玉米减数分裂细胞中的三维免疫定位

我们的研究致力于开发一种三维方法，用于研究玉米雄性花粉母细胞，并在单细胞水平上可视化减数分裂蛋白。除了玉米之外，该方案还可应用于水稻、黑麦、大麦和小麦的花粉母细胞研究。实验开始时，获取处于V13阶段的玉米植株，其花序仍处于茎内生长阶段。

在进行小孢子母细胞减数分裂期花药固定的这一周，戴上手套轻轻按压茎部膨大处的突起，检查其是否已足够柔软以便切开。在配制好所需缓冲液后，准备一个湿润室：将5到10张湿润的纸巾放入塑料盒内，去除湿润室中多余的水分。

使用剃刀刀片在花序位置切开茎秆，以暴露雄穗分枝和侧生分枝。解剖并采集侧生分枝后，将其包裹在湿润的培养皿毛巾中，并将培养皿置于室温下。利用体视显微镜，将小花中的新鲜花药收集至含有2毫升1×缓冲液A或BA的35毫米培养皿中。根据大小和颜色鉴定减数分裂时期。

将花药转移至新的35毫米培养皿后，向花药中加入3毫升固定液。用封口膜密封培养皿，防止甲醛挥发。将35毫米培养皿置于放置在旋转摇床中的较大培养皿上，在室温下以40至60转/分钟的速度振荡45分钟。

用3毫升1 XBA冲洗花药。将花药转移至一个小的培养皿后，密封培养皿，并在室温下以40至60 RPM的速度置于旋转摇床上振荡45分钟。使用洁净的镊子将花药转移至含有3毫升1 XBA的小型35毫米培养皿中。

用封口膜将培养皿密封后，将小培养皿放入一个较大的培养皿中。用铝箔包裹后，于4°C保存至使用。第一天，通过等体积混合丙烯酰胺和2 XBA，配制2毫升丙烯酰胺溶液。

在加入亚硫酸钠和过硫酸铵之前，将丙烯酰胺溶液在真空下脱气 5 到 10 分钟。根据所准备载玻片的数量，将 100 微升丙烯酰胺与 2 XBA 1:1 混合液分装至 1.5 毫升离心管中。将 2 厘米 × 2 厘米的帕拉膜片置于培养皿上方，并将其放置在解剖体视显微镜下。

用剪刀修剪移液枪头后，将50微升含花药的BA溶液移取到Parafilm上。再将25微升BA溶液移取到Parafilm的另一区域。用镊子夹住花药后，使用解剖刀切去其顶端。

一旦将小孢子母细胞挤出，使用移液器将其转移至25微升BA液滴中，并轻轻混匀。取10微升小孢子母细胞混合液滴加到另一张盖玻片上。迅速将5微升亚硫酸钠和5微升过硫酸铵加入含有丙烯酰胺和两份XBA的1.5毫升离心管中。

吸取5 µL该混合液滴加到盖玻片上，并与花粉母细胞混合。以45度角将一片多聚赖氨酸包被的盖玻片覆盖在上方。室温下静置30至50分钟，使其充分聚合后，用刀片小心地将盖玻片分开。

然后将它们垫面朝上放入培养皿中。用1毫升含有1毫摩尔乙二胺四乙酸（EDTA）和1% Triton的1×PBS溶液在室温下冲洗盖玻片2小时。选择来自不同宿主物种的一抗并进行配制和混合，以确保检测时信号相互区分。

向含有垫片的盖玻片中央加入 50 微升稀释的一抗溶液。然后将培养皿放入湿盒中，4°C 孵育过夜。第二天，配制 500 毫升洗涤缓冲液，其中包含 1×PBS、0.1% Tween 20 和 1 毫摩尔 EDTA。

使用移液器移除过夜溶液。用一毫升洗涤缓冲液将盖玻片洗涤两次。移除缓冲液后，再次加入一毫升洗涤缓冲液，并在室温下孵育一小时。

重复此洗涤步骤七次。最后一次洗涤后，盖上培养皿，置于湿盒中过夜。用封闭缓冲液将二抗按1:50的比例稀释，进行配制。

吸去洗涤液后，向每块垫片中央加入50 µL稀释后的二抗。然后将培养皿置于湿盒中，室温孵育2小时。吸去孔中溶液后，用1 mL洗涤缓冲液在室温下洗涤4次，每次1小时。

用一毫升 PBS 清洗孔板，每次 10 分钟，重复此过程两次。向孔板中加入 500 微升 DAPI（配制为终浓度 1 微克/毫升），室温孵育 30 分钟。将长期保存在 4 摄氏度的金颗粒取出后，使其解冻至室温。

用一毫升 PBS 清洗载玻片 30 分钟，重复两次。除去最后一次清洗液后，在垫片中央加入两滴长效抗荧光淬灭剂。将盖玻片从孔中取出后，将其封固在已标记的载玻片上。

使用真空装置从盖玻片边缘去除多余的甘油，并用两层指甲油封片。在显微镜下选择适当的激发波长和滤光片观察样品并采集图像。DAPI染色显示出清晰的细胞核以及染色质，同时可见质体和线粒体DNA较弱的天然细胞质染色。

在前细线期，染色体上和细胞质中均无减数分裂第一分裂缺失蛋白1（Absence of first division one，AFD1）、无联会蛋白1（asynaptic one，ASY1）以及联会复合体中央元件蛋白Zipper1（Zipper1，ZYP1）的定位信号。在后续阶段，信号逐渐集中于染色体上，而在完全联会之前，仍有大量ZYP1保留在细胞质中。减数分裂黏连蛋白AFD1仅在偶线期之后才形成线性结构。

伴随着联会复合体线性纤维的形成，当ZYP1和AFD1被加载到线性结构中后，ASY1信号变得相对较弱。该方案使研究人员能够研究蛋白质的共定位与动态变化、天然亚细胞定位、染色体三维结构、减数分裂进程以及分裂时期的判定。

本方案的主要挑战在于谨慎选择相容的一抗和二抗组合。后续研究可通过比较雄性和雌性减数分裂，进一步探究无合线现象背后的分子机制。