突触前和突触后单个配对成员的功能表征 果蝇 利用CaMPARI标记幼虫中枢神经系统

我们的研究重点是评估活体或解剖后的黑腹果蝇幼虫中特定神经节点伙伴之间的功能性突触连接。传统方法需要进行解剖或物理刺激。本方案在完整幼虫中使用光遗传学技术，可减少人为假象。

首先，将玉米粉琼脂培养基在微波炉中加热8-10秒，使其融化但不沸腾，然后在室温下冷却，避免凝固。在培养基完全冷却前，加入全反式视黄醛（all-trans-retinal，简称ATR），使其终浓度为0.5毫摩尔，以补充需要csChrimson激活的果蝇培养基。用铝箔完全包裹试管，防止光照。

将携带 CaMPARI 和 csChrimson 基因的处女雌蝇与携带 GAL4 和 LexA 驱动基因的雄蝇在含有已制备培养基的塑料小瓶中进行杂交。同时准备未添加 ATR 的平行小瓶作为对照。将小瓶置于 25 °C 下培养，直至幼虫发育至三龄阶段。

使用画笔采集一条三龄幼虫。将幼虫放入含有 0.1 摩尔 PBS 的三孔微型培养板中冲洗，以去除附着的食物残渣。在洁净的 18 × 18 毫米盖玻片的每个角落放置少量模型黏土。

将幼虫置于盖玻片上的一滴 PBS 中，并使其腹面朝下定位。将一块干净的载玻片盖在含有幼虫的盖玻片上。用油灰涂抹在盖玻片的四个角以固定，施加的压力应恰到好处，既能固定幼虫又不致压碎幼虫或损坏玻片。

将含有幼虫的载玻片置于配备40x/1.2物镜的共聚焦显微镜载物台上。在显微镜软件界面中，点击“Live”。然后在Z Stack面板下，依次点击“Set First”和“Set Last”，随后点击“Stop”，以获取表达CaMPARI的突触后神经元的基线Z Stack图像。

在“通道”菜单下，将 488 纳米绿色通道的激光功率设置为 0.8%。接着，将 561 纳米红色通道的激光功率设置为 0.8%。在“Z 轴层扫”菜单下，将间隔值设置为 1 微米。

在采集菜单中，选择预设以设置 256 × 256 像素的分辨率。设定线条平均值为 2，双向扫描，扫描速度为 9，并允许自动更新像素时间。所有成像均应在暗环境中进行，并在整个实验过程中保持相同的采集参数。

将405纳米的光转化光源设置为0.5%激光功率，将561纳米的光遗传学刺激光源设置为0.8%激光功率。点击“Live”，然后在直方图面板中选择“Best Fit”。

让两束激光同时刺激幼虫30秒，然后停止刺激。在使用与基线相同参数进行刺激后ZStack采集时，观察喂食ATR的幼虫中激光刺激神经元的红色CaMPARI荧光，对照组则几乎无光转化。在Fiji ImageJ软件中，单击文件，然后选择打开。

在 BioFormats 导入选项窗口中使用默认设置，单击“确定”以打开获取的 ZStack 图像。在“图像”菜单下，选择“颜色”，然后选择“拆分通道”以查看所获取图像的红色和绿色通道。进行背景扣除时，单击“处理”，然后选择“背景扣除”。

在弹出窗口中，将滚动球半径设置为 50 像素，然后单击“确定”，并在“处理栈”窗口中选择“是”。接下来，在“分析”菜单下，选择“工具”，然后选择“ROI 管理器”以打开 ROI 窗口。使用手绘选区工具围绕单个细胞勾画出感兴趣的区域。

在 ROI 窗口中，选择“添加”以保存选定的轮廓。然后点击“测量”以生成面积、平均值、标准差和积分密度结果。对同一条幼虫在绿色和红色通道中的多个细胞分别重复此过程。

将结果导出至电子表格后，测量每个细胞的红色与绿色荧光积分密度的比值（R/G），并计算所有细胞的平均R/G比值，从而得到每条幼虫在刺激前和刺激后图像中的平均R/G比值。最后，通过从刺激后的R/G比值中减去刺激前的R/G比值，计算荧光变化量（即ΔR/G），以定量评估突触后钙活性。在三龄幼虫中，针对Ⅳ类树突状神经元（class IV dendritic arborization, cIVda）与basin-4中间神经元之间功能连接的研究显示，在光转化和光遗传学光刺激之前，由于细胞质中表达CaMPARI，basin-4中间神经元呈现绿色荧光。

在基线条件下未检测到红色荧光，证实刺激前不存在光转化现象。同时施加光转化光照和光遗传学刺激可导致CaMPARI由绿色荧光转化为红色荧光。对照组中无红色荧光表明，该光转化过程特异性地由csChrimson介导的神经元活动所驱动。

实验动物的绿色荧光下红色荧光变化显著高于无ATR对照组。该方案可用于验证突触连接关系，通过在活体发育动物中追踪突触前刺激后立即发生的突触后反应来实现。最具挑战性的步骤是动物的适当固定，需要施加足够的压力以防止动物移动，同时不对其造成伤害。

未来的研究可能实现对发育中的动物特定神经元群体之间突触连接的形成、强化甚至消除过程的追踪。