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作者声明本研究未获得任何资助。

所用试剂和设备列于材料表中。
1. 样本制备
<ol>
	<li>从三种纳米杂化树脂复合材料中总共制备90个圆盘状试样（每种材料n = 30）。</li>
	<li>使用圆柱形透明硅胶模具（直径6 mm × 厚度2 mm）制备试样，以确保尺寸标准化。</li>
	<li>将复合材料以单层增量（2 mm厚度）填入模具中，并在表面覆盖一张透明显微镜盖玻片，以获得平整表面。</li>
	<li>使用蓝色LED光固化仪（发射光谱≈440–480 nm），将光源置于距试样表面约1 mm处，输出强度为1000 mW/cm2，照射20 s完成聚合。</li>
	<li>每次光固化前使用辐照计检测光强，以确保光照暴露的一致性。</li>
	<li>将制备好的试样置于37 °C蒸馏水中储存24 h，以完成后聚合反应并模拟初始口腔环境。 
	注意：&#160;试样可在37 °C蒸馏水中储存最多24 h后再进行后续处理。</li>
</ol>
2. 完成与抛光步骤
<ol>
	<li>使用含氧化铝的抛光盘完成并抛光所有样本的上表面。所有抛光操作应由同一名操作者完成，以确保表面标准化。</li>
	<li>在约10,000 rpm转速下，依次使用中等、细和超细抛光盘进行抛光，每步持续10秒，同时采用水冷却，并施加轻压及单向旋转运动。</li>
	<li>每处理五个样本后更换一次抛光盘，以保持一致的研磨效率并确保表面标准化。</li>
	<li>每次抛光步骤后，用蒸馏水冲洗样本10秒以去除碎屑，再轻轻吹气干燥5秒，然后进行下一步抛光。</li>
	<li>在每个样本的未抛光表面标记唯一的识别编码，以确保后续测试过程中方向的一致性。</li>
	<li>在进行基线显微硬度测试前，将样本置于37 °C的蒸馏水中储存24小时。 
	注意：&#160;样本可在37 °C的蒸馏水中储存最多24小时后再进行基线测试。</li>
</ol>
3. 基线显微硬度测量
<ol>
	<li>按照已发表的实验方案，使用维氏显微硬度计进行基线维氏显微硬度测试（VHN）11。</li>
	<li>施加200 g载荷，保持15秒。</li>
	<li>每个试样制作三个压痕，压痕间距至少为1 mm。压痕应位于每个试样的中心表面区域，以避免边缘效应。</li>
	<li>计算基线VHN的平均值。</li>
	<li>由同一名经过校准的操作人员完成测量，以尽量减少变异。 
	注意：试样在浸入前可在37 °C的蒸馏水中储存最多24小时。</li>
</ol>
4. 浸泡介质的制备
<ol>
	<li>制备两种乳清蛋白配方：使用市售粉末制备乳清蛋白浓缩物（WC）和乳清蛋白分离物（WI）。</li>
	<li>将25 g乳清蛋白粉末溶解于200 mL蒸馏水中（0.125 g/mL），以制备浸渍溶液。</li>
	<li>使用实验室摇床混合溶液60秒，直至完全溶解。</li>
	<li>将溶液在室温下静置5分钟，以减少泡沫形成并确保均匀性。</li>
	<li>浸渍前，使用校准过的数字pH计测量并记录每种溶液的pH值。</li>
	<li>每次浸渍循环前均需新鲜配制乳清蛋白溶液，以确保化学成分一致，并避免蛋白质降解。</li>
	<li>每个样品使用10 mL浸渍溶液，以确保每次循环中样品完全浸没。</li>
</ol>
5. 浸渍步骤
<ol>
	<li>将每个复合组分为三个亚组（n = 10）。</li>
	<li>将标本浸入指定溶液中，每次10分钟，每日两次。浸泡时长与频率应依据先前建立的方案确定 体外 旨在模拟每日重复摄入模式的饮料暴露模型7.</li>
	<li>每次浸渍循环后，用蒸馏水冲洗试样，并将其置于人工唾液中10分钟，以模拟短期唾液暴露。</li>
	<li>在37 °C下两次浸入循环之间，将样本保存在蒸馏水中，直至下一次暴露循环。</li>
	<li>仅对接触乳清的组别执行此操作。对照组在整个实验期间持续置于37 °C的蒸馏水（DW）中。 
	注意： 浸渍程序可在循环之间暂停，并于次日继续，不会影响实验的一致性。</li>
	<li>继续浸渍方案30天。</li>
</ol>
6. 浸入后显微硬度测量
<ol>
	<li>用蒸馏水冲洗样品，并轻轻擦干。</li>
	<li>使用相同的参数（200 g，15 s）进行维氏显微硬度测试。</li>
	<li>记录三个压痕并计算浸入后平均维氏硬度值（VHN）。</li>
	<li>确定每个样品的ΔVHN。</li>
</ol>
7. 统计学分析
<ol>
	<li>采用重复测量方差分析模型分析维氏显微硬度值，将时间点（基线和浸入后）作为组内因素，复合材料类型和浸入溶液作为组间因素。</li>
	<li>在适当情况下，计算ΔVHN值作为描述性结果指标，以表示每个样本显微硬度变化的幅度。</li>
	<li>采用Tukey的诚实显著性差异（HSD）检验进行事后两两比较。</li>
	<li>计算所有组均值的95%置信区间。</li>
	<li>使用偏η²（η2p）报告方差分析结果的效应量。</li>
	<li>使用Welch t检验比较乳清蛋白溶液之间的pH值。</li>
	<li>设定统计学显著性水平为 p &#60; 0.05。</li>
	<li>除绝对ΔVHN值外，使用以下公式计算显微硬度的百分比变化：[(基线VHN − 浸入后VHN) / 基线VHN] × 100。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ferracane JL. Resin composite&#8212;state of the art. Dent Mater. 2011;27(1):29&#8211;38.</li>
	<li>Ilie N, Hickel R. Resin composite restorative materials. Aust Dent J. 2011;56(Suppl 1):59&#8211;66.</li>
	<li>Sideridou ID, Karabela MM, Vouvoudi EC. Dynamic mechanical properties and degree of conversion of light-cured dimethacrylate-based dental resins. Dent Mater. 2008;24(6):737&#8211;743.</li>
	<li>Erdemir U, Yildiz E, Eren MM, Ozel S. Surface hardness evaluation of different composite resin materials. J Dent. 2012;40(1):17&#8211;22.</li>
	<li>Aliping-McKenzie M, Linden RWA, Nicholson JW. The effect of Coca-Cola and fruit juices on the surface hardness of glass-ionomers and composite resins. J Oral Rehabil. 2004;31(11):1046&#8211;1052.</li>
	<li>Tahmassebi JF, Duggal MS, Malik-Kotru G, Curzon MEJ. Soft drinks and dental health: A review of the current literature. J Dent. 2006;34(1):2&#8211;11.</li>
	<li>Borges AFS, Caneppele TMF, Luz MAAC, Pucci CR. Effect of acidic drinks on surface roughness and microhardness of composite resins. J Appl Oral Sci. 2014;22(6):547&#8211;553.</li>
	<li>Ehlen LA, Marshall TA, Qian F, Wefel JS, Warren JJ. Acidic beverages increase the risk of in vitro. tooth erosion. Nutr Res. 2008;28(5):299&#8211;303.</li>
	<li>Vasconcelos QDJS, Bachur TPR, Arag&#227;o GF. Whey protein supplementation and its potentially adverse effects on health: a systematic review. Appl Physiol Nutr Metab. 2021;46(1):27&#8211;33.</li>
	<li>Kaur N, Nikhil V. Do whey protein beverages affect the microhardness of composites? A laboratory study. J Conserv Dent. 2022;25(1):72&#8211;77.</li>
	<li>Garc&#237;a-Contreras R, Scougall-Vilchis RJ, Acosta-Torres LS, Arenas-Arrocena MC, Garc&#237;a-Gardu&#241;o R, de la Fuente-Hern&#225;ndez J (2015) Vickers microhardness comparison of 4 composite resins with different types of filler.&#160;J Oral Res. 4(5):313&#8211;320.&#160;</li>
	<li>Ferracane JL. Hygroscopic and hydrolytic effects in dental polymer networks. Dent Mater. 2006;22(3):211&#8211;222.</li>
	<li>Ilie N, Hickel R. Investigations on mechanical behaviour of dental composites. Clin Oral Investig. 2009;13(4):427&#8211;438.</li>
	<li>Lussi A, Jaeggi T. Erosion&#8212;diagnosis and risk factors. Clin Oral Investig. 2008;12(Suppl 1):S5&#8211;S13.</li>
	<li>Hannig M, Joiner A. The structure, function and properties of the acquired pellicle. Monogr Oral Sci. 2006;19:29&#8211;64.</li>
</ol>

所有作者声明均无利益冲突。

本实验方案提供了一种标准化方法，用于评估乳清蛋白饮料对树脂复合材料显微硬度的化学影响。关键步骤包括制备均匀的试样、控制光照固化条件以及采用标准化的维氏硬度测试参数。保持试样尺寸和固化强度的一致性至关重要，因为这些因素的差异可能会影响材料的转化程度和机械稳定性。此外，严格控制浸泡时间和温度可确保实验结果的可重复性，并减少与水分吸收和聚合物松弛过程相关的变异性12,13。
根据研究目的，可采用多种修改方案。例如，可通过调整浸入频率和持续时间来模拟不同的暴露条件7。常见问题的排查需注意避免在显微硬度测试过程中发生脱水，并确保各压痕之间有足够的间距，以防止测量时相互干扰。若出现硬度读数不一致的情况，可能源于表面不平整，因此强调标准化表面处理的重要性，包括在复合材料放置过程中使用载玻片以及后续的抛光步骤3。
尽管该方案具有可重...

树脂复合材料修复体的长期成功率取决于其对复杂口腔环境挑战的抵抗能力，包括机械负荷、饮食暴露和化学降解1,2。纳米杂化树脂复合材料因其优异的美学性能和力学性能而被广泛应用，尤其是表面显微硬度，它是衡量材料耐磨性和结构劣化抵抗能力的重要指标3,4。
既往研究表明，接触酸性饮料（如果汁、碳酸饮料和能量饮料）会通过降低表面显微硬度和改变表面完整性，对复合树脂修复体产生不利影响5,6,7,8。这些降解效应受多种因素影响，包括pH值、暴露时间以及填料-基质组成。然而，大多数现有的实验模型依赖于高酸性溶液，可能无法准确反映当代饮食习惯中所遇到的化学挑战。
相比之下，乳清蛋白饮料因其营养价值以及在注重健身的人群中日益增长的消费而广受欢迎9,10。尽管这类饮料接近中性pH值，但其含有乳糖、蛋白质及其他可能与树脂基质发生相互作用并影响材料稳定性的有机成分。因此，评估其影响需要采用一种不仅考虑酸度，还需兼顾有机成分组成及重复暴露模式的实验方案。
本实验方案的总体目标是提供一种标准化且可重复的 体外 评估乳清蛋白饮料（特别是浓缩物和分离物配方）对纳米杂化树脂复合材料表面显微硬度影响的方法。该方法通过循环浸渍实现对日常饮食暴露的可控模拟，从而提高实验的相关性 体外 测试条件
与传统的酸性饮料暴露模型相比，本方案具有多项优势。首先，该方法可在接近中性的pH条件下研究材料的降解行为，从而评估材料在非酸性驱动效应下的响应特性。其次，循环浸润设计更能真实反映实际饮用习惯。第三，该方法有助于基于填料含量和树脂基质组成等结构特征，对不同复合材料配方进行比较评价。
该方案特别适用于旨在评估修复材料在营养相关条件下化学稳定性的研究人员，以及研究饮食成分与牙科生物材料相互作用的相关研究。该方案也可进行调整，用于测试替代性饮料配方、表面处理方法或新开发的复合材料。

<table><tbody><tr><td>氧化铝抛光片&amp;nbsp;</td><td>RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., Istanbul, Turkey</td><td>5714</td><td>中等、细、超细，用于修整和抛光</td></tr><tr><td>分析天平</td><td></td><td></td><td>用于称量材料</td></tr><tr><td>人工唾液溶液</td><td>DIN 53160-1, Testonic Laboratory, Istanbul, Turkey</td><td></td><td>用于浸泡循环之间的储存</td></tr><tr><td>数字pH计</td><td>Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA</td><td>HI2211</td><td>饮料pH值的测量</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>&amp;nbsp;未指明</td><td>不适用</td><td>用作对照溶液及试样储存</td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Ningbo Trueline Imp. &amp; Exp. Co., Ltd, Zhejiang, China</td><td>7102</td><td>用于在复合材料填充过程中获得平整的试样表面</td></tr><tr><td>量筒</td><td>&amp;nbsp;未指明</td><td>不适用</td><td>用于测量液体体积</td></tr><tr><td>高填充纳米杂化树脂复合材料（EA）</td><td>Estelite Asteria (Tokuyama Dental, Tokyo, Japan)</td><td>10942</td><td>用作修复材料；填料含量和树脂基质组成不同</td></tr><tr><td>恒温培养箱&amp;nbsp;</td><td>Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany&amp;nbsp;</td><td>UN55</td><td>用于在37 &amp;deg;C下储存</td></tr><tr><td>可注射纳米杂化树脂复合材料（GUI）</td><td>G-&amp;aelig;nial Universal Injectable (GC Corporation, Tokyo, Japan)</td><td>12365</td><td>用作修复材料；填料含量和树脂基质组成不同</td></tr><tr><td>实验室烧杯</td><td>&amp;nbsp;未指明</td><td>不适用</td><td>用于乳清蛋白溶液的配制</td></tr><tr><td>实验室摇床</td><td>&amp;nbsp;未指明</td><td>不适用</td><td>用于溶液的混合与均质化</td></tr><tr><td>LED光固化仪和光强计&amp;nbsp;</td><td>Woodpecker LED固化仪 (Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., Guangxi, China)</td><td>FD-300</td><td>用于聚合及&amp;nbsp;光强验证</td></tr><tr><td>微型电机手机</td><td>FX205, NSK Ltd., Kanuma, Japan</td><td>C1056002</td><td>用于抛光操作</td></tr><tr><td>中等填充纳米杂化树脂复合材料（FU）</td><td>Filtek Universal (3M ESPE, St. Paul, MN, USA)</td><td>6570A2</td><td>用作修复材料；填料含量和树脂基质组成不同</td></tr><tr><td>硅胶模具&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;未指明</td><td>不适用</td><td>圆盘形，直径6 mm &amp;times; 厚度2 mm，用于试样制备</td></tr><tr><td>维氏显微硬度测试仪</td><td>HMV, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan</td><td>HMV-G31</td><td>维氏硬度值（VHN）测试</td></tr><tr><td>乳清蛋白浓缩粉</td><td>Whey Protein Strawberry Flavor, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkey</td><td></td><td>乳糖含量：约1&amp;ndash;2%，蛋白质含量：约85&amp;ndash;90%</td></tr><tr><td>乳清蛋白分离粉</td><td>Isolate Whey Chocolate Flavor, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkey</td><td></td><td>乳糖含量：约4&amp;ndash;6%，蛋白质含量：约70&amp;ndash;80%</td></tr></tbody></table>

标准化的 体外 评估乳清蛋白饮料暴露后纳米杂化树脂复合材料表面显微硬度变化的实验步骤

A Standardized In Vitro Procedure For Evaluating Surface Microhardness Changes In Nanohybrid Resin Composites After Whey Protein Beverage Exposure

本项体外研究旨在评估不同乳清蛋白饮料对三种纳米杂化树脂复合材料表面显微硬度的影响。共制备90个盘状试件，分别来自三种纳米杂化树脂复合材料（每种材料n = 30），并根据浸泡介质进一步分为三组（每组n = 10）：乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白和蒸馏水。试件每日浸泡两次，每次10分钟，持续30天。使用维氏显微硬度计在基线水平及浸泡后测量表面显微硬度，并以ΔVHN计算硬度变化。采用双因素重复测量方差分析及事后检验对数据进行分析。结果显示，复合材料类型、浸泡溶液及其交互作用对ΔVHN值具有统计学显著影响（p &#60; 0.0001）。在接触乳清浓缩蛋白的可注射型复合材料中观察到最大的硬度损失（ΔVHN：10.4 ± 2.1），而在蒸馏水中储存的高填料含量复合材料中记录到最小的变化（ΔVHN：0.9 ± 0.4）。与蒸馏水相比，所有复合材料在乳清浓缩蛋白中浸泡后均表现出显著更大的硬度损失（p &#60; 0.05）。除高填料含量复合材料外，乳清分离蛋白也导致所有复合材料的硬度损失显著增加；在高填料含量复合材料中未观察到统计学显著差异（p = 0.076）。这些结果表明，乳清蛋白饮料可能降低树脂复合材料的表面显微硬度，其降解程度取决于材料组成和饮料配方。

描述性统计
复合材料-溶液组合的平均ΔVHN（±标准差）值见表1。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>树脂复合材料</td>
			<td>溶液</td>
			<td>ΔVHN（均值 ± 标准差）</td>
			<td>95% 置信区间</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">EA</td>
			<td>蒸馏水</td>
			<td>0.9 ± 0.4a</td>
			<td>0.61–1.19</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	...

本方案描述了一种标准化的 体外 评估乳清蛋白饮料对树脂复合材料显微硬度影响的方法。该方法通过循环浸泡和维氏硬度测试实现对饮食暴露的可控评估，为研究营养饮料与修复性生物材料之间的相互作用提供了一种可重复的模型。

本项体外研究的目的是评估不同乳清蛋白饮料对三种纳米杂化树脂材料表面显微硬度的影响。

我们研究乳清蛋白饮料对非混合型树脂复合材料表面显微硬度的影响。现有方法如标准设计的饮料暴露条件限制了可重复性。本方案建立了可控的暴露条件，能够对树脂复合材料进行可靠且可比较的显微硬度评估。首先，从三种纳米杂化树脂复合材料中总共制备90个圆盘形试件。使用圆柱形透明硅胶模具制备试件。将复合材料以单层2毫米厚度的增量填入模具中。用透明的显微镜盖玻片覆盖表面，以获得一个平整的表面。使用蓝光LED光固化仪在距离表面约1毫米处，以每平方厘米1,000毫瓦的强度照射20秒，使试样聚合。每次聚合循环前，需用辐射计检测光固化仪的光强，以确保光照暴露的一致性。将制备好的试样保存在蒸馏水中，以完成后聚合反应并模拟口腔环境。使用中等、精细和超精细的氧化铝浸渍磨盘，在水冷却条件下，以10,000转/分钟的速度，施加轻压并采用单向旋转运动，依次对所有试样的上表面各抛光10秒。每处理五个试样后更换一次抛光盘，以保持一致的研磨效率并确保表面标准化。每次抛光步骤后，用蒸馏水冲洗样品10秒以去除碎屑。在进入下一片之前，用空气轻轻吹干样品5秒。在每个样品的未抛光表面标记唯一的编码以确保方向一致，并在进行基线显微硬度测试前将其保存在蒸馏水中。使用维氏硬度计进行基线维氏显微硬度（VHN）测试，加载200克，保持15秒。每个试样制作三个压痕，各压痕之间间距至少1毫米。压痕应位于每个试样的中心表面区域，以避免边缘效应。以单个经过校准的操作员完成所有测量，计算每个样本的平均基线维氏硬度值（VHN），以尽量减少变异性。将25克乳清蛋白粉溶解于200毫升蒸馏水中，制备浸渍溶液。使用实验室摇床混合溶液60秒，直至完全溶解。让溶液在室温下平衡五分钟，以减少泡沫形成并确保均匀性。浸入前使用校准过的数字pH计测量并记录每种溶液的pH值。每次浸入循环前均需配制新鲜的乳清溶液，以确保化学成分一致并避免蛋白质降解。每个样本使用10毫升浸提液，以确保每个循环过程中样本完全浸没。将每个复合组分为三个亚组，每组包含10个样本。根据反映日常饮用模式的体外饮料暴露模型，每天两次将样本浸入指定溶液中，每次10分钟。对于乳清暴露组，每次浸入循环后，用蒸馏水冲洗试样。将试样置于人工唾液中10分钟，以模拟短期唾液暴露。在浸入循环之间，将试样储存于37摄氏度的蒸馏水中，并持续执行30天的浸入方案。用蒸馏水冲洗样品，并轻轻擦干。按照之前演示的方法进行维氏显微硬度测试（VHN），并计算每个样品浸入后的平均VHN值。确定每个样品的VHN变化值（即ΔVHN）。采用重复测量方差分析模型（ANOVA）分析VHN值，以时间点作为组内因素，复合材料类型和浸泡溶液作为组间因素。在适当情况下，计算ΔVHN值作为描述性结果指标，以表示每个样本显微硬度变化的幅度。采用Tukey's Honestly Significant Difference检验进行事后两两比较。计算所有组均值的95%置信区间，并使用偏η²报告方差分析结果的效应量。采用Welch t检验比较乳清蛋白溶液之间的氢电势值，并设定分析的统计学显著性水平。除VHN值的绝对变化外，还需根据提供的公式计算显微硬度的百分比变化。蒸馏水储存的高填充复合树脂微硬度变化最小，而接触乳清浓缩蛋白的可注射复合树脂微硬度变化最大。与蒸馏水相比，乳清蛋白溶液导致更显著的硬度下降。然而，在高填充复合树脂中，乳清分离蛋白组间差异无统计学意义。乳清浓缩物浸泡导致所有测试复合材料的显微硬度损失显著大于蒸馏水组。暴露于乳清分离蛋白的试样也显示出比储存于蒸馏水中的试样更高的ΔVHN值。该方法可使研究人员量化膳食蛋白饮料对修复材料显微硬度变化的影响。执行本方案时最重要的考虑因素是保持样本制备的一致性以及控制浸渍条件，以确保结果的可靠性。未来的研究可进一步探讨其他饮料种类、更长的暴露时间以及其他材料特性。

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