发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

我们的研究探讨了使根系长期从渗透胁迫中恢复的基因与机制，以增强作物的抗旱能力。尽管本实验方案是为拟南芥根系设计的，但也可适用于带有荧光蛋白标记品系的其他系统。获取用于成像的、含有拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗的生长平板。

用移液器将60微升纯水滴加到玻璃载玻片上。将三株六日龄的A.thaliana幼苗根部放入水中。在根部上方放置一个22×22毫米的1.5号盖玻片，注意不要覆盖叶片。

在共聚焦显微镜设置中，将激光曝光时间设为 1,000 毫秒。在激光合束器设置中，将 488 纳米激光设为 50%，用于绿色荧光蛋白（GFP）成像；将 561 纳米激光设为 50%，用于红色荧光蛋白（RFP）成像。

使用20倍物镜对样品进行成像，不使用光学变焦。将Z轴切片步长设置为0.3微米。成像时间间隔设置为1分钟，总成像持续时间为10分钟。

找到根部并选择最多 20 个 Z 切片。采集 16 位图像。启动延时成像，并使用无损压缩将延时序列保存为 TIFF 文件。

将获取的数据移至计算机进行分析。打开 ImageJ 或 Fiji 软件。单击并拖动 VSI 文件至 ImageJ 或 Fiji 主程序窗口。

在“Bio Formats 导入选项”提示框中，单击右下角的“确定”。然后在“Bio Format 序列选项”提示框中，确保已选择“序列 1”，单击左下角的“确定”。

图像加载完成后，通过选择“图像”菜单进行信号分离，点击“颜色”，然后选择“拆分通道”。分别查看GFP标记的细胞核和RFP标记的染色质所生成的独立窗口。

确定两个图像窗口中哪一个对应于染色质。单击染色质图像窗口后，从主 ImageJ 窗口中选择“图像”（Image），然后选择“堆栈”（Stacks），再点击“Z 投影”（Z Project）以执行 Z 投影操作。将投影类型（Projection Type）更改为最大强度投影（Max Intensity）。

确保已激活“所有时间帧”，然后单击“确定”以生成投影。通过按 Control Shift C，或在主 ImageJ 窗口中选择“图像”，然后依次选择“调整”和“亮度/对比度”，打开对比度菜单。向左滑动“最小值”滑块，直到染色质清晰可见。

导航至插件。点击插件菜单中的下拉箭头，滚动至 Tracking 选项。选择 Tracking 并点击 TrackMate。

确认校准设置准确无误，然后点击“下一步”。选择阈值检测器，然后点击“下一步”。在图像窗口中跳转到时间序列的最后一帧。

单击“强度阈值”旁边的“自动”，然后单击“预览”。调整强度阈值后再次单击“预览”。重复调整和预览过程，直到包含所有染色质且噪声最小，然后单击“下一步”。

等待初始阈值检测完成后，点击“下一步”。手动调整阈值，直到仅染色质可见，然后点击“下一步”。调整荧光图像显示，再点击“下一步”。

选择 Simple LAP Tracker 并点击下一步。将“链接最大距离”设置为 5 微米，“间隙闭合最大距离”设置为 15 微米，“间隙闭合最大帧间隙”设置为 1，然后点击下一步。等待跟踪完成。

观察原始图像窗口中显示的轨迹，然后点击下一步。按下左下角的绿色加号按钮以创建筛选条件。在轨迹模式下选择点的数量。

调整阈值滑块。确保滤波模式设置为“高于”，然后点击下一步。在显示选项页面底部点击轨迹按钮。

选择“导出为 CSV”。忽略内置的绘图页面，然后单击“下一步”。查看 TrackMate 分析结果。

单击“捕获叠加”按钮，然后选择“执行”。通过选择“文件”并单击“另存为”，然后选择 GIF 格式来保存视频。经盐处理的根细胞表现出应激状态，着丝粒焦点比对照条件下的更大。

在对照条件下，染色质的移动速度显著高于100毫摩尔氯化钠处理条件下的速度。本实验方案可实现对拟南芥根中荧光标记蛋白随时间推移的运动轨迹进行追踪与定量分析。该方案中最关键的挑战在于获得高质量的图像，因为光漂白和样品漂移可能导致追踪困难。

未来的研究应探讨本研究中观察到的染色质运动减少的潜在机制。