Name: 利用CaMPARI对 果蝇 幼虫中枢神经系统中突触前和突触后伴侣的功能性特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 了解利用CaMPARI钙成像结合光遗传学技术在完整果蝇幼虫中验证突触前与突触后神经元功能性连接的方法。该技术可在活体状态下评估神经环路活性，为连接组学研究提供功能证据。

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特此感谢海洋生物学实验室（美国马萨诸塞州伍兹霍尔）为开展本技术与方案的故障排查工作所提供的 Hosting 与支持。

所有涉及黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的实验操作均依照机构指南进行。使用基因型 w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4（通过重组 RRID:BDSC_5489912 和 RRID:BDSC_3207916 获得），分别在突触前和突触后细胞中驱动光遗传学元件和 CaMPARI 的表达（使用品系 w-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo，该品系由 RRID:BDSC_81085 与第二染色体标记品系重组获得）。本实验方案中使用的研究工具列于材料表中。
1. 幼虫的制备
<ol>
	<li>将 virgin 雌性 UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) 与含有两种二元表达系统的果蝇品系雄蝇进行杂交，例如，由目标突触前神经元驱动 GAL4 表达，同时由目标突触后神经元驱动 LexA33,34。</li>
	<li>在含有标准玉米粉琼脂培养基的塑料瓶中设置遗传杂交，并添加 0.5 mM 全反式视黄醛（ATR）以激活 CsChrimson35,36,37,3830,33。同时准备不含 ATR 的平行培养瓶作为无 ATR 对照组。 
	注意：融化玉米粉琼脂培养基时避免煮沸，待其冷却但未凝固。配制 40 mM ATR 储存液（按照生产商说明，将 ATR 粉末溶于 95% 乙醇），然后将其稀释至培养基中终浓度为 0.5 mM，并充分混匀。</li>
	<li>用铝箔完全包裹培养瓶，防止光照。 
	注意：由于 ATR 对光敏感，且为避免非预期的神经元激活，培养过程应始终保持在完全黑暗条件下。尽管 CsChrimson 对红光（590–680 nm）最敏感，但也可被其他可见光波长激活31,39。</li>
	<li>将培养瓶置于 25 °C 恒温培养，使幼虫发育至三龄阶段。</li>
</ol>
2. 幼虫固定
<ol>
	<li>使用画笔收集三龄幼虫。将幼虫置于含有 0.1 M PBS 的三孔微型培养板中清洗，以去除食物残留。 
	注意：不要去除多余的 PBS；它有助于保持幼虫的水分。</li>
	<li>在干净的盖玻片（18 × 18 mm）的每个角落放置少量塑形粘土。将幼虫置于盖玻片上的 PBS 液滴中，并使其腹面朝下定位。 
	注意：若需成像腹神经索（VNC），应将幼虫背侧朝下放置，使腹面接触盖玻片。此方向可使腹神经索中的 Basin-4 中间神经元朝向物镜，透过盖玻片进行观察。</li>
	<li>将一块干净的载玻片覆盖在含有幼虫的盖玻片上。</li>
	<li>通过在盖玻片四角添加更多塑形粘土来固定盖玻片。施加适当压力以固定幼虫，同时避免压破幼虫或盖玻片。</li>
</ol>
3. 刺激、光转化与成像工作流程
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜，对表达CaMPARI的突触后神经元进行基线z轴堆栈成像，同时采集绿色（488 nm，0.8%激光功率）和红色（~561 nm，0.8%激光功率）通道信号。显微镜配置40×/1.2物镜，z轴步进为1 µm，图像分辨率为256 × 256像素，线性平均为2，双向扫描，扫描速度为9。所有成像均在黑暗环境中进行。整个实验过程中保持z轴堆栈参数一致。 
	注意：预期在幼虫腹神经索（VNC）中特定位置观察到明亮的绿色细胞体，基线状态下无明显红色荧光。</li>
	<li>对幼虫持续刺激30秒，同时使用光转化光（405 nm，0.5%激光功率）和光遗传学刺激光（594 nm，0.8%激光功率）。</li>
	<li>刺激后，使用与步骤3.1相同的参数，在红色（~561 nm）和绿色（488 nm）通道下采集刺激后的z轴堆栈图像。预期在与基线图像相似的位置观察到VNC中的细胞体。在喂食ATR的幼虫中，可检测到在刺激期间被激活的神经元中出现红色CaMPARI荧光，而在未喂食ATR的对照组中光转化信号极低。 
	​注意：实验流程及参数总结见图1。</li>
</ol>
<img alt="激光诱导荧光激活示意图；图示CaMPARI的光转化及荧光结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71399/71399fig1.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图1"> 
图1：刺激、光转化（PC）和成像的工作流程。通过三个连续的成像阶段评估Basin-4神经元中的钙活动。在基线阶段，使用488 nm和561 nm激光采集z层图像（z-stacks），以获取刺激前的绿色和红色CaMPARI荧光信号。在刺激阶段，通过CsChrimson（594 nm）对cIVda神经元进行光遗传学激活，同时施加405 nm光照，使活跃状态下的CaMPARI由绿色荧光转化为红色荧光；此30秒期间不进行成像。在刺激后阶段，使用与基线阶段相同的激光设置重新采集z层图像，以检测Basin-4细胞体中发生光转化后的红色荧光信号。所有z层图像均在暗条件下，使用配备40×/1.2 NA物镜的共聚焦显微镜采集，图像分辨率为256 × 256像素，Z轴步长为1 µm，线平均次数为2，并采用双向扫描模式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71399/71399fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 成像分析
<ol>
	<li>在 Fiji（RRID:SCR_002285）中使用启用 Bio-Formats 的方式打开 z-stack 图像。将 Stack 显示模式设置为 Hyperstack，颜色模式设置为 Composite，并启用 Autoscale。滚动浏览 Z 平面，选择聚焦效果最佳的平面。复制所选平面（Image → Duplicate；Channels：1–2；selected Z-plane）。</li>
	<li>将红色和绿色通道分离（Image → Color → Split Channels）。 
	注意：使用 Image → Adjust → Brightness/Contrast → Auto 调整两个通道的亮度和对比度。</li>
	<li>使用 50 像素的滚动球半径对两个通道进行背景扣除（Process → Subtract Background）。</li>
	<li>配置测量参数（Analyze → Set Measurements），包含面积（Area）、平均灰度值（Mean gray value）、积分密度（IntDen）、标准差（Standard deviation）以及最小和最大灰度值（Min &amp; Max gray values）。</li>
	<li>在绿色通道中使用自由手绘工具（Freehand tool）围绕每个细胞绘制感兴趣区域（ROIs）。将 ROIs 添加至 ROI Manager 并进行测量。将相同的 ROIs 应用于红色通道并进行测量。</li>
	<li>将所有测量结果记录在电子表格中，包括幼虫和细胞标识符。 
	注意：需对刺激前和刺激后的图像均进行测量。</li>
	<li>使用积分密度值计算红绿荧光比值，获得每个细胞的 (R/G)post 和 (R/G)pre。按每条幼虫取细胞水平数值的平均值。 
	注意：积分密度（面积 × 平均值）可实现不同大小细胞间的比较。</li>
	<li>使用幼虫水平的平均值计算 Δ(R/G)，即 (R/G)post − (R/G)pre。将正的 Δ(R/G) 值解释为光转化期间突触后钙活性增加。 
	注意：负的 Δ(R/G) 值可能源于噪声或背景不对称性，应将负值设为 0。在本数据集中，一条幼虫出现负值（−0.008），已将其设为 0。</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文所述方案可对完整 D. melanogaster 幼虫中特定突触伙伴之间的突触连接进行定性和定量评估。该方法结合了对 cIVda 感觉神经元的光遗传学刺激与基于 CaMPARI 的突触后 Basin-4 中间神经元激活可视化，从而在未解剖幼虫的中枢神经系统（CNS）中监测突触活动。以往在 D. melanogaster 中应用 CaMPARI 主要集中于成虫阶段20，或需依赖物理性的突触前刺激（例如伤害性热刺激）17。本方法将 CaMPARI 的应用扩展至更早的发育阶段，并提出一种通过光遗传学突触前刺激与基于 CaMPARI 的突触后检测相结合的策略，实现对突触活动的功能性评估。光遗传学激活可对突触前输入实现精确的时间控制，从而实现对刺激的可控施加，并继而监测突触后 CaMPARI 的响应。
尽管具有这些优势，该方法的实施仍需仔细考虑实验设计、适当的对照以及技术局限性。必须设置阴性对照，包括未添加全反式视黄醛（ATR）培养的幼虫（可阻止CsChri...

确定中枢神经系统（CNS）中精确的突触伙伴，有助于追踪神经系统发育过程中突触连接的形成与精细化过程。因此，研究工作已集中于利用体电子显微镜（EM）技术，不仅重建了诸如Caenorhabditis elegans1,2和Drosophila melanogaster3,4,5等强大遗传模式生物的完整连接组，还重建了包括小鼠初级视皮层6和人类颞叶皮层7在内的复杂哺乳动物大脑的毫米尺度EM体积数据。这些研究从解剖学层面提供了关于突触连接组织原则的独特见解。然而，对突触伙伴的功能表征能够提供关于神经元连接性的互补信息，并且对于验证解剖学发现至关重要。
Drosophila 在神经元连接性研究方面具有诸多优势，包括已获得幼虫3以及雌性4和雄性5成体中枢神经系统的完整连接组，此外还拥有大量特征明确、调控可预测行为的神经回路8,9,10。幼虫伤害性感受网络便是其中非常适合用于研究精确突触连接的回路之一11。对该网络的电镜重建揭示了处理伤害性刺激所必需的详细突触配对关系，这些连接最终引发特征性的逃避行为，即伤害性防御性翻滚12,13。
在此网络中，IV类树突状分支（cIVda）神经元14 作为主要的感觉伤害性感受器，负责疼痛感知11,12,13,15,16其细胞体和树突位于体壁的外周，而轴突则伸入幼虫腹神经索（VNC）15在中枢神经系统内，cIVda神经元的轴突末梢以一种刻板的模式分支，并与Basin-4中间神经元形成大部分突触连接。11,12,13,17这种明确的突触连接关系使得cIVda神经元与Basin-4中间神经元成为功能评估突触连通性的理想配对 体内开发用于分析个体明确的突触伙伴之间功能连接的方法，将有助于研究突触发育与精细调控机制，特别是在具有模式化神经回路且遗传操作可行的系统中。
CaMPARI（钙调光可激活比率积分器）18 是一种可遗传编码的比率型荧光指示剂，其发射光谱会随着细胞内钙离子水平升高而发生改变。在基础状态下，CaMPARI 发出绿色荧光；当钙离子浓度升高并暴露于光转化光（约 400 纳米 (nm)）时，它会不可逆地转变为红色荧光18。由于钙离子流入突触后神经元是突触激活的典型特征，CaMPARI 的光转化可作为功能性突触信号传递的读出指标19,20。
除了CaMPARI外，神经元活动还可以通过可逆性传感器进行可视化，例如基因编码的钙离子指示剂（GECIs），包括GCaMP或RCAMP21，以及基因编码的电压指示剂（GEVIs）22 例如 Arclight23，Ace2N-mNeon24，或 VARNAM25尽管这些快速、可逆的传感器非常适合实时监测瞬时活动，但在监测过程中容易受到运动伪影的影响 体内 成像。相比之下，CaMPARI 具有整合性和不可逆的光转化特性，能够在特定时间窗口内捕获神经元活动，即使在成像过程中焦平面发生偏移，也能实现神经元激活的检测。20此外，通过调节紫光强度，可以优化CaMPARI的光转化效果，从而实现对突触强度减弱或阈下输入的检测。26这些特性使得在无需固定头部或束缚的自由活动动物中进行神经活动成像成为可能，包括小鼠皮层的研究。27斑马鱼脑28, 秀丽隐杆线虫29，以及成年个体 黑腹果蝇20.
本文描述了一种在完整未解剖的黑腹果蝇（Drosophila）三龄幼虫中，结合共聚焦显微镜技术，利用CaMPARI光转化与突触前光遗传学刺激来可视化功能性突触伙伴的实验方案。该方法中，在活体三龄幼虫中通过光遗传学激活cIVda神经元，利用CaMPARI检测Basin-4中间神经元中的突触后钙离子内流。cIVda神经元表达红光激活的通道视紫红质CsChrimson30,31，而Basin-4中间神经元则表达CaMPARI。红光照射可选择性激活伤害性感受器，以时间可控的方式模拟伤害性刺激16,30。该策略可用于评估突触前激活是否在突触后神经元中诱导了钙依赖性的CaMPARI光转化，从而为突触连接提供功能性证据。
CaMPARI 与 CsChrimson 联用在分析 cIVda–Basin-4 连接性方面具有多项技术优势。首先，cIVda 树突在幼虫体壁上形成完整且无重叠的镶嵌分布32，使得无需解剖即可进行光遗传学激活完整的感受神经元，避免了因解剖操作造成的损伤干扰16。其次，尽管幼虫在显微镜载玻片上被物理固定，但其内部运动常导致中枢神经系统位置和成像焦平面发生变化；而 CaMPARI 的光转化对这类运动伪影不敏感，能够提供稳定且时间积分的神经元活动读数。第三，CaMPARI 具有可整合和可调节的特性，即使在突触强度或接触数量减少的情况下（例如发育早期阶段），也能检测到突触活动，从而支持未来对突触形成与精细调控的研究。

<table><tbody><tr><td>0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>用于溶液中水合和封片幼虫的化学试剂</td></tr><tr><td>全反式视黄醛（ATR）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500-500mg</td><td>添加至食物中以激活光遗传工具的化学物质</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>ZEISS&amp;nbsp;</td><td>LSM900 共聚焦</td><td>共聚焦显微镜，物镜（40&amp;times;/1.2 NA），光源/激光器（405、488、561 nm）</td></tr><tr><td>盖玻片（18×18 mm）</td><td>VWR</td><td>48366-205</td><td>用于固定动物样本以进行成像</td></tr><tr><td>乙醇（95%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>用作粉末状ATR的溶剂</td></tr><tr><td>Fiji（ImageJ）</td><td>开源软件</td><td>RRID:SCR_002285&amp;nbsp;</td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>Prism 版本 10.4.1</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>RRID:SCR_002798</td><td>用于统计分析</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;48300-041</td><td>用于固定动物样本以进行成像</td></tr><tr><td>建模黏土</td><td>Flinn Scientific</td><td>FB0600</td><td>用于将盖玻片固定在载玻片上，幼虫置于其间</td></tr><tr><td>画笔&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204</td><td>用于在不同位置之间转移幼虫</td></tr><tr><td>标准玉米粉琼脂培养基</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-123</td><td>食物也可使用类似的标准配方和原料制备</td></tr><tr><td>标准果蝇塑料管（25 mm × 95 mm 果蝇窄管）</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109</td><td>也可使用较大的试管或瓶子</td></tr><tr><td>三孔微型斑点板</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>71561-01</td><td>用于分离和清洗单个幼虫的培养板</td></tr><tr><td>果蝇品系（基因型：w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4）&amp;nbsp;</td><td>Bloomington 果蝇品系中心</td><td>RRID:BDSC_54899 &amp; RRID:BDSC_32079</td><td>通过重组 RRID:BDSC_54899 和 RRID:BDSC_32079 获得</td></tr><tr><td>果蝇品系（基因型：w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO）</td><td>Bloomington 果蝇品系中心</td><td>RRID:BDSC_81085</td><td>通过将 RRID:BDSC_81085 与第二染色体标记重组获得</td></tr></tbody></table>

突触前和突触后单个配对成员的功能表征 果蝇 利用campari标记幼虫中枢神经系统

Functional Characterization of Individual Pre- and Postsynaptic Partners In the Drosophila Larval Central Nervous System Using CaMPARI

连接组学研究极大地拓展了人们对多种物种神经系统中突触连接性的理解。尽管利用电子显微镜（EM）对突触伙伴进行表征可提供详细的解剖学信息，但神经网络的功能特性仍需借助互补的研究方法。近期在Drosophila中的研究不仅揭示了幼虫以及成年雄性和雌性中枢神经系统的完整连接组，还鉴定了调控特定行为的神经网络细胞组分，例如幼虫伤害感受网络。到三龄幼虫阶段，IV类树突分支（cIVda）多树突感觉神经元（伤害性感受器）已与Basin-4中间神经元建立了大部分突触连接。为了评估这些解剖学连接的功能相关性，研究中采用了一种基因编码的钙指示剂CaMPARI（Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator），在活体、未解剖的三龄幼虫中作为依赖神经活动的报告工具，以检测cIVda神经元与Basin-4中间神经元之间的突触连接性。CaMPARI是一种比率型荧光指示剂，其发射光谱会随细胞内钙离子浓度升高而发生变化。在基础状态下，CaMPARI发出绿色荧光；当存在高浓度钙离子并暴露于光转化光（约400 nm）时，它会不可逆地转变为红色荧光。由于钙离子流入突触后神经元是突触激活的典型特征，因此CaMPARI的光转化可反映功能性突触信号传递。本文提供了一种逐步操作方法：将三龄幼虫固定在显微镜载玻片上，利用红移型通道视紫红质CsChrimson进行光遗传学激活cIVda伤害性感受器，同时在Basin-4神经元中实现CaMPARI的光转化。尽管存在内部运动和焦平面变化，Basin-4神经元中依赖钙离子的光转化仍为这些细胞之间的突触连接性提供了功能证据。该方法验证了在完整、未解剖的Drosophila幼虫中联合使用CaMPARI与突触前光遗传刺激的可行性。

根据本方案，利用CaMPARI在活体未解剖的黑腹果蝇（D. melanogaster）三龄幼虫中评估了cIVda神经元与Basin-4中间神经元之间的功能连接性（图2）。在进行任何光转化（PC）光刺激或光遗传学激活之前，由于细胞质中表达CaMPARI，Basin-4中间神经元呈现绿色荧光（图2A）。在基础状态下未检测到红色荧光（图2B），证实刺激前未发生光转化。
同时暴露于PC光和光遗传学刺激导致CaMPARI由绿色荧光转化为红色荧光（图2C，D）。为验证该光转化确实由CsChrimson介导的神经元活动所驱动，我们使用相同遗传背景（来自相同的亲本杂交）但未添加全反式视黄醛（ATR）的幼虫作为阴性对照。由于ATR是CsChrimson功能所必需的辅因子，缺乏ATR时即使暴露于594 nm刺激光，...

本方案利用基因编码工具，在体内评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中枢神经系统中特定神经元伙伴之间的功能性突触活动。通过CsChrimson介导的光遗传学刺激上游cIVda感觉神经元，可诱导下游Basin-4中间神经元中CaMPARI发生钙依赖性的光转化。

突触前和突触后单个配对成员的功能表征 果蝇 利用CaMPARI标记幼虫中枢神经系统

连接组学研究极大地拓展了人们对多种物种神经系统中突触连接性的理解。尽管……的表征在……

我们的研究重点是评估活体或解剖后的黑腹果蝇幼虫中特定神经节点伙伴之间的功能性突触连接。传统方法需要进行解剖或物理刺激。本方案在完整幼虫中使用光遗传学技术，可减少人为假象。首先，将玉米粉琼脂培养基在微波炉中加热8-10秒，使其融化但不沸腾，然后在室温下冷却，避免凝固。在培养基完全冷却前，加入全反式视黄醛（all-trans-retinal，简称ATR），使其终浓度为0.5毫摩尔，以补充需要csChrimson激活的果蝇培养基。用铝箔完全包裹试管，防止光照。将携带 CaMPARI 和 csChrimson 基因的处女雌蝇与携带 GAL4 和 LexA 驱动基因的雄蝇在含有已制备培养基的塑料小瓶中进行杂交。同时准备未添加 ATR 的平行小瓶作为对照。将小瓶置于 25 °C 下培养，直至幼虫发育至三龄阶段。使用画笔采集一条三龄幼虫。将幼虫放入含有 0.1 摩尔 PBS 的三孔微型培养板中冲洗，以去除附着的食物残渣。在洁净的 18 × 18 毫米盖玻片的每个角落放置少量模型黏土。将幼虫置于盖玻片上的一滴 PBS 中，并使其腹面朝下定位。将一块干净的载玻片盖在含有幼虫的盖玻片上。用油灰涂抹在盖玻片的四个角以固定，施加的压力应恰到好处，既能固定幼虫又不致压碎幼虫或损坏玻片。将含有幼虫的载玻片置于配备40x/1.2物镜的共聚焦显微镜载物台上。在显微镜软件界面中，点击“Live”。然后在Z Stack面板下，依次点击“Set First”和“Set Last”，随后点击“Stop”，以获取表达CaMPARI的突触后神经元的基线Z Stack图像。在“通道”菜单下，将 488 纳米绿色通道的激光功率设置为 0.8%。接着，将 561 纳米红色通道的激光功率设置为 0.8%。在“Z 轴层扫”菜单下，将间隔值设置为 1 微米。在采集菜单中，选择预设以设置 256 × 256 像素的分辨率。设定线条平均值为 2，双向扫描，扫描速度为 9，并允许自动更新像素时间。所有成像均应在暗环境中进行，并在整个实验过程中保持相同的采集参数。将405纳米的光转化光源设置为0.5%激光功率，将561纳米的光遗传学刺激光源设置为0.8%激光功率。点击“Live”，然后在直方图面板中选择“Best Fit”。让两束激光同时刺激幼虫30秒，然后停止刺激。在使用与基线相同参数进行刺激后ZStack采集时，观察喂食ATR的幼虫中激光刺激神经元的红色CaMPARI荧光，对照组则几乎无光转化。在Fiji ImageJ软件中，单击文件，然后选择打开。在 BioFormats 导入选项窗口中使用默认设置，单击“确定”以打开获取的 ZStack 图像。在“图像”菜单下，选择“颜色”，然后选择“拆分通道”以查看所获取图像的红色和绿色通道。进行背景扣除时，单击“处理”，然后选择“背景扣除”。在弹出窗口中，将滚动球半径设置为 50 像素，然后单击“确定”，并在“处理栈”窗口中选择“是”。接下来，在“分析”菜单下，选择“工具”，然后选择“ROI 管理器”以打开 ROI 窗口。使用手绘选区工具围绕单个细胞勾画出感兴趣的区域。在 ROI 窗口中，选择“添加”以保存选定的轮廓。然后点击“测量”以生成面积、平均值、标准差和积分密度结果。对同一条幼虫在绿色和红色通道中的多个细胞分别重复此过程。将结果导出至电子表格后，测量每个细胞的红色与绿色荧光积分密度的比值（R/G），并计算所有细胞的平均R/G比值，从而得到每条幼虫在刺激前和刺激后图像中的平均R/G比值。最后，通过从刺激后的R/G比值中减去刺激前的R/G比值，计算荧光变化量（即ΔR/G），以定量评估突触后钙活性。在三龄幼虫中，针对Ⅳ类树突状神经元（class IV dendritic arborization, cIVda）与basin-4中间神经元之间功能连接的研究显示，在光转化和光遗传学光刺激之前，由于细胞质中表达CaMPARI，basin-4中间神经元呈现绿色荧光。在基线条件下未检测到红色荧光，证实刺激前不存在光转化现象。同时施加光转化光照和光遗传学刺激可导致CaMPARI由绿色荧光转化为红色荧光。对照组中无红色荧光表明，该光转化过程特异性地由csChrimson介导的神经元活动所驱动。实验动物的绿色荧光下红色荧光变化显著高于无ATR对照组。该方案可用于验证突触连接关系，通过在活体发育动物中追踪突触前刺激后立即发生的突触后反应来实现。最具挑战性的步骤是动物的适当固定，需要施加足够的压力以防止动物移动，同时不对其造成伤害。未来的研究可能实现对发育中的动物特定神经元群体之间突触连接的形成、强化甚至消除过程的追踪。

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