系统，但需要通过侵入性外科手术暴露乳腺组织50 或依赖于使用相对的比较方法&#160;大型Hamilton注射器，使用不便51尽管这些方法在病毒的局部递送方面有效，但相对更具侵入性，技术难度较高，且未针对 pooled lentiviral 文库的规模化递送进行优化。&#160;综上所述，这些研究结果表明 原位 病毒扰动是可行的，但现有工具尚不支持高通量研究所需的稳定、混合且可检索序列的扰动方法 体内 CRISPR 筛选
为了解决这些局限性，我们及其他研究者已转向使用慢病毒载体整合技术，该技术可实现稳定且可遗传的基因修饰。与细胞培养系统相比， 体内 组织对单个器官内可产生的扰动细胞数量施加了严格限制，使得全基因组筛选变得不切实际。因此， 体内 CRISPR 筛选需要设计基于生物学信息、有针对性的文库，以在覆盖范围与可行性之间取得平衡。此外，大多数 体内 CRISPR 筛选，本文综述2，尽管越来越多的证据表明基因激活能够揭示互补且无重叠的生物学见解，但迄今为止的研究几乎完全集中在慢病毒介导的基因功能缺失扰动上52,53,54,55我们及其他研究团队此前已证明，将慢病毒CRISPR扰动整合至成年乳腺上皮组织，可实现稳定且可遗传的基因修饰。 原位 并且能够从基因组DNA中回收并进行定量36,55,56,57,58采用这种方法，我们进行了混合样本分析 体内 发现致癌转化新驱动因子的CRISPR筛选36,55，证实了慢病毒递送和CRISPR筛选在该体系中的可行性和生物学相关性。然而，这些研究也凸显出对一种简单、标准化且可扩展的实验方案的需求，该方案应易于广泛采用，并可拓展至在同一腺体中同时涵盖基因功能缺失和功能获得的筛选模型。
本文介绍了一种简单且多功能的导管内注射策略，可在成年小鼠乳腺中并行开展CRISPR基因敲除与激活文库的体内筛选，该方法称为CRISPR-KOALA55。CRISPR-KOALA采用常规的20-21 bp“单导向”（sg）RNA实现CRISPR-KO功能，或采用14 bp“失活导向”（dg）RNA实现CRISPR-A功能。dgRNA可高效引导Cas9至靶位点，但阻止Cas9核酸内切酶活性59,60,61，因此可在表达活性Cas9的同一只小鼠中同时实现基因敲除与基因激活两种模式。在dgRNA的trcr区域引入两个PP7发夹结构，可招募PP7衣壳蛋白:P65:HSF1转录激活复合物62，从而在体内实现基因的高效过表达55（图1）。该方法结合靶向gRNA文库设计、高滴度慢病毒制备以及利用玻璃毛细管进行非手术式导管内递送，可在保持组织结构和微环境相互作用的前提下，在乳腺中生成数万个空间上独立的上皮细胞克隆。重要的是，慢病毒整合至宿主基因组后，可通过高通量测序回收并定量gRNA，从而实现体内混合功能基因组筛选。综上，该策略可在表达Cas9的小鼠同一乳腺组织中，实现CRISPR-KO与CRISPR-A的并行或同步（在同一细胞内）基因扰动。
我们提供了一套详细的逐步操作方案，涵盖gRNA文库设计、慢病毒的制备与浓缩、导管内递送、文库解卷积及数据分析图1。综上所述，该方法为规模化应用提供了一个实用且可扩展的框架 体内 小鼠乳腺中的CRISPR基因敲除和/或激活筛选，可适用于研究基因在组织稳态、不同疾病背景下、其他组织以及其他物种（如大鼠）中的功能。

<table><tbody><tr><td>0.45 微米滤膜</td><td>Sigma</td><td>S2HVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>12k 或 92k 寡核苷酸芯片</td><td>Customarray Inc. (Genscript)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm 细胞培养板</td><td>Corning</td><td>CLS353004</td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>293NT</td><td>Systems Biosciences</td><td>LV900A-1</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>NEB</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart 缓冲液</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>深度测序（Next-Seq 或 Hi-Seq）</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAesy 血液与组织 DNA 提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基</td><td>Wisent</td><td>319-015-CL</td><td></td></tr><tr><td>Endura 电转感受态细胞</td><td>Lucigen</td><td>60242-1</td><td></td></tr><tr><td>EpiCult-B 小鼠培养基试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>05610</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0734L</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Wisent</td><td>090-150</td><td></td></tr><tr><td>凝胶 DNA 纯化试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4008</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿</td><td>BioRad</td><td>1652089</td><td></td></tr><tr><td>温和型胶原酶/透明质酸酶</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7919</td><td></td></tr><tr><td>H11-Cas9</td><td>Jackson Labratories</td><td>JAX#028239</td><td></td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>MLS-50</td><td></td></tr><tr><td>Kim-wipe 擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Wisent Technologies</td><td>800-011-LG</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Frogga Bio</td><td>PDH300</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1（BsmBI 缓冲液）</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸纯化试剂盒</td><td>Zymo research</td><td>D4060</td><td></td></tr><tr><td>PAGE 纯化的 Illumina 测序引物</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 微量移液器</td><td>Drummond</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>PEI（聚乙烯亚胺）</td><td>Sigma</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>pLKO-Cre</td><td>Addgene</td><td>158032</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P2636-100MG</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pXPR502-PPH-Cre</td><td>Addgene</td><td>256776</td><td></td></tr><tr><td>Q5 聚合酶 2x 预混液</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光定量系统</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>R26-LSL-Cas9-EGFP</td><td>Jackson Labratories</td><td>JAX#024857</td><td></td></tr><tr><td>R26-LSL-TdTomato 小鼠</td><td>Jackson Labratories</td><td>JAX#007909</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>NEB</td><td>R0569L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤装置</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCHVU02RE</td><td></td></tr></tbody></table>

平行 体内 小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选

Parallel In Vivo Screening of Gene Knockout and Activation in the Mouse Mammary Gland

正向遗传学筛选通常以混合方式扰动数千个遗传元件，旨在构建大规模的基因型到表型的图谱。尽管此类筛选常在细胞培养系统中进行，但越来越多的证据表明 体内 筛选能够揭示出无法被重现的新生物学现象 体外然而，这一方法的广泛应用受到两个主要挑战的限制：一是研究主要集中于基因功能缺失型扰动，而非基因激活；二是将复杂的基因文库递送至特定组织面临重大的技术难题 体内为克服这些挑战，我们描述了一种简单且多功能的导管内注射策略，可通过生成数万个独立的上皮克隆，在小鼠乳腺中实现高效、快速的功能基因组筛选。此外，我们提供了文库构建、导管内注射、筛选解卷积以及CRISPR敲除和激活文库分析所需的全部细节，以实现全面研究 体内 筛选。利用这些工具——我们称之为CRISPR-KOALA（基因敲除与激活联合检测），已在包含从46个位点到五分之一个基因组范围的混合文库中，鉴定了编码区和非编码区基因组中的新型肿瘤抑制基因和癌基因。重要的是，该方法及分析策略可应用于其他器官，以研究任何基因在稳态或疾病状态下的生物学功能。

本文提供了一种在小鼠乳腺中进行混合型体内CRISPR筛选的实验方案。该流程可全程用于从寡核苷酸阵列设计并扩增混合gRNA文库，将gRNA文库克隆至慢病毒载体，制备高滴度慢病毒，通过乳腺导管内递送将混合慢病毒文库导入成年小鼠乳腺，并回收gRNA，进而通过基于测序的方法解析文库中gRNA的代表性分布（图1）。
首先通过琼脂糖凝胶电泳评估混合gRNA文库的扩增和克隆是否成功。gRNA文库的PCR扩增产生清晰的条带，表明来自混合寡核苷酸芯片阵列的均一扩增（图2A）。对pXPR502 PPH-Cre和pLKO Cre载体骨架进行限制性酶切，可实现线性化骨架与填充片段的明显分离（图2B、C）。高效的酶切及骨架的纯净回收对于在克隆过程中最大限度减少背景连接并获得高文库复杂性至关重要。
使用CRISPR-KOALA...

本方案描述了一种可扩展的导管内CRISPR筛选方法，可实现并行 体内 小鼠乳腺中的基因敲除与激活研究

正向遗传学筛选通常以混合方式扰动数千个遗传元件，旨在实现大规模……

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

小鼠乳腺基因敲除与激活的平行 体内 筛查

本方法介绍了如何对小鼠乳腺组织进行解剖，并评估其发育情况和功能。通过整体封片法评估切除的乳腺组织的发育程度，同时采用基于催产素的肌上皮细胞收缩实验来评价泌乳功能。...

小鼠模型中乳腺发育与功能的评估

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。...

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

本文介绍了一种非侵入性地向小鼠乳腺导管递送水溶性试剂的实验方案。该方法通过将试剂局部注射至乳腺乳头，特异性地靶向乳腺导管。此技术可适用于多种化合物，包括siRNA、化疗药物和小分子化合物。...

乳腺导管内注射实现药物对小鼠乳腺的局部递送

通过腺病毒-Cre激活乳腺导管系统中的潜伏突变，可导致具有临床相关性的转移性乳腺癌。引入YFP启动子可实现对远端转移性肿瘤细胞的追踪。该模型可用于研究潜伏性转移、抗肿瘤免疫反应，以及设计治疗乳腺癌的新型免疫疗法。...

通过腺病毒-Cre靶向导管上皮启动转移性乳腺癌：一种新型的乳腺癌转基因小鼠模型

癌症是一种复杂的疾病，其发展受到肿瘤周围组织以及局部促炎和抗炎介质的影响。因此，与皮下注射模型相比，原位注射模型可能更适用于研究癌症进展，以更好地模拟人类疾病的病理过程。...

将乳腺癌细胞正位注射至小鼠乳腺脂肪垫以研究肿瘤生长

本文介绍了在早期小鼠全胚胎中检测β-半乳糖苷酶活性的标准实验方案，以及石蜡切片和复染的方法。该方法操作简便、快速，可用于监测发育过程中的基因表达，也可应用于组织切片、器官或培养细胞。...

通过检测完整小鼠胚胎中β-半乳糖苷酶活性示踪基因表达

本实验方案旨在介绍一种基于将表达Cre的腺病毒通过导管内注射至小鼠乳腺中来建立乳腺癌模型的新方法。该方法能够以时间可控的方式，在特定细胞类型和器官中特异性调控致癌事件。...

通过向小鼠乳腺导管内注射表达Cre的腺病毒建立乳腺癌模型

源自患者的异种移植（PDX）模型和可移植的基因工程小鼠模型能够真实地模拟人类疾病，是基础和转化性乳腺癌研究的首选模型。本文描述了一种将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫以研究肿瘤生物学特性并评估药物反应的方法。...

原位移植乳腺肿瘤作为乳腺癌的临床前模型

本方案描述了一种带有可更换盖板的新型乳腺成像窗（R.MIW）。植入R.MIW后，可通过活体显微镜对健康及病变乳腺组织在不同发育阶段进行长期、多日、细胞分辨率的成像观察。...

使用可更换盖板的乳腺成像窗进行纵向活体显微成像

本实验方案描述了一种利用激光扫描共聚焦显微镜和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的简便技术。...

活体乳腺组织亚细胞显微成像

本方案描述了病毒载体的导管内注射方法 通过...

体内 通过乳腺导管内注射将基因递送至小鼠乳腺上皮细胞

Mount Sinai Hospital.  该方案描述了一种可扩展的导管内CRISPR筛选方法，实现了小鼠乳腺体内的基因敲除和激活平行研究。

平行体内小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选

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平行 体内 小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选

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平行体内小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选