Name: 在基于微珠的肌动蛋白彗尾运动性实验中重建肌球蛋白-I介导的分支肌动蛋白组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学习基于微珠的肌动蛋白彗尾运动性实验方法，用于在膜样界面重建肌球蛋白-I介导的分支肌动蛋白组装过程。该技术可定量分析肌动蛋白网络组装、密度及珠子运动性，为研究细胞骨架动力学提供可重复的体外平台。

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我们感谢 Daniel Safer 博士和 Rick Wike 在蛋白质纯化过程中提供的出色技术支持。我们感谢 Roberto Dominguez 博士，特别是 Malgorzata Boczkowska 博士和 Grzegorz Rebowski 博士，慷慨提供了 Arp2/3 复合物和 CapZ 蛋白。我们还感谢 Luther Pollard 博士、Faviolla A. Báez-Cruz 博士以及 Ostap 和 Dominguez 实验室的全体成员在本项目全过程中的宝贵意见。本研究得到了美国国立卫生研究院资助 R37 GM057247（资助 E.M.O.）的支持。E.M.O. 和 M.X. 的部分工作由美国国家科学基金会（CMMI-1548571）资助。在稿件修改过程中，使用了 ChatGPT 辅助语言润色。作者对所有人工智能辅助生成的内容进行了审阅和修改，并对最终稿件承担全部责任。

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作者声明不存在任何竞争性财务利益或利益冲突。

肌动蛋白彗尾珠运动实验是一种成熟可靠的 体外 用于研究Arp2/3复合物介导的分支状肌动蛋白组装及其在产生 protrusive 力中作用的重建系统14,15,16,17该系统已广泛应用于解析支化肌动蛋白组装的生化调控机制。14,15,26,27,31,49,50,51 以及力的产生20,21,22,23,52同时为定量研究肌动蛋白网络的涌现活性物质特性提供了一个框架19,35,36,53通过加入肌球蛋白，特别是肌球蛋白-I18，将这种改造后的检测方法引入该重建系统，可研究肌球蛋白-肌动蛋白偶联如何调节膜界面处的肌动蛋白组装和力的产生，这一领域目前仍相对缺乏深入探索。值得注意的是，在该系统中可便捷地将肌球蛋白-I 替换为其他肌球蛋白马达，以考察它们在肌动蛋白网络重塑和力生成中的各自作用。例如，肌球蛋白V（货物运输）54肌球蛋白VI（胞吞运输和膜动力学）55,56肌球蛋白VII和XV（静纤毛和微绒毛的排列）57,58,59肌球蛋白X（丝状伪足形成）60,61，以及肌球蛋白XIX（线粒体动力学）62 可被用于研究不同类型的肌球蛋白在肌动蛋白组织及其相关生理过程中的作用。
只要严格控制若干关键参数，该检测具有高度可重复性。首先，高质量的单体G-actin对于形成强健的彗尾结构至关重要。我们建议使用已建立的方案41从兔骨骼肌丙酮粉中纯化G-actin。经过2–3天透析后，应使用Sephacryl S-300凝胶过滤柱在G缓冲液（2 mM Tris-HCl，pH 8.0；0.2 mM ATP；0.1 mM CaCl2；1 mM NaN3；和0.5 mM DTT）中进一步纯化单体肌动蛋白。应使用洗脱峰后立即收集的组分。纯化的G-actin在4°C冰上保存时通常可维持2–3周较强的聚合活性，第四周仍可能可用，但性能通常会逐渐下降。彗尾结构减弱，表现为肌动蛋白网络稀疏、脆弱以及尾部生长不一致，常提示肌动蛋白质量下降。第二，成核促进因子（NPF）的活性是决定彗尾形成的关键因素。商用的人源神经元Wiskott–Aldrich综合征蛋白（N-WASP）的GST标签WCA结构域（GST-VCA）可提供强健且持续的成核活性，而GST二聚化可进一步增强该活性63。我们建议在包被微珠前，使用吡啶-肌动蛋白聚合实验验证任何NPF构建体的活性，商用GST-VCA的活性可作为参考标准。值得注意的是，本实验中使用的商用GST-VCA缺少多聚脯氨酸区域，因此不与profilin–actin复合物相互作用26。第三，彗尾生长的可靠观察依赖于载玻片和盖玻片的精细制备。我们建议在使用前用清水和乙醇彻底清洗载玻片和盖玻片，并在使用前立即进行等离子清洗。若条件允许，优先使用聚乙二醇-硅烷化处理的盖玻片26，因其可最大限度减少非特异性蛋白吸附，提高实验重复性。在运动反应混合液中加入足够浓度的BSA可进一步减少非特异性表面相互作用，促进实验结果的一致性。第四，加入反应腔的样品体积对获得可靠测量结果至关重要15,16,17。样品体积过大将导致微珠漂移，从而无法准确追踪彗尾的延伸过程；而体积不足则会使微珠被挤压在载玻片与盖玻片之间，增加摩擦力并导致微珠固定不动。这种机械约束可能扭曲彗尾形态，并改变测得的生长动力学参数。因此，优化反应腔高度和样品体积对获得可重复的结果至关重要。我们建议针对每种实验装置通过实验经验优化样品体积。当使用本文所述的22 mm × 22 mm盖玻片时，加入2.1–2.3 µL运动反应混合液可形成约4.3 µm的腔体高度，使直径为2.0 µm的微珠稳定定位，既无明显漂移，也无过度压缩。&#160;若使用不同尺寸的盖玻片，应相应调整样品体积，以实现反应腔均匀填充、微珠稳定定位以及最小化的样品漂移。
如果彗星尾结构未能形成，需验证肌动蛋白聚合能力及成核促进因子（NPF）活性。若未发生对称性破缺，应调整加帽蛋白（CP）浓度以调节网络密度。网络过于致密时难以断裂，而过于稀疏则缺乏结构完整性。若肌球蛋白包被的微珠与对照微珠无差异，需确认肌球蛋白的表面密度及其马达活性。质量控制的接受标准为功能性判断，而非基于绝对数值阈值。只要新制备样品能够重现先前已验证样品所观察到的彗星尾形成与生长现象（如&#160;图3所示），即视为可接受。&#160;此外，在使用前应对每批新制备的肌球蛋白、Arp2/3复合物、NPF、CapZ或肌动蛋白，采用相应的质量控制检测方法进行评估，并与先前已验证的样品进行比较，以确保定量实验之间的一致性（参见方案部分3.1）。
解释本实验结果时，应考虑其若干局限性。首先，荧光强度作为肌动蛋白网络密度的相对、未经校准的替代指标，因此仅可在相同成像采集条件下获取的样本之间，以及采用相同阈值分析流程处理的结果之间进行比较。其次，微珠运动性、彗尾结构生长及生长效率反映的是产生力的网络行为的间接读数，而非对力的直接测量；要量化网络产生的力，需借助光镊或经力校准的膜形变实验等直接力学测量方法64,65。第三，本实验无法直接解析肌动蛋白网络的超微结构，例如纤维取向、分支密度或局部肌球蛋白的组织排列&#160;。对于纳米尺度结构的&#160;表征，可能需要电子显微镜或超分辨率成像等互补技术。最后，使用刚性微米级微珠提供了一个简化的、实验上易于操作的界面，但未能模拟细胞膜的可变形性、曲率异质性、脂质流动性或分子复杂性。因此，开发更具生理相关性的界面对于研究细胞骨架组分如何在细胞前缘协调作用具有重要意义。
总体而言，这种重建方法能够精确控制蛋白质的组成和浓度，从而以在细胞系统中难以实现的方式对各个组分进行机制上的解析。该方法为研究分子马达如何重塑分支状肌动蛋白网络以及在类膜界面上调控力的产生提供了一个多功能的平台。通过适当的验证，该实验体系还可拓展用于研究不同类型的肌球蛋白、突变体或与疾病相关的马达变体，以及力敏感性肌动蛋白结合蛋白如何调节动态肌动蛋白网络中的力学反馈。更广泛地，该系统有助于将分子尺度的马达活动与介观尺度的细胞骨架组织及力学功能联系起来，对细胞运动、内吞作用以及膜重塑等过程具有重要意义。

由肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合物介导的分支状肌动蛋白聚合，可产生推动多种细胞过程的主要突出力，包括细胞运动、内吞作用、吞噬作用以及细胞黏附复合物的形成1,2,3,4,5,6。在迁移细胞的前沿边缘，成核促进因子（NPFs）在质膜上激活Arp2/3复合物，启动树突状肌动蛋白网络的组装，从而推动膜向前延伸。肌球蛋白-I马达常与这些分支状肌动蛋白网络在膜界面处共定位，并被认为参与调控&#160;肌动蛋白组织&#160;以及调节力的产生7,8,9,10,11,12,13。尽管越来越多的证据表明肌球蛋白-I参与肌动蛋白依赖的机械过程，但其如何与Arp2/3介导的分支状肌动蛋白组装相互作用，进而调控网络结构与机械输出的分子机制，目前仍不清楚。
为弥补这一空白，我们将肌球蛋白-I 引入已建立的肌动蛋白彗星尾珠运动系统14,15,16,17，以重建肌球蛋白-I、肌动蛋白和 Arp2/3 复合物在微米级珠表面的相互作用。该方法的总体目标是定量研究肌球蛋白-肌动蛋白偶联如何影响分支状肌动蛋白的组装、网络结构、对称性破缺以及在类膜界面上的珠运动。在该检测中，将肌球蛋白-I 和成核促进因子（NPFs）共同包被于微米级珠表面，以模拟其在质膜上的共定位18。启动聚合后，珠表面结合的 NPFs 促进 Arp2/3 依赖的分支状肌动蛋白组装，导致肌动蛋白壳形成、对称性破缺，并发展出极化的彗星尾&#160;，从而驱动珠的推进运动14,19,20,21,22,23。通过系统调节肌球蛋白表面密度18，并利用加帽蛋白（CP）浓度调控肌动蛋白网络密度15,19,24，该方法可实现对肌动蛋白组装动力学、生长效率、网络结构和珠运动的定量分析，从而提供与肌球蛋白-I 依赖性机械输出变化相关的间接读数。
该检测方法相较于互补性方法也具有明显优势。与聚合作用整体检测（如派伦-肌动蛋白检测）相比，这种珠粒运动系统能够直接观察分支状肌动蛋白的组装过程以及由肌动蛋白聚合驱动的珠粒运动。与细胞研究相比，在细胞研究中，蛋白质功能的重叠以及复杂的细胞环境可能掩盖各个组分的独立作用并使结果解释复杂化，而本检测方法可精确控制蛋白质的组成、浓度及表面排列，从而能够在明确的生化条件下系统地研究肌球蛋白-I如何与Arp2/3介导的肌动蛋白组装相互作用。
该方法最适合用于研究细胞骨架组分如何在类似膜的环境中协调作用&#160;界面以调控肌动蛋白网络结构和力学输出。尽管当前方案已针对肌球蛋白-I介导的分支肌动蛋白组装进行了优化，但其模块化设计未来可被调整用于研究其他膜相关肌球蛋白类别（例如，肌球蛋白VI、VII、X、XV和XIX）和/或肌动蛋白结合蛋白（例如，成束蛋白（formins）、血管扩张刺激磷蛋白（VASP）、皮层肌动蛋白（cortactin）、冠蛋白（coronin）或原肌球调节蛋白（tropomyosin））。此类调整需对蛋白质的固定化、活性及表面密度进行验证。此外，该检测方法适用于脉冲-追踪标记策略。引入光转换或光激活的肌动蛋白，或标记的Arp2/3亚基，可实现对生长网络中纤维周转和分支解离速率的测量。25总体而言，该检测方法为研究膜相关马达蛋白、肌动蛋白丝及肌动蛋白结合蛋白之间的分子相互作用，以及探究马达蛋白和肌动蛋白结合蛋白如何调控类膜界面上的网络重塑与力的产生，提供了一个多功能的实验平台。14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34更广泛地说，它还可作为一种最小化且可调节的活性物质平台，用于研究由马达驱动的非平衡动力学背后的物理原理，例如对称性破缺、自组织、力-化学反馈以及活性肌动球蛋白网络中的其他涌现行为。18,19,20,21,22,23,35,36，对活性物质物理和材料工程具有潜在意义。

<table><tbody><tr><td>腺苷-5&amp;prime;-三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>用于配制含ATP的缓冲液；分装后于&amp;minus;20&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>Arp2/3复合物</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td>用于成核分支状肌动蛋白网络；按参考文献42方法纯化。</td></tr><tr><td>生物素-CF640荧光染料</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>用于荧光标记对照微球；避光保存于&amp;minus;80&amp;deg;C。</td></tr><tr><td>生物素化Myo1d</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td>作为马达蛋白用于修饰肌球蛋白包被的微球；制备方法见参考文献18和38&amp;ndash;40。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>用于微球封闭及微球储存缓冲液；配制过滤后的储备液。</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>X缓冲液和钙离子干扰实验中的缓冲液组分。</td></tr><tr><td>钙调蛋白</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td>添加至含肌球蛋白的反应体系及微球储存缓冲液中；按参考文献44方法纯化。</td></tr><tr><td>羧基聚苯乙烯微球（2.0 &amp;micro;m直径）</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>作为NPF、NeutrAvidin、荧光染料和肌球蛋白包被的固相载体；4&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>用于延时显微镜下的荧光图像采集。</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝染色液</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>用于SDS-PAGE凝胶电泳后密度分析前的染色。</td></tr><tr><td>盖玻片，22 mm &amp;times; 22 mm，#1.5</td><td>Globe</td><td>1404-15</td><td>与载玻片配合组装挤压室。</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>缓冲液和运动混合液中使用的还原剂；&amp;minus;20&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>干式旋片真空泵</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>用于操作等离子清洗系统。</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>M缓冲液、运动缓冲液及肌动蛋白预处理中使用的钙离子螯合剂。</td></tr><tr><td>外部光源</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>荧光显微镜用金属卤化物光源。</td></tr><tr><td>Fiji（ImageJ）</td><td>开源软件</td><td>N/A</td><td>用于彗尾长度、荧光强度和网络密度分析（版本2.16.0/1.54p）。</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>倒置落射荧光显微镜，用于成像肌动蛋白彗尾结构。</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>SDS-PAGE凝胶脱色液组分；具有腐蚀性，操作时需采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03-A</td><td>用于Arp2/3介导的肌动蛋白组装的成核促进因子；分装后于&amp;minus;80&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>X缓冲液、M缓冲液和运动缓冲液中使用的缓冲试剂。</td></tr><tr><td>人源CapZ</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td>用于调控肌动蛋白网络密度的封端蛋白；按参考文献43方法纯化。</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>反应缓冲液和肌动蛋白预处理中使用的缓冲液组分。</td></tr><tr><td>MetaMorph成像软件</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>用于显微镜控制和图像采集（版本7.10.4.459）。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>SDS-PAGE凝胶脱色液组分；易燃，需按照机构安全规程操作。</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>添加至运动缓冲液以增加溶液黏度（1500 cP）。</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>用于组装显微镜用挤压室。</td></tr><tr><td>NeutrAvidin蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>用于将生物素化蛋白固定在微球表面；分装后于&amp;minus;80&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>PageRuler Plus预染蛋白Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>SDS-PAGE分析用分子量标准；&amp;minus;20&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>用于在组装腔室前对显微镜载玻片和盖玻片进行等离子清洗。</td></tr><tr><td>聚醚砜注射器滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>用于分装前过滤牛血清白蛋白储备液。</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>用于维持检测缓冲液离子强度的盐类。</td></tr><tr><td>兔骨骼肌肌动蛋白</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td>按参考文献41方法纯化，作为G-肌动蛋白用于肌动蛋白彗尾组装实验。</td></tr><tr><td>制冷型微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>用于微球制备和洗涤步骤中的微球沉淀。</td></tr><tr><td>旋转管式混合器（台式旋转仪）</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>微球包被孵育过程中用于维持微球悬浮状态。</td></tr><tr><td>Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液（10&amp;times;）</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>使用前稀释至1&amp;times;进行SDS-PAGE电泳。</td></tr><tr><td>真空脂</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>荧光成像前用于密封挤压室。</td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;20%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>用于与微球结合蛋白的SDS-PAGE分析；4&amp;deg;C保存。</td></tr></tbody></table>

在基于微珠的肌动蛋白彗尾运动性实验中重建肌球蛋白-i介导的分支肌动蛋白组装

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

由肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合物介导的分支状肌动蛋白聚合为多种细胞过程（包括细胞迁移、内吞作用和吞噬作用）提供了主要的推进力。肌球蛋白-I分子马达常与细胞前缘的分支状肌动蛋白网络共定位，也被证实参与这些过程，并被认为可调控肌动蛋白网络的组织结构与力学输出。然而，肌球蛋白-I如何通过与Arp2/3复合物相互作用以调节分支状肌动蛋白组装及力生成的分子机制，目前仍 largely 未知。本文描述了一种高度可调控的 体外 在微米级珠表面重建肌球蛋白-I、肌动蛋白和Arp2/3复合物在细胞前缘相互作用的肌动蛋白彗星尾珠运动实验。该方法基于成熟的肌动蛋白彗星尾实验，通过在珠表面共固定肌球蛋白-I和成核促进因子（NPFs），构建模拟膜的肌动蛋白组装界面。该实验可实现对肌动蛋白网络组装、网络密度、珠运动性及生长效率的可视化与定量分析，同时可间接、定性地读取肌球蛋白-I在分支状肌动蛋白网络中介导的力增强效应。本实验方案包括珠的功能化修饰、反应体系构建、荧光成像、定量图像分析及故障排除策略，为研究膜样界面上肌球蛋白-I调控的肌动蛋白组装提供可重复的实验平台。

关键词：肌动蛋白彗星尾珠运动实验，肌球蛋白-I，Arp2/3复合物，成核促进因子，肌动蛋白网络组装，珠运动性，荧光成像，定量图像分析，中国台湾

利用肌动蛋白彗星尾珠运动实验，研究肌球蛋白-I活性对细胞前缘Arp2/3复合物介导的分支状肌动蛋白组装的影响，重现了膜结合型肌球蛋白-I与肌动蛋白聚合协同作用以驱动膜突起的生物学情境7,8,9,10,11,12,13为模拟肌球蛋白-I与成核促进因子在膜-肌动蛋白界面的共定位，将这两种蛋白共同包被于微米级珠表面，从而在受控条件下重建其空间邻近性 体外 系统图1A，B).
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
图 1。肌球蛋白-I介导的微米级珠粒上分支状肌动蛋白组装的重建。（A）示意图显示了细胞前缘处肌球蛋白-I、成核促进因子（NPFs）、肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合物、帽蛋白（CP）和球状肌动蛋白（G-actin）之间的相互作用。（B）珠粒功能化的示意图。对照珠粒和包被肌球蛋白的珠粒均包被了NPF和中性亲和素。中性亲和素偶联至生物素化的远红荧光染料（用于对照珠粒）或生物素化的Drosophila Myo1d（用于包被肌球蛋白的珠粒）。（C）代表性时间序列图像，显示从对称性破缺到极化彗星尾形成的对照珠粒与包被肌球蛋白珠粒的肌动蛋白彗星尾生长过程。最后一张图显示两个珠粒在同一视野中。比例尺，5 µm。图B和图C经许可改编自Xu等，Science Advances，DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024)，AAAS。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
为了更准确地评估肌球蛋白-I对肌动蛋白组装的特定贡献，还构建了相应的对照微珠。对照微珠与肌球蛋白包被的微珠完全相同，唯一的区别是用生物素化的远红荧光染料与中性链霉亲和素（neutravidin）结合物替代了肌球蛋白-I（图1B）。将两种类型的微珠混合在同一反应腔室中，并在同一视野下进行成像，可在完全相同的实验条件下直接比较有或无肌球蛋白-I时分支状肌动蛋白的组装情况（图1C）。此外，通过调节微珠表面肌球蛋白与NPF的比例，可系统地考察不同表面密度下肌球蛋白-I的作用（图2A、B）。同时，通过调节加帽蛋白（CP）的浓度，可调控肌动蛋白网络的密度，从而生成从紧密排列、抗对称性破缺的结构到松散组织、易发生断裂的架构等一系列不同特性的网络15，19，24。该方法使得研究人员能够探究肌球蛋白-I如何在不同密度和结构完整性的网络中影响分支状肌动蛋白的组装（图2A、B）。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
图2. 肌动蛋白彗星尾形态&#160;跨肌球蛋白表面密度和加帽蛋白浓度 (A) 2-的代表性荧光图像&#181;m-不同肌球蛋白表面密度包被的微珠，以及含有30–200 nM加帽蛋白（CP）的组装反应体系 4 &#181;M 含5%罗丹明标记的肌动蛋白的肌动蛋白，以及200 nM Arp2/3&#160;复合物。每种条件下，对照珠和肌球蛋白包被珠均在同一视野中成像。肌球蛋白和成核促进因子（NPF）的表面密度通过十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，具体方法见步骤2.3。图像在反应启动后20–35分钟采集。亮度和对比度在每对对照珠–肌球蛋白珠之间进行线性且相同的调整，但不同条件之间独立缩放，以实现更佳的可视化效果。比例尺， 5 &#181;m. (B定性分析图谱，总结了在不同 CP 浓度和肌球蛋白表面密度下彗星尾的形成结果。每个数据点代表在指定条件下匹配的对照–肌球蛋白珠对。符号表示观察到的结果，包括肌球蛋白包被的珠促进对称性破缺、形成更长的尾、相似长度的尾、更短的尾、无彗星尾形成或星状结构。数据来自超过 20 次独立实验，每种条件下分析了超过 10 对珠。该图改编自 Xu et al. 科学进展，DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024)，AAAS，经许可使用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
混合检测组分后，表面结合的NPFs会刺激Arp2/3复合物介导的分支状肌动蛋白在珠表面周围组装。在一个典型的成功反应中，肌动蛋白首先表现为围绕珠体的稀疏外壳。随着聚合的进行，外壳向外扩展，网络结构变得更加致密和交错。珠表面持续的肌动蛋白组装推动网络向外生长，可能导致对称性破缺并形成极化的彗尾结构。一旦彗尾结构建立，珠表面持续的肌动蛋白成核与聚合可支持珠体的持续运动（图1C）。肌动蛋白外壳形成、对称性破缺、彗尾延伸以及珠体推进这一系列连续特征，可作为检测体系正常运行的可视化指标。
如我们先前的研究18所述并如图2A、B所示，彗星尾形态对CP浓度和肌球蛋白表面密度均敏感。在标准检测条件下（200 nM Arp2/3复合物，50 nM CP，肌球蛋白:NPF比例 = 0.43:1），与对照组微珠相比，包被肌球蛋白的微珠通常产生更稀疏或更弥散的肌动蛋白彗星尾（图2A）。在低CP浓度（&#60;30 nM）下，肌动蛋白组装成致密且抗断裂的壳状结构。在此条件下，对照组微珠常保持被包裹状态，无法发生对称性破缺，而包被肌球蛋白的微珠更易打破对称性并从周围的肌动蛋白壳中逃逸（图2A、B）。在高CP浓度（&#62;200 nM）下，网络内聚性降低，肌球蛋白的存在进一步破坏了肌动蛋白网络的稳定性，促进肌动蛋白脱落，并阻止稳定彗星尾的形成（图2A、B）。这些依赖条件的实验结果为研究人员提供了有用的参考标准，可用于确定合适的检测条件并排查检测性能问题。
通过测量彗星尾的平均荧光强度，可以评估肌球蛋白-I对肌动蛋白彗星尾形态的影响。彗星尾区域的界定采用步骤4.2中所述的强度阈值法，随后测量该区域内的平均荧光强度（图3A）。在相同的成像条件下，对照珠粒与包被肌球蛋白的珠粒在同一视野中成像，该数值可作为肌动蛋白网络密度的相对、未经校准的替代指标，平均强度越低表明网络越稀疏。在标准检测条件下，包被肌球蛋白的珠粒通常产生的彗星尾平均荧光强度低于对照珠粒，表明其表观网络密度降低（图3C）。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
图3．肌动蛋白彗星尾生长动力学及组装效率的定量分析流程。（A）在50 nM 加帽蛋白（CP）存在条件下，对照组微珠与0.43:1肌球蛋白包被微珠的彗星尾生长代表性时间序列。黑色轮廓表示使用Fiji软件划定的彗星尾感兴趣区域（ROIs），用于荧光强度测量。反应条件：4 µM 肌动蛋白（其中5%为罗丹明标记），200 nM 肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合物，以及50 nM CP。比例尺：5 µm。（B）图（A）中代表性对照组–肌球蛋白微珠对的彗星尾长度随时间变化曲线。插图显示用于线性拟合的时间窗口，尾部生长速率由拟合直线的斜率确定。（C）图（A）中代表性对照组–肌球蛋白微珠对的归一化总彗星尾荧光强度随时间变化曲线。对照组和肌球蛋白包被微珠的荧光强度均以对照组微珠在1100至1300秒间的平均荧光强度为基准进行归一化。插图显示用于线性拟合的时间窗口，荧光组装速率由拟合直线的斜率计算得出。（D）汇总表格，显示图（A）中代表性对照组–肌球蛋白微珠对的尾部生长速率、荧光组装速率及生长效率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过测量彗星尾部的伸长和随时间推移的肌动蛋白荧光积累，可以量化肌球蛋白-I对彗星尾部生长动力学的影响。在大多数实验中，对称性打破后的前约10分钟内，彗星尾部以近似恒定的速度生长。随着聚合组分的消耗，伸长速度逐渐减慢，通常在反应启动约30分钟后停止。为了量化生长动力学，将彗星尾部长度和总荧光强度随时间的变化绘制成图（图3B，C）。前7–10个数据点对应初始线性阶段，采用线性回归拟合（图3B，C，插图）。这些拟合的斜率分别代表初始尾部生长速率和肌动蛋白荧光组装速率。生长效率定义为彗星尾部生长速率除以肌动蛋白荧光组装速率，用于量化肌动蛋白聚合转化为珠粒有效位移的效率（图3D）。在所示的代表性示例中（图3A–D），肌球蛋白包被的珠粒表现出0.60 µm/min（0.010 µm/s）的尾部生长速率，而对照珠粒为0.57 µm/min（0.0095 µm/s）（图3B，D）。相应的生长效率分别为5.6 和4.5 µm/荧光强度单位，表明肌球蛋白包被的珠粒的生长效率约高出1.2倍（图3D）。在标准条件下，肌球蛋白包被的珠粒通常表现出与对照珠粒相似的生长速率（肌球蛋白：0.69 ± 0.10 µm/min；对照：0.66 ± 0.20 µm/min），同时其肌动蛋白荧光组装速率较低（约为对照的0.76倍），而生长效率约高出1.4倍，这与我们在原始研究中先前报道的结果一致18。这些数值来自五次独立实验中每种条件下获得的11对珠粒，以均值±标准差表示。统计分析采用双尾配对t检验，如原始研究中所述18。
为了评估肌球蛋白动力冲程的贡献，并排除因肌球蛋白在表面占据而产生空间位阻效应的可能性，可在破坏肌球蛋白-I动力冲程活性的条件下进行小球运动性实验。在本方案中，通过向反应体系中添加1.1 mM Ca2+来抑制肌球蛋白-I的马达活性。升高的Ca2+浓度促进钙调蛋白从肌球蛋白-I的杠杆臂上解离，从而降低杠杆臂的刚性，削弱其产生力的能力46,47,48。在此条件下，肌球蛋白-I仍能动态地与肌动蛋白结合，但无法支持肌动蛋白滑动（图4A、B），这为评估依赖于马达活性的效应提供了有效的对照18。
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
图4。基于钙离子的对照实验，用于评估珠粒运动测定中 Myo1d 分子马达的活性。（A）在无高浓度钙离子或存在 100 µM 游离钙离子条件下，肌动蛋白丝在 Myo1d 涂层表面移动的时程叠加图像。彩虹色标尺表示以 5 秒间隔采集的 61 帧图像的时间进程。比例尺：5 µm。（B）在无或有 100 µM 游离钙离子条件下肌动蛋白滑动速度的定量分析（N = 2 次独立实验；n = 25 条丝）。在此条件下，存在 100 µM 游离钙离子时未观察到有效的肌动蛋白滑动。误差线代表标准差。（C）在无或有 100 µM 游离钙离子条件下组装的对照珠与肌球蛋白涂层珠的代表性配对图像。每种条件下展示五个代表性珠对。在每对珠中，对照珠和肌球蛋白涂层珠在同一视野内成像。图像在反应启动后约 15–20 分钟采集。亮度和对比度在每对对照–肌球蛋白珠之间线性且一致地调整，但不同条件之间独立缩放。反应条件：4 µM 肌动蛋白（含 5% 罗丹明标记肌动蛋白）、200 nM 肌动蛋白相关蛋白 2/3（Arp2/3）复合物和 50 nM 封端蛋白（CP）。比例尺：5 µm。图 A 和 B 改编自 Xu 等人，Science Advances，DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024)，AAAS，经许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
当实验操作正确时，在高钙离子（Ca2+）条件下检测的肌球蛋白包被微珠产生的肌动蛋白彗尾较短，且网络密度与对照组微珠相当（图4C）。图中展示了来自两次独立实验的五组具有代表性的对照组和肌球蛋白包被微珠。该定性结果在多次重复实验中均一致观察到，并得到原始研究中定量分析的支持18。这一预期结果表明，在标准条件下观察到的网络差异依赖于肌球蛋白的主动做功冲程，而不仅仅是肌球蛋白在表面的占据情况。因此，高钙离子（Ca2+）条件是评估分支状肌动蛋白网络结构变化是否源于肌球蛋白马达活性的关键对照。

本方案描述了一种可调节的肌动蛋白彗尾珠运动性实验，用于定量研究肌球蛋白马达活性如何影响类膜界面上的分支肌动蛋白组装及网络结构。

在基于微珠的肌动蛋白彗尾运动性实验中重建肌球蛋白-I介导的分支肌动蛋白组装

由肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合物介导的分支状肌动蛋白聚合，为多种细胞活动提供了主要的推进力……

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

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本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。...

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

本方案描述了如何使用市售蛋白质组分在微珠表面产生肌动蛋白彗尾结构。此类系统可模拟细胞中的突出结构，能够以简化的方式研究力生成的生理机制。...

使用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

用于模拟细胞骨架的（多孔）弹性收缩性肌动球蛋白网络的力学特性

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。...

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。...

创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

学习基于微珠的肌动蛋白彗尾运动性实验方法，用于在膜样界面重建肌球蛋白-I介导的分支肌动蛋白组装过程。该技术可定量分析肌动蛋白网络组装、密度及珠子运动性，为研究细胞骨架动力学提供可重复的体外平台。

在基于微珠的肌动蛋白彗尾运动性实验中重建肌球蛋白-I介导的分支肌动蛋白组装

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