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本工作由土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）资助，项目编号为1003-216S461和1001-221S419。示意图由BioRender.com制作，并已获得出版许可（图1：LB29MV4E2Q，图2：JZ29CC68WD，图3：BV29CC72LB，图4：BN29CC6XFH）。作者声明仅使用ChatGPT（OpenAI）进行语法修改和英文语言润色，该工具未参与科学内容的生成。我们衷心感谢土耳其总统府战略与预算办公室资助的科驰大学转化医学研究中心（KUTTAM）所提供的服务与设施支持。

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作者声明无利益冲突。

基于CRISPR-Cas9的混合筛选方法已在不同的细胞环境中得到广泛应用。然而，在化疗耐药细胞中进行筛选仍面临独特挑战，需要进一步优化。由于化疗耐药细胞是研究化疗耐药肿瘤脆弱性的重要模型，因此有必要克服现有筛选策略中的局限性，以可靠地鉴定调控化疗耐药性的遗传或表观遗传因子。
建立化疗耐药细胞系本身可能较为繁琐，且高度依赖于所使用的化疗药物。尽管细胞可能迅速适应某些药物，但对其他药物仍可能极为敏感25。因此，在启动耐药细胞系建立方案之前，确定细胞系特异性的IC50值至关重要。若细胞在连续多代培养中无法耐受IC50浓度的药物暴露，则可考虑从较低药物浓度（例如IC10-20）开始（参见方案第1节）17。由于耐药性的获得属于随机事件，可同时处理多个孔/培养板的细胞，以提高获得耐药细胞的几率。必须对获得的耐药细胞群体进行全面表征，以便描述在剂量递增过程中相较于原始状态所发生的转录组和表型变化。可采用RNA-seq等全基因组分析方法，鉴定相对于亲本细胞系差异表达的基因。在功能层面，应通过细胞活力和增殖实验验证所获得的耐药性，以证明耐药细胞能够在对亲本细胞具有细胞毒性的药物处理条件下存活。此外，还应测量其增殖能力和生长速率相较于亲本细胞系的潜在变化，以计算各自的群体倍增水平（PDLs）。由于已知紫杉醇（Taxol）耐药性的获得至少部分由ABC转运蛋白介导的药物外排所驱动，因此应通过qPCR和Western blotting在mRNA和蛋白水平检测关键ABC转运蛋白（如ABCB1）的表达，并可结合转录组数据进行补充分析。根据ABC转运蛋白的表达谱，应评估是否存在多药耐药（MDR）表型，并检测其对其他化疗药物的耐药性。在我们之前的研究中，我们对紫杉醇耐药细胞系进行了表征，发现ABCB1是上调最显著的基因之一，并推断ABCB1介导的多药耐药可能导致嘌呤霉素筛选失败17。因此，在获得耐药细胞系后、进行任何转染操作之前，必须评估ABC转运蛋白的表达情况及MDR表型。
与高剂量药物暴露方案相比，剂量递增法具有优势，因为可以在每次增加药物剂量前将细胞冻存，从而提供操作灵活性并防止细胞培养物丢失。此外，逐步递增药物剂量可随时间推移获得耐药表型，实现适应性进化；而急性高剂量处理则仅能筛选出预先存在的耐药亚群。该方法的逐步推进特性使研究者能够主动选择期望的耐药水平，停止筛选并评估相应表型的特性。同时，剂量递增过程中的各个中间阶段可用于以时间序列方式研究获得性耐药的机制。根据具体的生物学问题，可获得不同水平的耐药性，以研究较低耐药水平下的早期适应机制，或在更高耐药细胞中研究稳定且完全建立的耐药表型。此外，临床相关的耐药阈值因药物、细胞系及固有增殖速率的不同而存在显著差异；因此，剂量递增的时间进程可能相应变化（在本研究中，获得紫杉醇耐药细胞约需6个月）。基于这一原理，我们在先前的研究中建立了SUM159PT细胞的两种不同耐药水平，并比较了它们各自独特及共有的特征17。因此，我们建议研究者应根据临床和生物学相关性，确定目标药物的IC50范围。
众所周知，撤除药物压力可能导致化学耐药性的丧失，因为细胞可能会重编程其表观基因组和转录组25因此，建议在数月内评估耐药表型的稳定性。若细胞在撤除药物后倾向于恢复为敏感状态，则可在维持剂量（通常相当于耐药诱导过程中最终使用的药物浓度）存在的情况下培养耐药细胞，以维持其耐药表型。然而 体外 耐药细胞系模型在研究获得性化疗耐药性方面具有实用性强、可重复性高和广泛应用的优点，但可能无法完全重现患者肿瘤中观察到的表型异质性，且缺乏肿瘤微环境、免疫相互作用以及空间异质性3,4,25此外，在耐药性产生过程中长期传代可能导致基因和表观遗传学改变，这些改变与患者样本中观察到的变化存在差异，从而可能限制所鉴定出的靶点的转化应用价值。因此，通过本方案鉴定出的候选基因和机制应在更具临床相关性的实验体系中进一步验证，例如共培养模型、患者来源类器官或 体内 研究。如果需要在这些模型上进行互补性筛选，而这些模型所能获得的细胞数量本身有限，EPIKOL 因其聚焦特性而具有优势。
耐药细胞的生长速度通常比其亲本细胞更慢，这在需要大量细胞群体以维持文库覆盖度的全基因组筛选中可能带来实际困难。与全基因组文库相比，EPIKOL等靶向文库具有优势，可在起始材料较少的情况下进行筛选，同时提高每个基因的sgRNA覆盖深度，从而在限定的目标范围内提升检测的灵敏度和可重复性。然而，EPIKOL的设计仅涵盖表观遗传介导的耐药机制，无法覆盖非表观遗传因素导致的耐药性。因此，文库的选择应基于前期实验结果和具体的生物学问题。使用者应充分了解靶向文库的局限性，并在文库覆盖范围内合理解读实验结果。
在耐药模型的CRISPR筛选中，一个主要障碍是ABC转运蛋白上调所驱动的多药耐药（MDR）表型的出现9,10。不同的ABC转运蛋白介导不同底物的外排。一旦建立了耐药细胞系，评估其耐药性是否扩展至其他化疗药物至关重要。嘌呤霉素耐药主要由ABCB1过表达引起，这会影响混合CRISPR筛选方法的筛选过程，因为大多数文库均携带嘌呤霉素筛选盒，用于富集转导细胞。在此，我们使用维拉帕米（verapamil）——一种第一代ABCB1抑制剂——以促进嘌呤霉素在细胞内的积累，并选择性清除未转导的耐药细胞，这些细胞若不加以处理，会因ABCB1介导的药物外排而逃逸筛选。由于维拉帕米可逆地结合ABCB1，因此在去除维拉帕米后数小时内ABCB1功能即可恢复。因此，在筛选的后续药物处理阶段，维拉帕米不会使耐药细胞产生额外的脆弱性。然而，维拉帕米的若干局限性也需引起重视。由于维拉帕米是钙通道及其他转运蛋白的抑制剂，其可能影响细胞生理功能，作用范围超出ABCB1抑制10。此外，有效维拉帕米浓度在不同细胞系和MDR模型之间存在差异，具体取决于ABCB1的表达水平及其他转运蛋白的活性。因此，应针对每种细胞系优化维拉帕米浓度；若存在脱靶效应的担忧，可考虑使用对ABCB1更具特异性的新一代ABCB1抑制剂。另一个关键步骤是，病毒滴定应直接在耐药细胞上进行，而非其亲本细胞，因为耐药细胞的感染效率和筛选能力通常与亲本细胞不同。
另一个重要的考虑因素是确定筛选的适当持续时间，因为耐药细胞的生长速度通常比其相应的亲本细胞更慢26。为考虑这一差异，我们采用群体倍增水平计算（方案第6部分）来评估对照组和处理组何时达到预期的PDL阈值。因此，筛选可能在不同的时间点终止，以实现可比的群体倍增数，从而更安全地解释处理组中sgRNA的作用效果。
文库制备 PCR 对于下游靶点鉴定的准确性至关重要。gDNA 起始量过低以及增加 PCR 循环次数可能引入偏差，导致某些 sgRNA 序列被过度扩增，从而引起假阳性的富集或耗竭。为减轻此类偏差，我们建议尽可能使用最大量的 gDNA，遵循本方案推荐的 PCR 循环数，并进行平行反应后合并再进行测序。在条件允许时，文库测序深度不应低于推荐阈值（&#62;300× 覆盖度），以确保能够可靠地检测到耗竭的 sgRNA，而非因测序深度不足导致低丰度 sgRNA 的随机丢失。）
测序完成后，我们采用MAGeCK分析框架，并进行了多项下游质控分析与数据解读步骤24。首先，使用主成分分析（PCA）评估生物学重复样本的分布情况与可重复性（数据未显示，MAGeCK输出结果）。在每组中，重复样本在PCA中应呈现聚类趋势；然而，药物处理组变异性较高是化学耐药筛选中的常见现象，因为药物可能诱导随机性变化。只要阳性和阴性对照在各组中表现符合预期，这种变异性不会阻碍真阳性靶点的识别。接下来，对初始和终末时间点的sgRNA计数进行每百万读段（RPM）标准化，以评估靶向必需基因的sgRNA是否如预期发生耗竭14。随后，采用中位数标准化方法汇总sgRNA水平的效应，从而识别基因水平的耗竭情况24。基因水平的耗竭评分通过瀑布图进行可视化展示，该图将基因按耗竭程度从最强到富集依次排序。长期药物暴露可能引起拷贝数变异和多倍体现象，进而通过Cas9切割效率异常或过度切割干扰筛选结果27。尽管EPIKOL靶向的染色质调控因子通常不受紫杉醇驱动的扩增影响，我们仍建议在筛选前评估耐药细胞的倍性状态和拷贝数变化。若怀疑存在拷贝数改变，可在MAGeCK分析过程中应用CRISPRcleanR或CERES等计算校正工具。
在包含两个实验组（对照组和处理组）的筛选实验中，需要进行不同的比较，以正确解读筛选效果和生物学依赖性17。初始时间点与最终时间点的比较适用于评估筛选性能，包括必需基因和非靶向对照的预期行为。将对照组（DMSO）的终点与初始时间点进行比较，可识别在无药物压力条件下对耐药细胞生长和适应性所必需的基因。相比之下，将两个终点样本（药物处理组[Taxol]与对照组[DMSO]）进行比较，可揭示对药物耐药性特异必需的基因，而非一般适应性所必需的基因。需要注意的是，直接比较两个终点样本会导致必需基因对照的分布出现偏倚，因为这些基因在两组中均对存活至关重要。另一种可视化方法是火山图，其同时展示log2倍数变化和显著性值，有助于识别显著耗竭的基因。在确定候选基因后，标准化的sgRNA计数和可视化图表有助于选择在下游验证实验中表现最佳的sgRNA。对于EPIKOL筛选，我们建议优先考虑至少有10个sgRNA中6个表现出一致行为的候选基因，因为这能更可靠地反映基因水平的效应。
本文提供了一种优化的EPIKOL筛选方案，用于对ABCB1表达上调并呈现多药耐药（MDR）表型的紫杉醇耐药细胞系进行筛选。该方案广泛适用于对嘌呤霉素或其他筛选抗生素具有交叉耐药性的任何化疗耐药模型，从而可在这些细胞中开展CRISPR筛选。针对整个方案各步骤中常见的技术难题，补充表1提供了实用的操作指导。

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种亚型，占所有乳腺癌病例的12%–17%1。其特征是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达缺失，这严重限制了靶向治疗的选择，使得传统化疗成为主要的治疗手段2。紫杉烷类和蒽环类药物常用于TNBC的治疗；然而，患者通常会产生耐药性2,3。化疗耐药性的获得是一个复杂且多维度的过程，涉及遗传、代谢、转录及表观遗传层面的适应性改变2,4。表观遗传改变已被认为是细胞可塑性的核心调控机制，可通过动态的转录重编程帮助癌细胞耐受化疗诱导的毒性作用5。
紫杉醇（paclitaxel）是紫杉烷类化合物的一种，通过干扰微管动力学并发挥抗有丝分裂作用，导致细胞死亡。6尽管三阴性乳腺癌患者最初对包含紫杉醇的化疗方案有反应，但通常会随着时间推移产生耐药性。2获得性紫杉醇耐药通常与ATP结合盒（ABC）转运蛋白的过表达相关，特别是ABCB1（MDR1，P-糖蛋白），其介导紫杉醇的药物外排，导致细胞内药物毒性降低7由于多种化疗药物均为这些ABC转运蛋白的底物，其表达上调会限制其他化疗药物的应用，从而导致多药耐药表型（MDR）。8ABC转运蛋白的抑制在临床环境中作为克服多药耐药性的策略已被证明大多不成功，主要原因是其广泛表达，并在转运多种内源性和外源性底物中发挥关键作用。9尽管维拉帕米（verapamil）作为一种第一代ABCB1抑制剂，在临床试验中显示出有限或无临床益处，并与显著的毒性相关10，它仍然是提高筛选效率的一种有价值的实验工具 体外 耐多药模型
多药耐药（MDR）表型是一种动态且具有适应性的过程，主要在应激条件下出现2。ABC转运蛋白的表达主要受转录和表观遗传调控机制控制，而非由突变事件驱动5,11。直接靶向ABC转运蛋白的局限性凸显了识别这些蛋白上游调控因子的重要性，这些调控因子可作为耐药细胞特有的脆弱环节。因此，系统性研究表观遗传因子已成为识别化疗耐药新调控因子以及开发靶向这些脆弱环节的联合治疗策略的重要途径。
基于 CRISPR-Cas9 的功能性基因敲除筛选技术可实现无偏倚、系统性的全基因组水平扰动，从而在基因组尺度上研究基因缺失在癌症中的影响12。然而，全基因组范围的 CRISPR 文库对每个基因的单导向 RNA（sgRNA）覆盖数量有限，与靶向文库相比会降低检测灵敏度13。重要的是，一次可靠的筛选不仅依赖于扰动的质量，还取决于合适的模型和优化的实验方案。在此背景下，研究药物耐药性等动态且复杂的过程时，采用定制化实验方案的靶向文库可能更具优势13。在先前的研究中，我们构建了一种以表观基因组为重点的 CRISPR-Cas9 基因敲除文库，用于靶向染色质调控因子14。与其他公开可用的表观基因组靶向 CRISPR 文库相比，表观基因组敲除文库（EPIKOL）包含 779 个基因，涵盖染色质识别蛋白、修饰酶、去修饰酶及相关蛋白，每个基因均设计了 10 条 sgRNA 进行靶向，从而提高了每个基因的筛选深度，增强了染色质相关功能性筛选的稳健性和可重复性14。EPIKOL 可提供两种载体系统：LentiGuide 系统（其中 Cas9 由不同的载体表达）和 LentiCRISPR 系统（包含 Cas9 表达元件），可根据不同细胞系灵活选择。相较于全基因组文库，EPIKOL 更容易实现足够的文库覆盖度（定义为每条 sgRNA 对应的平均细胞数，例如 500×–1000×），在研究生长缓慢的化疗耐药细胞系时具有明显优势。
尽管CRISPR筛选为研究化疗耐药机制提供了强有力的手段，但标准的混合筛选流程并未针对具有活跃药物外排功能的耐药细胞进行优化。嘌呤霉素（puromycin）是慢病毒CRISPR系统中常用的筛选抗生素，可被ABC转运蛋白（主要是ABCB1）从耐药细胞中泵出，从而阻碍转导细胞的有效筛选15,16。这一局限性可能导致细胞群体异质性增加，背景噪声升高，最终影响数据质量。为应对这一挑战，我们通过使用维拉帕米（verapamil）短暂抑制ABC介导的药物外排，优化了嘌呤霉素筛选步骤，从而实现了对sgRNA感染细胞的有效富集。利用该策略，我们鉴定出含溴结构域和PHD指结构域蛋白1（Bromodomain and PHD Finger Containing 1, BRPF1）是三阴性乳腺癌（TNBC）中ABCB1表达和紫杉醇（Taxol）耐药性的调控因子17。无论是通过遗传手段还是药物方式抑制BRPF1，均可恢复耐药细胞对紫杉醇的敏感性，证明了该优化方案在识别化疗耐药中可干预靶点方面的实用性17。
在此，我们概述了在化疗耐药模型上进行负向筛选CRISPR筛选的关键步骤，重点聚焦于大多数化疗耐药或CRISPR筛选方案中常被忽视的技术难点。该方案首先展示了一种逐步剂量递增的方法以建立化疗耐药细胞，随后优化了病毒递送和筛选条件，以克服ABC转运蛋白介导的药物外排作用。上述优化措施共同确保在CRISPR筛选过程中高效富集sgRNA阳性细胞，同时有效清除未转导细胞，从而提供 一种针对化疗耐药性三阴性乳腺癌细胞的高效转导与筛选策略。最后，该方案重点介绍了通过下一代测序和生物信息学分析鉴定CRISPR筛选阳性结果的基本步骤。&#160; 综上所述，本方案可有效实施EPIKOL筛选平台，以鉴定克服耐药性的潜在治疗靶点17,18,19.

<table><tbody><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>45 &amp;micro;m 滤膜&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLHVM33RS</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>96 孔黑色透明底板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS356259</td><td>用于 CellTiter-Glo 发光细胞活力检测</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td>用于筛选</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒</td><td>CellTiter-Glo, Promega</td><td>G7570</td><td>用于 CellTiter-Glo 发光细胞活力检测</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672,0050</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F12 营养混合物</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td></td><td></td><td>由 Robert Weinberg（MIT，波士顿，美国）惠赠。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001-1G</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>LentiCas9-blast</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>#52962</td><td>用于构建 Cas9 稳定细胞系</td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>#52963</td><td>gRNA 克隆载体骨架&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MN NucleoSpin 组织试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>用于基因组 DNA 提取</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>pLentiCRISPR v2&amp;nbsp;</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>#52961</td><td>gRNA 克隆载体骨架&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚乙二醇 (PEG)-8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139-500G</td><td>用于慢病毒浓缩</td></tr><tr><td>线性聚乙烯亚胺 (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090-1G</td><td>用于慢病毒生产</td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白 (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380-25G</td><td>用于慢病毒感染</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td># 12260</td><td>用于慢病毒生产</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td>用于筛选</td></tr><tr><td>SUM159PT 贴壁细胞</td><td></td><td></td><td>由 Robert Weinberg（MIT，波士顿，美国）惠赠。</td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>Paclitaxel, Sigma</td><td>PHR1803-200MG</td><td>用于耐药细胞的生成与维持</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>25300054</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>维拉帕米</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S4202</td><td>用于筛选</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td># 8454</td><td>用于慢病毒生产</td></tr></tbody></table>

基于crispr-cas9的耐药细胞全表观基因组敲除筛选

Epigenome-Wide CRISPR-Cas9-Based Knockout Screens on Chemoresistant Cells

化疗耐药性仍是癌症治疗中的主要挑战，其成因在于癌细胞能够获得适应性特征、重构信号通路以及改变染色质结构，从而逃避药物诱导的细胞毒性。由于这些过程高度依赖于调控染色质组织和转录可塑性的表观遗传机制，表观遗传调控因子已被认为是化疗耐药性的关键贡献者。为了研究紫杉醇（paclitaxel）耐药性——紫杉醇是三阴性乳腺癌（TNBC）中最常用的化疗药物之一——我们采用了一种以表观基因组为重点的基因敲除文库（EPIKOL），该文库基于CRISPR-Cas9技术构建，旨在系统性地破坏参与染色质调控的基因。通过逐步递增药物剂量的方案，我们建立了具有临床相关药物适应特征的化疗耐药细胞系。然而，这些耐药细胞表现出多药耐药（MDR）表型，给高效病毒转导和稳定细胞群体的筛选带来了显著挑战。在本研究中，我们描述了实现高效慢病毒转导和筛选的关键方法学步骤，从而成功地在化疗耐药的TNBC模型中应用EPIKOL CRISPR筛选。根据所述方案，我们在化疗耐药的TNBC细胞中开展了全表观基因组范围的CRISPR筛选，并鉴定出新的调控化疗耐药性的表观遗传因子。该方案为利用基于CRISPR的功能缺失策略鉴定获得性紫杉醇耐药相关的表观遗传调控因子提供了可靠的框架。

为研究三阴性乳腺癌（TNBC）中化疗耐药的表观遗传调控因子，使用SUM159PT细胞系的整体实验流程如图所示 图1首先，IC10 和 IC50 通过用浓度递增的紫杉醇处理SUM159PT细胞，测定紫杉醇在该细胞中的数值 (图 2A采用逐步剂量递增法诱导SUM159PT细胞产生紫杉醇耐药性。经过数月培养后，与平行传代但未暴露于紫杉醇的对照细胞相比，IC50值的显著偏移表明该方案成功建立了耐药表型。图2B).
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71175/71175fig1.jpg" /> 
图1：在紫杉醇耐药的SUM159PT细胞中进行EPIKOL筛选的示意图。在构建的紫杉醇耐药SUM159PT细胞中进行EPIKOL筛选的整体工作流程。该图由BioRender.com制作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/71175fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
在获得耐药细胞后，进行了多项实验以表征其表型和分子水平的变化。通过克隆形成实验，比较耐药细胞与亲本细胞在紫杉醇处理下的增殖能力。如图2C、D所示，耐药细胞在紫杉醇处理下仍能维持其增殖能力，而亲本细胞则无法存活。该实验是耐药细胞表征中的关键步骤之一，展示了如何评估亲本细胞与耐药细胞在药物处理条件下的增殖能力差异。
作为耐药细胞表征的一部分，对亲本细胞和耐药细胞进行了RNA测序，以分析与化疗耐药相关的转录组变化（图2E）。在耐药细胞中表达上调最显著的基因为ABCB1，其次为其他几个ABC转运蛋白基因，包括ABCB4和ABCA5。通过定量聚合酶链式反应（qPCR）验证了ABCB1表达的上调，这展示了如何利用qPCR验证候选基因的表达变化（图2F）。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71175/71175fig2.jpg" /> 
图2：耐药细胞的生成及其表征。（A）示意图展示采用剂量递增法生成紫杉醇耐药SUM159PT细胞的过程。（B）剂量反应曲线显示亲本细胞与所获耐药细胞IC50值的差异。亲本细胞IC50 = 6 nM，紫杉醇耐药细胞IC50 = 355.4 nM。（C）在紫杉醇存在条件下进行的克隆形成实验。（D）（C）中克隆面积的定量分析。采用Prism 8（GraphPad Software）进行双因素方差分析（ANOVA）并结合Tukey事后检验。显著性水平定义为 *P &#60; 0.05，**P &#60; 0.01，***P &#60; 0.001。（E）火山图显示与亲本细胞相比，紫杉醇耐药细胞中差异表达基因，筛选条件为LFC&#62;2且p&#60;0.001。（F）qPCR验证亲本细胞与紫杉醇耐药细胞中ABCB1 mRNA的表达水平。P值通过双尾Student t检验与对照组比较确定；**P &#60; 0.01。图A由BioRender.com制作。图E已根据Yedier-Bayram等人的研究修改，经许可使用17。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/71175fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在证实紫杉醇耐药细胞中ABCB1及其他ABC转运蛋白的过表达，并考虑到ABCB1广泛的底物谱后，进一步评估了多药耐药（MDR）表型的存在。为此，用多种已知为ABCB1转运蛋白底物且作用机制不同的药物处理紫杉醇耐药细胞，并评估其药物敏感性（图3A，B). 与观察到的ABC转运蛋白表达谱一致，紫杉醇耐药细胞也对多柔比星和长春新碱表现出耐药性，证实了多药耐药（MDR）表型的存在，并说明了如何对多药耐药表型进行功能性评估。
多药耐药表型 对于需要嘌呤霉素筛选以富集转导细胞的CRISPR筛选方法EPIKOL而言，这是一个挑战，因为嘌呤霉素可通过ABCB1介导的药物外排泵从细胞中排出，导致在耐药细胞中嘌呤霉素筛选效率降低图3C因此，未转导的细胞可能在筛选中存活，从而干扰筛选结果。
为解决这一局限性，在进行EPIKOL筛选之前，优化了具有多药耐药（MDR）表型的化疗耐药细胞的筛选流程。使用第一代ABCB1抑制剂维拉帕米（verapamil）阻断ABCB1转运蛋白介导的药物外排，从而促进化疗药物或嘌呤霉素在细胞内的积累（图3D）。维拉帕米单独使用时对细胞活力无影响，但与化疗药物联用时可恢复细胞对药物的敏感性（图3E、F）。类似地，将嘌呤霉素杀灭曲线与非毒性剂量的维拉帕米联合使用表明，抑制ABCB1可恢复细胞对嘌呤霉素的敏感性（图3G、H）。这一策略确保了在筛选中存活的细胞是成功转导的细胞，而非因ABCB1介导的药物外排而逃避筛选的细胞。在化疗耐药细胞中建立高效的筛选流程，对于获得可靠的EPIKOL筛选结果至关重要。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71175/71175fig3.jpg" /> 
图3：多药耐药表型及维拉帕米对耐药细胞的作用。 剂量反应曲线显示亲本细胞与诱导获得耐药性的细胞在（A）阿霉素、（B）长春新碱、（C）嘌呤霉素处理下的IC50值差异。（D）示意图展示在有或无维拉帕米存在下筛选紫杉醇耐药的SUM159PT细胞的过程。该图由BioRender.com制作。（E）采用紫杉醇耐药细胞（Taxol-Res）进行细胞活力检测，以确定维拉帕米与紫杉醇联用时的最佳浓度。（F）维拉帕米使紫杉醇耐药细胞重新对紫杉醇敏感。（G）维拉帕米不影响亲本细胞对嘌呤霉素的反应。（H）维拉帕米恢复紫杉醇耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性。图A、B和F已获Yedier-Bayram等17许可重复使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/71175fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
为了在三阴性乳腺癌（TNBC）中发现化疗耐药的新调控因子，使用紫杉醇耐药的SUM159PT细胞进行了EPIKOL筛选，如图4A所示。由于耐药细胞的生长速度慢于亲本细胞17，在整个筛选过程中持续监测了紫杉醇处理组和DMSO处理组的群体倍增水平，以确定达到16次群体倍增所需的时间（图4B）。因此，DMSO处理组的EPIKOL筛选在约第35天完成，而紫杉醇处理组则需额外培养15天才能达到相同的群体倍增水平。
测序完成后，采用 MAGeCK 分析流程整合靶向同一基因的 sgRNA 的效应，以揭示基因水平在敲除后的变化24EPIKOL文库包含靶向必需基因的sgRNA作为阳性对照，第一步质量控制是评估这些sgRNA是否如预期发生耗竭。瀑布图展示了不同比较条件下必需基因的Log2倍数变化图 4C–E). 当将DMSO或紫杉醇处理条件下的最终时间点样本与初始时间点进行比较时，几乎所有必需基因在敲除后均出现耗竭，表明筛选效果良好（图4C，D）。然而，正如预期的那样，在相互比较两个终点样本（DMSO处理和紫杉醇处理）时，并未明显观察到这种耗竭现象，因为必需基因在这两种条件下均对细胞存活至关重要（图4E).
另一种展示筛选结果的可视化方式是火山图，该图同时显示Log2倍数变化和统计显著性（p值或FDR值）。在紫杉醇耐药细胞中进行的EPIKOL筛选中，多个阳性对照基因被鉴定为显著耗竭，这进一步支持了筛选结果的可靠性，因为靶向阳性对照基因的sgRNA出现耗竭是成功筛选的典型质量控制指标（图4F）。除了必需基因对照外，EPIKOL文库还包含针对多个ABC转运蛋白基因的特定情境阳性对照sgRNA。正如预期，不同组中ABCB1 sgRNA的标准化计数显示，仅在紫杉醇处理组中，靶向ABCB1的sgRNA出现显著耗竭（图4G）。总体而言，这展示了如何通过分析sgRNA水平的变化来识别与药物反应相关的候选基因。
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71175/71175fig4.jpg" /> 
图4EPIKOL 筛选在紫杉醇耐药细胞中的结果及示例图表 (AEPIKOL 筛选实验流程示意图。B) 紫杉醇耐药细胞的群体倍增水平（PDL）。C–E瀑布图显示EPIKOL筛选在Taxol-Res细胞中的结果，突出显示必需基因：C图中DMSO处理组与初始时间点比较，D图中紫杉醇处理组与初始时间点比较，紫杉醇处理组与DMSO处理组比较 图 E。F火山图显示经紫杉醇处理的样本与初始时间点相比的基因Log2FoldChange。具有p值的基因&#60;0.05 的部分被着色并标注。此图改编自先前发表的文献17. (G) 来自 EPIKOL 的 10 个不同 ABCB1 sgRNA 图表的每百万读段数（rpm）计数。图 A 使用 BioRender.com 制作。图 E 已获 Yedier-Bayram 等人许可重复使用。17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/71175fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充表 1：故障排除表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/Supplementary Table 1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：病毒滴度与 MOI 计算。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/Supplementary Table 2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表3：EPIKOL文库的sgRNA列表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/Supplementary Table 3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 4：EPIKOL 测序文库构建中使用的引物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/Supplementary Table 4.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种通过剂量递增法诱导产生耐化疗细胞的实验方案，随后利用靶向表观遗传修饰因子的特异性sgRNA文库进行CRISPR/Cas9筛选，以鉴定获得性化疗耐药的调控因子。该方案还提供了多个针对耐化疗细胞模型的优化步骤，为研究耐药机制的科研人员提供了可靠的实验框架。

基于CRISPR-Cas9的耐药细胞全表观基因组敲除筛选

化疗耐药性仍是癌症治疗中的主要挑战，其产生源于癌细胞获得适应性特征、重构……

我们利用基于CRISPR的筛选方法研究三阴性乳腺癌中驱动化疗耐药的表观遗传机制。首先，将约159 PT贴壁细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种于96孔黑底透明底板中，培养基为添加了所示组分的Ham's F-12营养混合物。将细胞置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育16小时。接下来，用二甲基亚砜（DMSO）配制紫杉醇储备液。处理细胞时，用培养基对紫杉醇进行系列稀释，浓度范围为 0.3 纳摩尔至 10 微摩尔，并以单独 DMSO 作为溶剂对照。每组实验设三个重复，分别加入 200 微升不同浓度的紫杉醇处理细胞。将培养板置于细胞培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育72小时。药物处理72小时后，采用基于荧光素酶的ATP定量检测法评估细胞活力。使用酶标仪测定荧光信号，并将结果归一化至DMSO对照组的数值。接下来，使用合适的统计软件，通过四参数逻辑剂量反应模型的非线性回归计算10%和50%抑制浓度值。为开始生成化疗耐药细胞，将每孔2 × 10⁵个159 PT细胞接种于6孔板中，并在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。第二天，用含有紫杉醇的培养基以10%或50%抑制浓度处理细胞，每孔2毫升，处理72小时。如果细胞能够耐受当前药物浓度，则将细胞分至两个孔中。一孔作为备用对照，更换新鲜培养基；另一孔中紫杉醇浓度加倍。在诱导耐药细胞的过程中，将亲本细胞传代培养于含DMSO的培养基中作为对照，并调整DMSO体积，使其与相应紫杉醇处理组中的DMSO含量一致。每三至四周检测一次细胞活力，直至亲本细胞系与耐药细胞系的半数抑制浓度（IC50）值出现显著差异。将稳定耐药细胞维持在剂量递增过程中使用的最终紫杉醇浓度中培养。为表征耐药细胞，需在药物存在条件下进行RNA测序、蛋白质印迹、定量PCR及细胞活力检测。将约159个PT紫杉醇耐药细胞及其亲本细胞以每孔2 × 10³个细胞的密度，每组设三个复孔，接种至96孔黑色透明底板中。于37°C、5% CO₂条件下培养过夜。用维拉帕米对细胞进行两倍系列稀释处理，浓度范围从80 µM到1.25 µM，同时在所有处理条件下保持紫杉醇浓度恒定。处理72小时后，采用基于荧光素酶的ATP定量检测法评估细胞活力。确定在维持细胞活力的同时，能够恢复耐药细胞敏感性的维拉帕米浓度。为了确定与维拉帕米联合使用的嘌呤霉素浓度，将一些159 PT紫杉醇耐药细胞以每孔2 × 10³个细胞的密度接种至96孔板中。将培养板在37°C和5%二氧化碳条件下孵育16小时。在含有先前确定的维拉帕米浓度的培养基中，制备嘌呤霉素的两倍系列稀释液，浓度范围为40至0.625 µg/mL。用相应浓度的嘌呤霉素稀释液处理细胞72小时。活力检测后，确定在维拉帕米存在条件下使细胞活力降至5%或更低的最低嘌呤霉素浓度。随后利用约159个PT紫杉醇耐药细胞计算病毒滴度和感染复数。根据所需的感染复数，将计算好的Cas9慢病毒体积直接加入含有8微克/毫升鱼精蛋白硫酸盐的培养基中。感染后16小时，更换为新鲜培养基。次日，通过更换为含有先前确定浓度杀稻瘟菌素的培养基进行杀稻瘟菌素筛选。继续筛选直至未感染的细胞被完全清除。使用针对必需基因的对照单导向RNA验证Cas9活性，或利用GFP作为报告基因以评估基因敲除效率。根据所提供的公式计算为达到目标文库覆盖度所需的成功感染细胞数量。为每个生物学重复制备独立的感染混合物。接种预先计算好的细胞后，用含有8微克/毫升鱼精蛋白硫酸盐的8毫升完全培养基，加入确定体积的病毒进行感染。16小时后，将病毒培养基更换为新鲜培养基，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。在之前确定的浓度下，使用含维拉帕米的嘌呤霉素筛选，以富集sgRNA感染的159 PT紫杉醇耐药细胞。持续筛选直至未感染的对照孔中所有细胞均被清除，通常需要约三天时间。完成嘌呤霉素和维拉帕米筛选后，用胰蛋白酶消化细胞，并从每个生物学重复样本中收集初始时间点（即零时）的细胞沉淀，其数量应与转导时确定的覆盖度水平相对应。在保持覆盖度的前提下，将细胞分入不同的实验组，其中一组以DMSO作为对照组。另一组用紫杉醇处理。将细胞培养物维持14至16次群体倍增。使用指定公式计算群体倍增水平。每次传代时监测细胞活力和生长动力学。保持足够的细胞数量以避免瓶颈效应。当达到目标群体倍增水平时，收集每种重复和条件下的最终时间点细胞沉淀，同时确保每个沉淀样本中的文库覆盖度。将沉淀物于 -80 摄氏度保存，直至进行后续基因组 DNA 提取。尽管经过紫杉醇处理，耐药细胞仍持续增殖，而亲本细胞在相同处理条件下无法存活。RNA 测序鉴定出 ABCB1 是耐药细胞中上调最显著的基因之一，其他 ABC 转运蛋白如 ABCB4 和 ABCA5 也出现上调。通过定量PCR验证了耐药细胞中ABCB1表达的上调。紫杉醇耐药细胞表现出多药耐药表型，并对阿霉素和长春新碱具有耐药性。由于嘌呤霉素可通过ABCB1介导的药物外排作用被泵出，因此嘌呤霉素筛选在耐药细胞中可能效率较低。维拉帕米单独使用对细胞活力无影响。然而，当与化疗药物联用时，维拉帕米可恢复细胞对这些药物的敏感性。在紫杉醇耐药细胞中，非毒性剂量的维拉帕米亦能恢复其对嘌呤霉素的敏感性。将DMSO或紫杉醇处理组的最终时间点样本与初始时间点样本进行比较时，几乎所有必需基因在敲除后均出现耗竭，证实了筛选结果的可靠性。相比之下，DMSO处理组与紫杉醇处理组的终点样本比较并未显示必需基因的耗竭，因为这些基因在两组中均保持必需性。相反，该比较揭示了使细胞对紫杉醇敏感的表观遗传调控因子。在紫杉醇耐药细胞中进行的EPIKOL筛选发现，多个阳性对照基因和表观遗传调控因子显著耗竭。靶向ABCB1的单导向RNA在紫杉醇处理组中特异性耗竭，证实ABCB1是该筛选中紫杉醇敏感性的阳性对照。本方案使研究人员能够利用CRISPR筛选平台在癌症模型中研究治疗耐药性，并鉴定化疗耐药相关的表观遗传调控因子。筛选耐化学药物细胞时，最重要的考虑因素是保持文库的代表性，并优化转导和筛选条件。未来的研究将确定多药耐药癌细胞的治疗弱点，并开发新型联合疗法以克服化学耐药性。

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