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作者感谢耶鲁大学的Raymond Quiñones Alvarado、麻省总医院拉贡研究所（Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard）的Yitong Chen、汉堡-埃彭多夫大学医学中心感染与疫苗开发研究所（Institute for Infection and Vaccine Development, University Medical Center Hamburg-Eppendorf）的Angelique Hoelzemer和Katharina Schiering，以及麻省总医院和哈佛医学院（Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School）的Abner Louissaint、Jessica Duffy、Genna Mullen和Gail Newton在科学与技术方面的建议以及富有见地的讨论。作者还感谢拉贡研究所流式细胞术核心实验室（Ragon Institute Flow Cytometry Core）的Michael Waring、Kat Folz-Donahue和Nathalie Bonheur提供的专业技术支持。W.F.G.-B. 的研究得到麻省总医院拉贡研究所、麻省总医院病理科以及美国国立卫生研究院院长创新奖（National Institutes of Health Director’s New Innovator Award，项目编号DP2CA311214）的支持。J.O.T. 受Kinghorn基金会资助，为富布赖特未来研究生奖学金（Fulbright Future Postgraduate Scholarship）获得者。

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W.F.G.-B. 因2025年在BioSciences.sas举办的光谱流式细胞术科学报告而获得酬金。作者声明无其他竞争性财务或非财务利益。

这些实验方案提供了两种互补的方法，用于在标准化的96孔板体系中定量自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒性。步骤1采用实时活细胞成像技术，持续监测靶细胞的丢失情况，适用于评估天然杀伤及CAR介导的杀伤在多个效靶比（E:T）条件下的动力学特征。步骤2则利用流式细胞术，在设定的共孵育时间后定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），同时分离靶细胞与效应细胞，以便进行表型分析17。这些方法作为可互补的检测平台，可用于模拟不同的生物学过程，且彼此之间易于互换。原代人NK细胞可用于基于活细胞成像的ADCC检测，也可经工程化改造后用于流式细胞术中的CAR介导杀伤检测。此外，尽管野生型NK-92细胞缺乏CD16表达18，但通过引入CD16（例如通过慢病毒转导）可使NK-92细胞高效介导ADCC。因此，这两种检测方法均可根据具体的科研与转化需求进行定制化调整。
在两种检测中，有几个步骤对可重复性尤为重要。效应细胞的数量和表型的微小变化都可能显著改变靶细胞的存活情况。准确的细胞计数以及铺板过程中的充分重悬，对于减少细胞计数偏差和混合不均至关重要。同样，细胞制备在不同实验之间必须保持一致，包括细胞活力、恢复时间以及先前的细胞因子暴露情况，以确保效应细胞功能的一致性。培养板的几何形状也是影响检测性能的关键因素。在活细胞成像流程中，平底包被板有利于稳定的图像采集和一致的视野分析；而在流式细胞术流程中，圆底板有助于细胞间的接触，并便于在实验终点回收非贴壁的共培养细胞。此外，在检测前必须确认荧光标记的质量，因为成像过程中靶细胞区分不佳或流式细胞术中CFSE信号分离不充分，都会影响定量结果和数据分析的准确性。
这两种工作流程具有不同的技术考量。在活细胞成像实验中，数据质量不佳的常见原因包括细胞铺板不均、细胞密度过高或聚集，以及图像分析阈值设置不理想，这些问题均易于纠正。这些因素可能导致细胞计数失真，并造成随时间推移的追踪结果不一致。在基于流式细胞术的实验中，结果不理想的情况更多是由于靶细胞背景死亡率过高、靶细胞与效应细胞群体分离效果差、抗体染色效果不佳，或重复孔之间的移液操作不一致所致。由于这些实验旨在进行比较分析，因此必须包含适当的内部对照以支持结果解读，包括用于归一化的仅靶细胞对照，以及与抗体或CAR特异性条件相匹配的阴性对照。
在使用这些方法时，必须考虑一些共有的以及特定检测所固有的局限性。活细胞成像检测可提供时间分辨率，但其结果依赖于准确的荧光标记和图像分析参数，而这些因素可能受到共培养过程中细胞聚集成簇、光谱重叠或细胞形态变化的影响。15在某些情况下，特别是当检测涉及原代效应细胞时，实现充分的荧光标记而不改变杀伤动力学可能较为困难或不可行。基于流式细胞术的检测可在特定终点提供较高的表型分辨率，但除非采集多个匹配的时间点数据，否则无法独立区分早期与晚期杀伤，而多时间点检测可能成本较高且耗时。17此外，终点检测结果可能不仅反映靶细胞死亡，还可能体现靶细胞增殖、效应细胞损耗或样本处理过程中恢复情况的差异。因此，CD107a等机制性读数应被视为效应细胞活化的补充指标，而非靶细胞清除的直接替代参数。19更广泛地说，这两种平台均未能完全重现塑造自然杀伤细胞功能的空间结构、基质相互作用、细胞因子梯度以及迁移限制。 体内
在解读自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤实验时，还需考虑多种生物学因素。供体间的个体差异是使用原代人NK细胞进行实验时固有的问题，这种差异源于供体的年龄、性别、感染病史以及受体多态性，导致NK细胞的细胞毒潜力和亚群组成存在不同20。使用NK-92细胞可显著降低变异性，但这些细胞仍可能因来源和传代次数不同而产生变化18。本方案通过采用标准化参数并在同一块板内进行比较，以减轻技术或实验差异，从而更准确地评估这些生物学因素。在可行的情况下，我们建议使用特定传代范围的NK-92细胞，并设定固定的活力阈值。对于原代NK细胞，每个实验条件应使用来自多个供体的NK细胞，并在统计分析中考虑供体间的变异性（例如采用配对分析或混合效应模型），因为不同条件之间的相对差异通常在不同供体间保持一致。此外，可在用于流式细胞术的抗体组合中加入其他NK细胞标志物（如KIRs、NKG2A/C/D和CD57），以比较不同供体间NK细胞亚群的频率，并评估特定亚群的NK细胞活化情况（即CD107a和CD69的表达），从而进一步促进结果的解读。最后，在所有NK细胞杀伤实验中，还需考虑某些额外情况。NK细胞本身可能表达被靶向的抗原，这种表达可能是内源性的，也可能是通过胞啃作用（trogocytosis）从靶细胞获得抗原所致，从而导致NK细胞的自相残杀（fratricide），干扰实验结果。例如，达雷妥尤单抗（daratumumab）可靶向NK细胞表面表达的CD38并诱导自相残杀21，从而限制对预期靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）效应强度。幸运的是，活细胞成像和流式细胞术可用于定量NK细胞，以评估自相残杀的发生情况。
尽管存在这些局限性，活细胞成像与流式细胞术的联合使用为在多种基础和临床前应用中进行可重复的自然杀伤细胞（NK细胞）功能检测提供了一个实用的框架。当需要关注时间动态行为时，成像流程具有优势，例如区分快速与延迟的细胞毒反应，或比较不同CAR设计之间的杀伤动力学22。当需要在同一份样本中将功能读数与效应细胞和靶细胞的表型信息结合分析时，基于流式细胞术的流程则更具优势。这两种方法共同实现了对自然杀伤、CAR介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的定量评估，并可依托广泛可用的实验平台完成。通过建立标准化且可扩展的检测体系，该系统有助于对基于NK细胞的各种治疗模式进行严格的基准测试和机制研究，从而加速新一代免疫疗法的开发及其向临床应用的转化。

自然杀伤细胞（NK细胞）是一类先天性淋巴细胞，在针对病毒感染细胞和恶性细胞的免疫监视中发挥核心作用，具有快速而强大的细胞毒性1。与B细胞和T细胞不同，NK细胞不表达抗原特异性受体，而是依赖一系列活化性和抑制性受体来识别主要组织相容性复合体I类分子（MHC I）表达的缺失或细胞应激状态。这使得NK细胞能够通过释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，或在某些情况下通过激活死亡受体，介导直接细胞毒性作用1,2,3,4。除了天然细胞毒性外，NK细胞还表达FcγRIII（CD16），该受体可识别免疫球蛋白G（IgG）的Fc段，并介导针对IgG包被靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）5,6。
由于自然杀伤细胞（NK细胞）具有内在的细胞毒性机制和良好的安全性，其已成为细胞免疫治疗的有力候选者。NK细胞具有异体使用的潜力，可作为一种“即用型”疗法，引发移植物抗宿主病的风险极低，从而提高了临床应用的广泛性并降低了治疗成本7。近年来，通过基因工程策略进一步拓展了NK细胞的治疗潜力，包括引入嵌合抗原受体（CARs），以引导NK细胞识别特定的肿瘤抗原。CAR-NK细胞在体内&#160;异种移植模型和临床试验中均表现出抗肿瘤疗效，且相较于CAR-T细胞具有更低的毒性8,9,10。因此，开发工程化NK细胞平台以及基于抗体的治疗策略正受到越来越多的关注。在此背景下，对NK细胞杀伤能力进行准确且定量的测定，对于理解NK细胞生物学特性、评估CAR或其他工程化NK细胞疗法的疗效，以及评价依赖抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的单克隆抗体至关重要。
多种体外&#160;实验方法已被实验室广泛用于评估自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒性。常用方法包括放射性铬-51释放实验、乳酸脱氢酶释放实验以及钙黄绿素-乙酰氧基甲基释放实验11,12。尽管这些传统方法已被广泛用于细胞毒性检测，但它们依赖于细胞死亡的间接读数，仅提供终点测量而非动力学数据，且灵敏度和动态范围有限。此外，这些方法无法提供效应细胞表型或活化状态的信息。近年来，活细胞成像平台和流式细胞术的应用日益增多，因其能够直接量化靶细胞存活情况、实时监测杀伤过程，并同时对效应细胞和靶细胞进行表型分析13,14。然而，即使在这些较新的方法中，不同实验室和已发表研究之间仍存在显著差异，包括靶细胞制备方式、效应细胞与靶细胞比例（E:T）、共孵育时间等方面的不一致，限制了实验的可重复性以及研究间的比较，尤其是在基于NK细胞的免疫疗法临床前评估中。
本文介绍了一种利用两个独立且互补的技术平台对自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤活性进行定量评估的标准化操作流程：实时活细胞成像（IncuCyte SX5）和基于流式细胞术的终点检测。活细胞成像技术能够在效应细胞与靶细胞共培养过程中连续监测靶细胞的存活情况，从而在多种效靶比和实验条件下，以最少的实验干预实现对细胞毒性的动力学评估15。相比之下，流式细胞术可对靶细胞死亡提供高灵敏度的终点检测，同时利用多标记染色 panel 对NK细胞和靶细胞进行同步表型分析。
此外，本方案采用了标准化的实验参数，包括效靶细胞比（E:T比）、孵育条件、培养板规格和分析流程，以提高实验的可重复性，并促进不同实验室和研究之间细胞毒性检测结果的比较。该流程可定量评估多种自然杀伤（NK）细胞效应功能，包括天然细胞毒性、CAR介导的杀伤作用以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），并适用于原代人NK细胞及NK细胞系。本方案为NK细胞生物学研究以及基于NK细胞的免疫治疗在临床前阶段的开发提供了实用的研究框架。

<table><tbody><tr><td>高级RPMI-1640培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12633020</td><td>NK-92 和原代人自然杀伤细胞培养用基础培养基（完整配方见实验方案）</td></tr><tr><td>抗人CD107a抗体，PE-Cy7标记（克隆号H4A3）</td><td>BioLegend</td><td>328618</td><td>流式细胞术脱颗粒标志物</td></tr><tr><td>抗人 CD16 抗体，BV785 标记（克隆 3G8）</td><td>BioLegend</td><td>302046</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>抗人CD56抗体，BV421标记（克隆HCD56）</td><td>BioLegend</td><td>318328</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>台式离心机，配备可兼容15 mL离心管和96孔板的摆桶式转子（Eppendorf Centrifuge 5810R）</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td>用于细胞沉淀和培养板离心（100&amp;ndash;300 &amp;times; g)</td></tr><tr><td>羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C34554</td><td>用于靶细胞标记的细胞增殖染料</td></tr><tr><td>Cytek Aurora 光谱流式细胞仪（或同等设备）</td><td>Cytek 生物科学</td><td>N7-00003</td><td>用于流式细胞术的数据采集与分析</td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚）</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>活/死细胞鉴别用核染色</td></tr><tr><td>深孔96孔板</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2110</td><td>用于抗体的制备</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>冷冻保存试剂</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Avantor</td><td>76419-584</td><td>基础培养基添加物；用于FACS缓冲液（2% FBS）</td></tr><tr><td>通用型水浴锅，10 L（37 &amp;deg;C)</td><td>PolyScience</td><td>WBE10</td><td>用于细胞解冻</td></tr><tr><td>GlutaMAX（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充剂）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td>稳定的谷氨酰胺来源</td></tr><tr><td>人AB型血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td>原代人NK细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>IncuCyte SX5 活细胞成像系统</td><td>赛多利斯</td><td>4816</td><td>实时活细胞成像与单细胞分析</td></tr><tr><td>LUNA-FL 双荧光细胞计数仪（或同等产品）</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>自动细胞计数</td></tr><tr><td>Parafilm M（4 英寸 &amp;times; 250英尺卷装</td><td>杰内西</td><td>16-101</td><td>板密封与储存</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），无菌（pH 7.2）&amp;ndash;7.4)</td><td>康宁</td><td>21-020-CV</td><td>用于洗涤和流式细胞术缓冲液的配制</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A3890401</td><td>包被板试剂</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>重组人白细胞介素-2（IL-2）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-500</td><td>细胞因子</td></tr><tr><td>RosetteSep 人NK细胞富集试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>人NK细胞富集试剂盒</td></tr><tr><td>SYTOX Orange 死细胞染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S34861</td><td>活细胞成像用活力染料</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>细胞计数用活力染料</td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1X），无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12604039</td><td>用于贴壁细胞的解离</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA（0.5 M，pH 8.0）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575020</td><td>用于FACS缓冲液的配制</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥底离心管</td><td>康宁</td><td>352097</td><td>无菌的</td></tr><tr><td>24孔组织培养板（组织培养&amp;ndash;处理过的</td><td>康宁</td><td>3524</td><td>用于自然杀伤细胞的回收</td></tr><tr><td>96孔透明圆底板（组织培养）&amp;ndash;处理过的</td><td>康宁</td><td>3799</td><td>用于共培养和流式细胞术检测</td></tr><tr><td>96孔平底透明黑色聚苯乙烯板（组织培养）&amp;ndash;处理过的</td><td>康宁</td><td>3603</td><td>与活细胞成像系统兼容</td></tr></tbody></table>

利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

Quantifying NK-Cell Cytotoxicity Potentiated by Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Antibodies Using Live-Cell Imaging and Flow Cytometry

自然杀伤细胞（NK细胞）是一类先天性淋巴细胞，在抵御多种胞内病原体和癌症的保护性免疫中发挥关键作用。其主要功能是杀伤被感染、恶性转化或被抗体包被的靶细胞，后者通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）实现。NK细胞还可通过基因工程改造，表达嵌合抗原受体（CARs），从而实现对特定抗原的靶向识别。定量检测NK细胞的细胞毒活性对于评估其基础功能以及单克隆抗体和CAR工程策略的临床前评价至关重要。然而，由于在细胞制备、靶细胞类型、效应细胞与靶细胞比例、共孵育时间及检测方法等方面的差异，体外&#160;功能检测在不同实验室之间仍存在高度变异性，限制了实验的可重复性及跨研究间的比较。本文介绍了一种利用流式细胞术和实时活细胞成像技术对NK细胞细胞毒活性进行定量评估的标准化方案。采用96孔板体系，评估人原代NK细胞及表达CAR的NK-92细胞杀伤癌细胞和抗体包被靶细胞的能力，以检测天然细胞毒作用、CAR介导的杀伤作用以及ADCC效应。靶细胞存活率可通过活细胞成像进行连续监测，或在特定时间点通过流式细胞术测定，后者还可同时实现对NK细胞和靶细胞的表型分析。这些方案结合常规的组织培养、成像和流式细胞术方法，为先天免疫及基于NK细胞的免疫治疗研究提供了可重复&#160;量化NK细胞效应功能的可靠框架。

为了实时定量自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒性，将经基因工程改造表达抗BCMA嵌合抗原受体（CAR）的NK-92效应细胞与BCMA+的Ramos靶细胞共同培养于黑色透明平底96孔板中，并通过活细胞成像技术进行监测（图1A 和 补充图1A）。效应细胞以0:1（仅靶细胞）、0.25:1、0.5:1、1:1和2:1的效靶比（E:T）加入，每种条件设三个重复。共评估了三种不同的CAR NK-92构建体：CAR1不含共刺激结构域，CAR2含有4-1BB（CD137）共刺激结构域，CAR3含有DAP10共刺激结构域，同时设置仅表达ZsGreen的对照NK-92细胞。所有效应细胞均通过慢病毒转导生成，如前所述4，使用ZsGreen-P2A-CAR转基因表达盒。Ramos靶细胞同样被携带emiRFP670编码序列的慢病毒载体转导。利用活细胞成像仪每小时监测一次靶细胞的生长和存活情况，持续24小时，分别检测ZsGreen+ NK-92细胞的绿色荧光、SYTOX Orange+死细胞的橙色荧光以及emiRFP670+靶细胞的近红外（NIR）荧光（图1A 和 补充图1B 以及 1C）。
在共培养期间，以特定时间间隔采集显微图像，以观察效应细胞、活靶细胞和死亡细胞（图1B）。对靶细胞生长和存活的定量分析显示，在效靶比（E:T）为1:1时，CAR2和CAR3 NK-92细胞的杀伤动力学快于CAR1 NK-92细胞，尤其在早期时间点更为明显。随着E:T比的升高，靶细胞杀伤作用增强，该现象也见于对照组NK-92细胞，表明其具有天然细胞毒性（图1C）。这些测量结果凸显了活细胞成像技术在捕捉细胞毒活性动态变化方面的优势。此外，在特定时间点，靶细胞存活率还被分析为E:T比的函数，以比较CAR NK-92细胞的杀伤效力。CAR2和CAR3 NK-92细胞在后期时间点的较低E:T比（例如，24小时时E:T = 0.25:1）以及早期时间点的中等E:T比（例如，4小时时E:T = 1:1）下均表现出更强的效力（图1D）。在各项分析中，CAR2与CAR3 NK-92效应细胞之间的杀伤效果未观察到显著差异。
整合效应细胞与靶细胞比例（E:T）、共孵育时间及靶细胞存活率的热图，可全面可视化展示不同效应细胞群中天然及CAR介导的细胞毒性，并实现定量评估。为量化杀伤效力与动力学特征，定义了三个参数：KR50，即在12小时实现50%杀伤时的杀伤细胞与靶细胞比例；KT50，即在E:T比为1:1时实现50%杀伤所需的共孵育时间；以及IKI50，即综合杀伤指数，表示热图中低于50%存活率区域的面积，由50%存活率的等值线界定（图1E）。这些指标可用于比较CAR-NK-92细胞的杀伤效力（KR50）、杀伤动力学（KT50）以及综合细胞毒性能（IKI50）（图1F）。该分析展示了本实验方法如何在单次实验中对多种工程化NK细胞平台进行多参数的定量比较。
通过将荧光标记的靶细胞与原代人自然杀伤（NK）细胞共培养，并在存在或不存在治疗性抗体的情况下孵育16–18小时后，利用流式细胞术结合细胞计数定量残留的活靶细胞群体，以检测抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）（图2A）。可使用配备高通量进样器的流式细胞仪，例如Cytek Aurora、BD Symphony或BD Fortessa。在代表性实验设置中（补充图2），将CD38+患者来源的淋巴瘤靶细胞接种于圆底96孔板中，并向相应孔中加入达雷妥尤单抗（或同型对照抗体）。随后以0.5:1的效靶比（E:T）加入NK细胞进行共培养，该比例针对此类靶细胞优化，旨在最小化自然杀伤效应的同时仍可检测到ADCC活性。孵育结束后，通过前向散射和侧向散射进行流式细胞术分析以区分细胞群体，利用DAPI排除非活细胞事件，并将CFSE+靶细胞与CD56+CD16+ NK细胞分离开来，以便并行分析（图2B）。该实验设计可实现细胞毒性效应的同步测定与表型特征分析。
<img alt="NK细胞实验设置；ADCC实验结果；流式细胞术图示；细胞存活与脱颗粒。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71377/71377fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2．基于流式细胞术的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）实验可同时定量分析靶细胞存活率和NK细胞活化状态。（A）ADCC实验的示意图。将CFSE标记的CD38+淋巴瘤靶细胞以每孔2.5 × 104个细胞的密度接种，并在五种条件下培养：仅靶细胞；靶细胞加达雷妥尤单抗（25 µg/mL）；靶细胞加NK细胞（E:T = 0.5:1）；靶细胞加NK细胞和达雷妥尤单抗；以及靶细胞加NK细胞和同型对照抗体（25 µg/mL）。 （B）代表性流式细胞术设门策略。首先根据前向散射光和侧向散射光设门，随后通过DAPI排除非活细胞。靶细胞定义为CFSE+事件，NK细胞定义为CD56+且CD16+事件。NK细胞脱颗粒通过CD107a表达水平进行评估。 （C）靶细胞存活率的定量结果，以仅含靶细胞的对照组为100%进行归一化表示。 （D）NK细胞脱颗粒的定量结果，以NK细胞群中CD107a+细胞所占百分比表示。柱状图表示均值 ± 标准差，叠加的点代表独立重复孔（n = 3）。统计分析采用单因素方差分析，结合Tukey事后多重比较检验。统计学显著性标注如下：*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71377/71377fig2largev1.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
主要终点是靶细胞存活率，通过活细胞CFSE+门控内计算，并以仅含靶细胞组（设为100%存活率）进行归一化处理。该归一化可校正靶细胞的自发性丢失，从而实现不同实验条件间的直接比较。在代表性数据中（图2C），单独加入达雷妥尤单抗并未降低靶细胞存活率，表明该抗体在无效应细胞存在时对靶细胞活力无直接作用。仅与NK细胞共培养时，靶细胞存活率降至约70%，提示基础水平的自然细胞毒性。加入达雷妥尤单抗后，存活率进一步降至约37%，符合抗体介导杀伤作用增强的结果；而同型对照组的存活率约为62%，与仅NK细胞组相当。成功的实验在抗体处理组与对照组之间表现出明显差异，且重复样本间具有高度可重复性。
NK细胞的二次表型分析可进一步验证靶细胞杀伤与效应细胞活化之间的关联。NK细胞脱颗粒（以CD107a+ NK细胞百分比表示）在无抗体的NK细胞-靶细胞共培养条件下最低，在达雷妥尤单抗处理组中最高（约31%），同型对照组则呈现中等水平的脱颗粒（约19%），支持抗体介导的活化作用（图2D）。这些结果表明，该检测方法能够区分靶细胞杀伤与效应细胞活化。尽管脱颗粒与细胞存活趋势总体一致，但二者并不完全重合，提示它们代表的是相关但不同的生物学过程。
次优实验通常表现为不同条件之间的区分度降低、各孔间细胞计数的变异性增大、对照孔中靶细胞死亡率升高、CFSE染色较弱或背景脱颗粒水平升高。这些结果可能源于靶细胞活力不佳、NK细胞回收不一致、混匀不充分，或染色与采集过程中的变异性。由于该检测方法能够独立识别靶细胞和效应细胞群体，因此可进一步扩展以包括对靶细胞的额外表型分析（例如抗原密度或配体表达）以及更全面的NK细胞特征鉴定。加入“仅NK细胞”组可进一步量化基础脱颗粒水平及NK细胞活力。这种多参数设计是一个关键优势，可将功能性的细胞毒性结果与机制性免疫表型联合解读。
补充图1. 活细胞成像细胞毒性实验的代表性孔板布局与分析流程。（A）CAR-NK细胞杀伤实验的代表性96孔板布局。四种效应细胞条件按象限排列，每种条件在E:T比值0:1（仅靶细胞对照）、0.25:1、0.5:1、1:1和2:1下进行测试，每个条件设三个复孔（共60个检测孔）。（B）IncuCyte 2021C软件中非贴壁细胞单细胞分析的代表性配置，展示用于识别单个效应细胞和靶细胞并排除碎片与聚集体的光谱解混、分割及掩膜参数。（C）采用近红外（NIR）与SYTOX Orange荧光的单细胞分类设门策略示意图，用于定义活靶细胞群体。通过仅含靶细胞的孔和共培养孔在某一时间点（t = 4 h）的数据，验证活细胞与死细胞群体的分离效果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71377/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2. 基于流式细胞术的ADCC检测代表性孔板布局。该96孔板布局示意图展示了在B–D行、2–6列范围内设置的五种实验条件，每种条件设三个复孔（总检测孔数 = 15）：（1）仅靶细胞对照，（2）靶细胞加达雷妥单抗（daratumumab），（3）靶细胞加NK细胞，（4）靶细胞加NK细胞和达雷妥单抗，以及（5）靶细胞加NK细胞和同型对照抗体。靶细胞接种量为每孔2.5 × 104 个细胞，NK细胞以每孔1.25 × 104 个细胞加入，使效靶比（E:T）达到0.5:1。抗体终浓度为25 µg/mL。周围孔中加入PBS以减少蒸发。仅靶细胞组用于归一化靶细胞存活率，同型对照用于排除抗体制剂本身对结果的影响，而不涉及抗原特异性。根据靶细胞系的敏感性不同，可能需要优化效靶比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71377/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案提供了一种标准化的 体外 使用活细胞成像和流式细胞术对人体自然杀伤细胞的天然、嵌合抗原受体介导及抗体依赖性细胞毒性的稳定检测流程

自然杀伤（NK）细胞是一类先天性淋巴细胞，在抵御多种胞内病原体和癌症的保护性免疫中发挥关键作用。

本实验室研究自然杀伤细胞在健康与疾病中的作用，旨在利用其潜力以改进实体瘤和血液系统肿瘤的治疗方案。现有的自然杀伤细胞毒性检测方法在不同平台和实验设置之间缺乏标准化。本方案提供了可重复的活细胞成像和流式细胞术方法，用于准确评估细胞毒性。首先，在15毫升锥底离心管中，将SYTOX Orange储存液用NK-92培养基稀释，配制10毫升2倍浓度的SYTOX Orange工作液。加入台盼蓝染液混匀后，使用Luna计数仪对靶细胞进行计数，或采用任何经过验证的基于染料排除法的细胞计数方法。将所需数量的靶细胞转移至15毫升锥底离心管中。将离心管在室温下以300G离心五分钟，弃去上清液。然后将目标细胞重悬于2倍浓度的SYTOX Orange培养基中，调整终浓度为每毫升250,000个细胞。制备效应细胞时，需评估NK-92细胞的活力和浓度，只有当细胞活力高于80%时方可继续实验，因为较低的细胞活力可能影响检测结果。将所需数量的NK-92细胞计数后转移至若干个15毫升圆锥形离心管中。离心后，重悬细胞至终浓度为每毫升500,000个细胞。为实现效应细胞与靶细胞2:1的比例，取240微升效应细胞加入96孔圆底培养板的孔中作为效应细胞稀释液，其余孔中各加入120微升培养基。从效靶比2:1开始，进行两倍系列稀释至1:1、0.5:1和0.25:1，每次稀释均需用移液器反复吹打至少五次以充分混匀，并在每次转移时更换吸头。接下来，准备共培养体系，取预先包被多聚赖氨酸的平底96孔板。在细胞转移前立即轻轻重悬靶细胞和效应细胞，避免产生气泡，然后将每种细胞悬液各100 µL加入相应的孔中。然后，向周围未使用的孔中加入 200 µL PBS。在室温下以 100 × g 离心 2 分钟。将培养板放入活细胞成像系统中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，每1小时获取一次图像，持续24小时。首次扫描后验证图像质量，并根据需要调整成像参数。调整光谱分离以校正SYTOX Orange在绿色通道中的溢出。确认橙色阳性死细胞未被误识别为绿色阳性细胞。为配置非贴壁细胞的单细胞分析，将预期目标直径设为15 µm，以匹配细胞的近似直径。将阈值灵敏度和纹理灵敏度设为5，边缘灵敏度设为10，以促进细胞簇的分离。将接受的对象面积滤波范围设置为 50 至 2,000 平方微米，以排除碎片和较大的物体。将偏心率最大值设置为 0.95，以排除非细胞对象。获取已培养 16 至 24 小时的原代人 NK 细胞。将500,000个靶细胞转移至一个15毫升圆底离心管中。用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。在室温下以300×g离心5分钟。然后去除上清液。通过将1微升5毫摩尔的CFSE储备液加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制0.5微摩尔的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）工作液。将获得的细胞沉淀重悬于CFSE溶液中，浓度约为每毫升100万个细胞。将细胞在 37 摄氏度条件下避光孵育 15 分钟，孵育容器用铝箔包裹以避光。然后加入五到十倍体积的培养基终止反应，并在 37 摄氏度下继续孵育 5 分钟。离心细胞后，将细胞沉淀重悬，调整细胞密度至每毫升 250,000 个细胞，使 100 微升体系中含有 25,000 个细胞。使用多通道移液器，向圆底96孔板中指定的孔每孔加入100微升靶细胞。每个条件设三个复孔。接下来，用NK细胞培养基为每种检测抗体及相应的同型对照分别配制200微升4倍浓度的抗体溶液。将抗体溶液转移至深孔板中。向每孔含有靶细胞的孔中加入50微升抗体溶液，并通过上下吹打至少五次充分混匀。向无抗体对照孔中每孔加入50微升自然杀伤细胞培养基，并通过吹打充分混匀。在标准培养条件下孵育平板25至30分钟。计数并获取200,000个NK细胞，仅当细胞活力大于或等于75%时继续实验。将细胞重悬于800微升人原代NK细胞培养液中，浓度为每毫升250,000个细胞。每孔加入50微升NK细胞悬液至相应孔中，通过上下吹打至少5次充分混匀。接下来，向对照孔中每孔加入 50 微升培养基，并充分混匀。仔细检查圆底 96 孔板，确认所有孔中液体体积均为 200 微升，弯月面水平一致且无气泡。将板在 100 × g 条件下离心 2 分钟，随后在标准培养条件下孵育 16 至 18 小时。将培养板在300G条件下离心5分钟，弃去上清液。用荧光激活细胞分选缓冲液（FACS缓冲液）洗涤所有孔，每孔200微升。在FACS缓冲液中配制表面抗体主混合液，配制方案如下所示。将细胞重悬于每孔50 µL抗体混合液中，通过上下吹打至少五次充分混匀。用铝箔纸包裹微孔板，于4°C避光孵育15分钟。每孔加入150 µL FACS缓冲液。离心后，将细胞重悬于每孔100 µL含5 µM DAPI的FACS缓冲液中。立即进行流式细胞术检测，无需在上机前进行孵育。使用Cytek Aurora仪器进行流式细胞术检测，并记录CFSE、BV421、BV785、PE-Cy7、DAPI以及任何其他荧光染料的荧光通道信号。共培养期间，使用实时活细胞显微镜观察效应细胞、活靶细胞和死亡细胞。在效应细胞与靶细胞比例相等的情况下，尤其是早期时间点，CAR2和CAR3-NK-92细胞的杀伤动力学快于CAR1-NK-92细胞。随着效应细胞与靶细胞比例的升高，靶细胞杀伤作用增强，包括表现出天然细胞毒性的对照NK-92细胞。CAR2 和 CAR3 NK-92 细胞在较低效应细胞与靶细胞比例及较晚时间点表现出更强的效力。而在较早时间点，中等效应细胞与靶细胞比例下亦观察到效力增强。定义了三个参数——KR50、KT50 和 IKI-50，用于量化不同效应细胞群体中 CAR-NK-92 细胞的效力、杀伤动力学及整体细胞毒性能。单独加入达雷妥尤单抗并未降低靶细胞存活率，证实该抗体在缺乏效应细胞的情况下对靶细胞活力无直接作用。仅与NK细胞共培养可使靶细胞存活率降低至约70%，表明存在基础的自然细胞毒性。加入达雷妥尤单抗后，细胞存活率进一步降低至约37%，与增强的抗体介导细胞毒性作用一致。相比之下，同型对照组的存活率约为62%，与仅含NK细胞的对照组相当。在未添加抗体的NK细胞与靶细胞共培养条件下，NK细胞脱颗粒水平最低；而在达雷妥尤单抗处理组中，脱颗粒水平最高，约为31%；同型对照组则表现出中等水平的脱颗粒，约为19%。本方案可使研究人员定量评估NK细胞的天然细胞毒性，评价CAR-NK设计对肿瘤细胞的杀伤效力，并比较单克隆抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）效能。实施本方案时的一个关键注意事项是，必须准确且一致地进行细胞计数、移液和NK细胞及靶细胞的铺板操作，以确保获得可靠且可解释的实验结果。未来的研究可利用这些方案探索自然杀伤细胞的免疫逃逸机制、比较不同肿瘤的易感性，并评估针对多种癌症的新型自然杀伤细胞免疫疗法。

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