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本研究获得了美国国立卫生研究院（R01DK134590）向 S.N.T. 提供的慷慨资助。我们还衷心感谢以下机构向 S.N.T. 提供的资助：美国国立卫生研究院（K99/R00 HL1431149；R01HL157803；R24OD034189）、美国国家科学基金会（EEC 1941543）、Polsky 家族基金会以及波士顿 Shriners 儿童医院（项目编号 #BOS-85115）。此外，我们感谢美国肝病研究学会基金会通过项目编号 #LIFER23-263034 向 R.J. 提供的资助。作者对哈佛医学院病理学核心实验室在组织学研究中提供的专业支持表示深切感谢。我们谨向美国国立卫生研究院心肺血液研究所的 Robert Balaban 博士和 Armel Femnou 博士致以诚挚谢意，感谢他们在线粒体能量代谢领域的专业知识，以及在构建单个线粒体复合物的 RRS 文库过程中所提供的宝贵帮助。

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作者声明存在竞争利益。S.N.T 和 P.R. 拥有与本研究相关的临时专利申请。P.R. 是 Pendar Technologies 的员工及股东。S.N.T 的利益由麻省总医院（MGH）和 Partners HealthCare 根据其利益冲突政策进行管理。J.N.K 的竞争利益由波士顿儿童医院（BCH）的利益冲突政策进行管理。本研究中使用了以下专利技术：US2020/0281474A1 利用拉曼光谱进行细胞能量代谢的体内监测（申请）。此外，已提交了多项使用共振拉曼光谱技术在眼科、组织存活性及烧伤损伤评估中的专利申请，其中 R.J. 也是发明人之一。

本研究介绍了一种非侵入性、实时且高度灵敏的线粒体健康定量方法，该方法采用便携式共振拉曼光谱系统，系统由紧凑型探头中的激光器组成，并通过光纤电缆连接至激光泵。该方法使用441 nm激光激发线粒体，线粒体根据其氧化状态产生独特的光谱信号。因此，共振拉曼光谱（RRS）能够通过其光谱特征量化线粒体的每种状态，并通过回归分析将发射光谱与预先测量的光谱库进行比对。随后基于还原态线粒体与总线粒体的比值构建了一项线粒体健康指标：还原共振拉曼线粒体比率（3RMR）。
本文重点展示在无需样本处理的情况下，3RMR 随天然组织氧合状态实时变化的情况。该目标通过氧应激测试实现：在持续氧合灌注 5 分钟后，暂停灌注 5 分钟，随后重新启动灌注 5 分钟。在整个应激测试过程中持续采集 3RMR 测量数据。通过在缺血与氧合状态之间切换的应激测试模型，可追踪线粒体氧化还原状态的连续变化，进而反映线粒体功能的变化。换句话说，氧应激测试使我们能够追踪 3RMR 随氧合状态变化的趋势。本课题组已指出，3RMR 值升高与缺血条件相关，即灌注中断导致电子传递链（ETC）中的电子因缺乏最终电子受体 O2...

线粒体在细胞功能和稳态中发挥关键作用。线粒体是细胞代谢的主要驱动者，通过氧化磷酸化调控ATP的生成。它们还作为信号细胞器，通过调节凋亡通路以及活性氧（ROS）和Ca+2信号传导来决定细胞命运1。因此，线粒体功能障碍可导致多种神经退行性疾病、肌肉疾病和心血管疾病2,3。尽管线粒体在疾病进展中具有关键作用，但评估线粒体功能的方法往往具有侵入性、成本高昂且存在局限性。
线粒体功能的关键指标，例如耗氧率、氧化磷酸化以及电子传递链（ETC）中各复合物的活性，通常通过呼吸测定法进行测量。ETC由嵌入线粒体内膜（IMM）的四个复合物（I–IV）组成。这些复合物在其他辅酶的协助下，将电子从还原型底物（如NADH和FADH2）传递至最终的电子受体O₂。2，随后被还原为水。目前大多数呼吸测定实验（如 Seahorse 和 Orobros O2k）均需要对组织进行处理，从而限制了其在转化研究中的应用4,5. 测量线粒体膜电位（MMP）是评估线粒体功能障碍的另一种方法，该方法利用阳离子脂溶性荧光染料（如JC-1）结合显微成像技术，使耦合状态（健康）和非耦合状态（受损）的线粒体在不同波长下产生荧光6然而，这些检测方法的灵敏度可能较低5染料本身在高浓度下也可能具有高细胞毒性5最后，与呼吸测定法类似，该技术同样需要进行组织处理。近年来，基于光谱学的技术已被用作评估线粒体健康的非侵入性方法。例如，磷磁共振波谱法（P-MRS）通过测定含磷代谢物的浓度来评估细胞代谢，已被用于表征 undergoing 分化的工程化脂肪生成组织7然而，该技术也需要专门的设备和培训。
我们课题组近期展示了一种利用共振拉曼光谱法（Resonance Raman Spectroscopy, RRS）实时、无创且高度特异性地测量线粒体氧化还原状态以评估器官活力的技术。RRS 通过光子的非弹性散射来定量分析线粒体细胞色素的氧化还原状态。当以波长为 441 nm 的激光激发时，线粒体细胞色素、血红蛋白和肌红蛋白等分子中的血红素基团内的卟啉环会根据其氧化状态产生特征性的拉曼光谱8尽管RRS系统采用441 nm波长，但也可使用420 nm和405 nm波长的激光，每种波长优先增强不同的细胞色素复合物。将待测未知样品获得的光谱与预先记录的完全氧化或完全还原的完整线粒体光谱库进行比对，从而得到还原线粒体与总线粒体的比值，或线粒体的平均氧化还原状态 原位 电子传递链细胞色素。该比值定义为共振拉曼还原型线粒体比值（3RMR）。
3RMR 有 3 种不同的计算方式/类型：线粒体 3RMR（mito-3RMR）、复合物 III 3RMR（cIII-3RMR）和复合物 IV 3RMR（cIV-3RMR）。这些指数均通过特定组分的还原态数量与该组分总量的比值来计算。例如，cIII 的 3RMR 即为还原态 cIII 与组织中 cIII 总量的比值（cIII-R/(cIII-O + cIII-R)），cIV 的计算方式同理。因此，3RMR-cIII 表示还原态 cIII 与 cIII 总量的比值，3RMR-cIV 表示还原态 cIV 与 cIV 总量的比值。通过回归分析，可利用完整线粒体的光谱库计算线粒体氧化还原状态（mito-3RMR），或利用 cIII 和 cIV 的光谱库分别计算各个复合物的氧化还原状态（cIII-3RMR 和 cIV-3RMR）。最近一项研究9表明，mito-3RMR 可代表 cIII 和 cIV 氧化还原状态（即 cIII-3RMR 和 cIV-3RMR）的加权平均值。需要注意的是，复合物 I（cI）和复合物 II（cII）在 441 nm 波长下不具备拉曼活性或无法产生共振增强效应，因此在计算 mito-3RMR 时不予考虑。
利用这类3RMR，我们一直在界定3RMR的最佳范围。 &#34;健康&#34; 器官中，线粒体保持完整并具有充足的氧气供应。相反，受损器官可能存在氧气输送或利用不足，从而导致电子传递链复合物积累电子。电子积累会引起 &#34;还原应激，&#34; 将线粒体从氧化状态转变为还原状态，并提高3RMR值。多项研究8,9,10,11,12 从啮齿类和猪模型的心脏和肝脏等器官的研究，已开始揭示最佳的 &#34;健康&#34; 3RMR 的建议范围为 10 至 30。例如，Perry 等人将哺乳动物心脏置于缺氧条件下，结果显示 30% 的 3RMR 能够在检测缺氧组织时提供最佳的敏感性与特异性平衡8这一趋势在心脏组织的其他研究中得到了进一步证实11,12以及肝脏移植物10. 此外，Nyugen 等人9，证明在代谢已停止的组织中，3RMR值会降至极低（氧化态）水平，&#160;3RMR 水平（7.667 &#177;&#177; 4.926），而新鲜及可移植的温缺血肝脏的3RMR值则高于10（约12–15）9.
除了展示3RMR测量组织活力的方法之外，RRS的高灵敏度、高特异性和操作简便性使其在众多其他研究领域中具有广泛应用前景，特别是在涉及细胞代谢和线粒体功能变化的研究中。在先前的研究中，RRS已用于通过评估视神经乳头处视网膜神经节细胞无髓鞘轴突的代谢活性，来检测小鼠的黄斑变性和青光眼13此外，该技术还被用于检测先天性心脏病大鼠模型中的主动脉缩窄（CoA），这一诊断在新生儿心脏筛查中常常被遗漏。12该技术被用于理解器官移植领域相关各种实验条件下器官的功能与活力，包括评估器官活力的研究 离体 机器灌注10,11评估静态冷保存后的再氧合14，或减轻温缺血肝脏的再灌注损伤9.
本文旨在确立共振拉曼光谱法（RRS）作为一种实时、灵敏的线粒体健康评估工具。采用大鼠模型的完整肝脏，通过施加不同程度的缺血与氧再灌注作为应激测试，以评估线粒体的响应。在此氧应激测试中，新鲜肝脏依次经历5分钟的初始灌注、5分钟的缺血以及5分钟的再灌注。在整个应激测试过程中，同步采集3RMR信号，并检测乳酸、K⁺及氧分压（pO₂）的变化。与传统的血气分析指标相比，3RMR对氧合状态变化的响应更为迅速。本研究不仅突显了RRS在机制研究中的应用价值，也展示了其作为诊断方法和治疗研究平台的潜力。因此，本研究所共享的实验方案可为从事线粒体相关研究的各类科研人员提供参考。总体而言，RRS凭借其无创性、实时性和高度特异性，有望对细胞代谢研究产生重要影响。

<table><tbody><tr><td>16 G 导管&amp;nbsp;</td><td>BD Insyte Authoguard</td><td>381454</td><td>用于门静脉插管</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Vet Equip Vapor Guard 活性炭</td><td>931401</td><td>用于麻醉期间过滤过量蒸气</td></tr><tr><td>BSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A7906</td><td>灌注液成分</td></tr><tr><td>气泡捕获器&amp;nbsp;</td><td>Radnoti</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>灌注液成分</td></tr><tr><td>Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>灌注液成分</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密泵管（24 G）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>13-200-292</td><td>用于使灌注液流经肝脏</td></tr><tr><td>Masterflex 蠕动泵&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer, Vernon Hill, IL</td><td>7528-30&amp;nbsp;</td><td>用于使灌注液流经肝脏</td></tr><tr><td>膜式氧合器&amp;nbsp;</td><td>Radnoti</td><td>130144</td><td>用于灌注液的氧合。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>灌注液成分</td></tr><tr><td>RAPIDPoint 500 血气分析系统</td><td>Siemens Healthineers</td><td>41115805</td><td>用于血气分析</td></tr><tr><td>共振拉曼系统&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Pendar Technologies</td><td>A4D441</td><td>有关该产品的咨询，请联系 Pendar Technologies</td></tr></tbody></table>

利用共振拉曼光谱实时无创评估线粒体功能

Real-Time, Noninvasive Evaluation of Mitochondrial Function Using Resonance Raman Spectroscopy

尽管线粒体在疾病发生和发展中起着核心作用，但关于线粒体健康动态的机制性研究仍然成本高昂且难以获取。为弥补这一空白，本研究采用共振拉曼光谱法（RRS）评估线粒体功能，使用一种便携式系统，可对大鼠肝脏中的线粒体细胞色素氧化还原状态进行实时、无创且定量的测量。在本实验方案中，我们展示了该技术的应用，包括系统设置、数据采集和数据处理。本研究提供了一项概念验证实验，突显了RRS在测量线粒体氧化还原状态实时变化方面的能力，进而反映线粒体功能。简言之，将RRS设备连接至激光泵和数据采集计算机，并置于距离大鼠肝脏1 cm的位置。&#160; 根据大鼠肝脏实验方案设定采集参数；通过氧气应激测试，在富氧和缺血条件下测量氧化还原状态，并在整个氧气应激测试过程中追踪线粒体氧化还原状态的变化。

采用氧应激试验对新鲜肝脏进行缺血和再灌注处理。随后，在整个应激试验过程中，将3RMR的实时变化与T0、T5、T10、T15时间点通过灌注液分析获得的耗氧率、流出液乳酸和钾离子水平进行比较。在健康状态下，3RMR值预期介于10%至30%之间（图5A）。如预期所示，T0和T5时的3RMR值处于该范围内，因为在此期间肝脏持续接受含氧灌注液供应（图5A）。然而，在缺血期结束时（T10），3RMR值超出最佳范围（图5A）。该升高表明线粒体向还原状态转变，原因是脱氧导致电子传递链中电子积聚。在T10时，恢复含氧灌注流，再灌注期开始。在再灌注期结束时（T15），随着氧气作为最终电子受体重新引入，电子传递链活性恢复，3RMR值回归至最佳水平（<strong class="xfig"...

我们提出了一种利用共振拉曼光谱法（RRS）无创、实时监测线粒体健康状况的方法。我们采用RRS定量分析线粒体的氧化还原状态，并建立了一种评估线粒体健康的指标——共振拉曼还原线粒体比率（3RMR），该指标对氧合状态变化的响应速度优于传统的血气分析物。

尽管线粒体在发病机制和疾病进展中处于核心地位，但对线粒体健康动态的机制性研究仍然成本高昂且……

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利用共振拉曼光谱实时、非侵入式评估线粒体功能

采用Langendorff模式的离体心脏灌流结合31P核磁共振波谱法，将生物化学与生理学整合于同一实验中。该方案可在连续监测心脏生理功能的同时，动态测定心肌高能磷酸化合物的含量及其转换速率。若操作正确，此技术是评估心脏能量代谢的有力手段。...

使用31P 核磁共振波谱法评估离体小鼠心脏功能与能量代谢

我们提出一种新方法，利用禽类胚胎模型中的动态实时活体成像，定量分析纳米颗粒在人源异种移植肿瘤血管系统中的定位。...

利用活体成像实时评估肿瘤中纳米颗粒的摄取

在损伤或疾病后重新训练异常的运动模式是物理康复的关键组成部分。近年来技术的进步使得在多种任务中能够准确评估运动，并几乎即时地对结果进行量化，从而为实时修正错误运动模式提供了新的机会。...

利用表现的实时反馈进行运动再训练

我们描述了一种实时PCR方案，用于分析脑脊液（CSF）中的microRNA。除RNA提取步骤外，该方法可推广应用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。...

利用定量实时聚合酶链式反应进行脑脊液微小RNA谱分析

本研究展示了磁共振显微成像成功建立为一种非侵入性工具，可用于评估患自身免疫性心肌炎小鼠的心脏异常。数据表明，该技术可用于在活体动物中监测疾病进展。...

小鼠实验性自身免疫性心肌炎中心脏异常的磁共振显微成像无创评估

全血细胞毒性检测（WCA）是一种将高通量细胞定位技术与荧光显微镜和自动图像处理相结合而开发的细胞毒性检测方法。本文描述了如何在人全血中实时分析经抗CD20抗体处理的淋巴瘤细胞，以提供定量的细胞毒性分析结果。...

人全血中的实时细胞毒性检测

本方案描述了如何使用定量实时 PCR（QRT-PCR）检测小鼠肺组织中代表转移灶的肿瘤细胞特异性...

通过定量实时PCR评估小鼠乳腺肿瘤模型中的肺转移

这项工作证明了一种方法的可行性 体内 磷-31磁共振波谱学（31采用磷酸磁共振波谱（PMRS）技术定量人体骨骼肌中线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）能力。...

体内磷-31磁共振波谱：一种用于测量人体骨骼肌线粒体氧化磷酸化能力的工具

在此，我们提供了一种逐步操作方案，用于研究线粒体呼吸和糖酵解功能 白色念珠菌...

使用实时细胞外通量分析对Candida albicans进行生物能量学研究

本文介绍了一种利用漫射光学技术在床旁无创、实时监测神经危重症患者脑血流动力学的实验方案。具体而言，该方案采用一种混合式漫射光学系统，用于检测并实时显示脑组织氧合、脑血流量和脑代谢的相关信息。...

利用扩散光学光谱技术对神经重症患者进行实时监测

Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School.  我们提出了一种利用共振拉曼光谱（RRS）进行线粒体健康监测的非侵入性实时方法。我们利用RRS定量线粒体氧化还原状态，并开发了线粒体健康的指标——共振拉曼减线粒体比率（3RMR），该指标显示对氧气变化的响应速度快于传统血液气体分析物。

利用共振拉曼光谱实时无创评估线粒体功能

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