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本工作由中国台湾教育部（MOE）高等教育深耕计划框架下的中国医药大学癌症生物学与精准治疗研究中心特色领域研究中心计划资助（CBPTC-PROJ-5-2）。
感谢癌症生物学与精准治疗中心提供资金和学术支持。

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作者声明无利益冲突。

本方案中有多个步骤对于获得可靠且可重复的结果至关重要。首先，外周血单个核细胞（PBMC）分离的质量和纯度直接影响巨噬细胞的得率和分化效率。将稀释后的血液小心地铺在Ficoll密度梯度液上，并在离心时关闭刹车，是保持血浆与密度梯度液界面完整的关键，以利于获取白膜层。红细胞裂解不完全或裂解缓冲液作用时间过长均会降低PBMC的存活率。其次，在进行吞噬实验之前，必须通过流式细胞术验证促炎型巨噬细胞的极化状态；未能上调CD80表达的巨噬细胞可能吞噬能力减弱，从而干扰对抗CD24抗体效应的正确解读。第三，肿瘤细胞的解离方法也十分重要——应避免使用胰酶消化，因为酶解过程可能切割细胞表面的CD24，降低抗体结合效率。基于EDTA的细胞解离方法可保持表面抗原的完整性，因此推荐使用。
本方案可根据不同的实验目的进行调整。效应细胞与靶细胞的比例（E:T）可从本文所述比例进行调整；高于文中所述的2:1巨噬细胞与癌细胞比例（例如3:1或5:1）可增加每个视野中吞噬事件的发生频率，这在处理CD24表达水平较低的癌细胞系时可能更具优势。抗CD24抗体浓度（1 µg/mL）是针对本研究中使用的细胞系优化的，但在将...

乳腺癌是全球女性中最常被诊断出的恶性肿瘤，每年约有230万例新发病例1。该疾病在临床上具有异质性，根据激素受体——雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）——以及人表皮生长因子受体2（HER2）癌基因的表达状态，至少可分为四种主要的分子亚型2。腔面A型肿瘤表达ER和/或PR，但无HER2过表达（ER/PR+ 且 HER2−）；腔面B型肿瘤同时表达ER/PR和HER2（ER/PR+ 且 HER2+）；HER2+型肿瘤表现为高水平的HER2表达，与激素受体状态无关；三阴性乳腺癌（TNBC）则缺乏这三种标志物的表达（ER−、PR− 和 HER2−）2,3。在这些亚型中，TNBC是临床上最具挑战性的类型，约占所有乳腺癌的15%–20%。TNBC患者表现出最侵袭性的疾病进程，预后最差，5年总生存期最短，这主要归因于对传统化疗反应不佳以及缺乏有效的靶向治疗手段3,4。此外，TNBC表现出显著高的内脏转移倾向，尤其在诊断后5年内易转移至肺部，而晚期或转移性TNBC（mTNBC）患者的中位生存期很少超过2年5,6。这些数据凸显了开发TNBC新型治疗策略的迫切且尚未满足的临床需求。
肿瘤微环境（TME）在乳腺癌进展和免疫逃逸中发挥关键作用。肿瘤相关巨噬细胞是TME中最丰富的免疫细胞之一，近年来被确认为介导固有抗肿瘤免疫的关键因素7,8,9。尽管历史上将TAMs划分为促炎性的“M1”型和促肿瘤的“M2”型，但这种二元模型无法充分反映巨噬细胞的异质性。相反，TAMs处于一种动态的功能谱系中，会随着TME内多种生化信号的变化而演变。在此复杂环境中，癌细胞通过多种免疫逃逸策略主动抑制巨噬细胞活性，其中尤为突出的是“别吃我”信号的过表达。CD47/SIRPα轴是首个被发现的此类固有免疫检查点6,10，而近期CD24被发现是一种新型且强效的抗吞噬信号11,12。CD24是一种小分子、高度糖基化的黏蛋白样糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接锚定于细胞膜上13。在生理条件下，CD24表达于多种免疫细胞谱系，但在包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和结直肠癌等多种实体瘤中常出现过表达14。在肿瘤细胞上，CD24与巨噬细胞表面表达的抑制性受体唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素10（Siglec-10）结合。该相互作用触发Siglec-10胞内尾部免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）结构域的磷酸化，进而激活SHP-1和SHP-2磷酸酶，抑制下游吞噬信号通路11。使用单克隆抗体阻断CD24/Siglec-10相互作用已被证明可显著增强巨噬细胞对表达CD24的人类肿瘤的吞噬作用。我们近期的研究还表明，在小鼠三阴性乳腺癌模型中，敲除乳腺癌细胞中的CD24a可增加其对巨噬细胞吞噬的敏感性9。
抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）是一种关键机制，通过该机制抗体可引导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞15,16。当抗体与肿瘤细胞表达的抗原结合后，其Fc区会与巨噬细胞表面的Fcγ受体（FcγRs）相互作用，触发细胞内信号级联反应，最终导致细胞骨架重排、吞噬杯形成以及靶细胞的吞噬17。
本研究建立并验证了一种用于检测抗体驱动的巨噬细胞吞噬乳腺癌细胞的延时活细胞成像方案。该方法利用来自健康人供体的外周血单个核细胞（PBMC）来源的巨噬细胞，经巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化后，再用脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFN-γ）进行刺激。流式细胞术分析显示，刺激后CD11b⁺细胞群中CD80表达上调（图1），表明其具有经典活化表型。该活化状态赋予巨噬细胞强大的抗体介导吞噬能力，适用于评估抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。以表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的CD24阳性乳腺癌细胞作为靶细胞，在共培养前用治疗性抗CD24单克隆抗体进行调理。在受控环境条件下，使用自动化显微镜连续记录16小时内的吞噬事件。为了在动态可视化的同时实现定量评估，另设一组在相同共培养条件下进行的终点实验，通过去除未被内化的靶细胞后对吞噬作用进行严格量化。该方案为评估抗CD24抗体介导的ADCP提供了一个标准化、可重复且具有丰富视觉信息的平台。重要的是，将延时成像与基于终点的互补定量策略相结合，可同时评估吞噬作用的动力学过程和吞噬程度。该方法可适用于其他巨噬细胞靶向免疫治疗靶点的研究。本方案特别适用于评估针对肿瘤细胞表面抗原的治疗性单克隆抗体所介导的ADCP，适合用于候选抗体的比较筛选、剂量-效应关系表征以及Fc–FcγR相互作用机制研究，包括“别吃我”信号阻断效应（如CD47–SIRPα通路）的分析。由于该检测使用原代人巨噬细胞，因此也适用于在临床开发前评估供体间变异性的转化医学研究。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
图1．由外周血单个核细胞诱导生成的IFN-γ/LPS刺激型巨噬细胞及其流式细胞术验证。上图：通过密度梯度离心法（使用Ficoll溶液，400 × g，20°C下离心30分钟）从健康供体分离外周血单个核细胞（PBMCs），所有试剂预先平衡至20°C ± 2°C。分离所得PBMCs在ImmunoCult-SF培养基中培养7天（第0–7天），培养基中添加100 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）以诱导巨噬细胞分化，并于第5天补充培养基。第8天时，将已分化的巨噬细胞用100 ng/mL IFN-γ和1 µg/mL LPS刺激48小时（第8–10天）。随后对细胞进行流式细胞术分析。下图：巨噬细胞的流式细胞术分析。细胞使用包含CD11b-FITC、CD80-PE和CD206-PerCP-Cy5.5的表面标志抗体组合染色，上机前加入DAPI以排除死细胞。设门策略：首先根据DAPI⁻设门选择活细胞，然后在CD11b-FITC与FSC-A散点图中确定CD11b⁺细胞群，以确认巨噬细胞身份。对活细胞中CD11b⁺群体进一步在CD80与CD206散点图中分析，确认IFN-γ/LPS刺激诱导产生的CD80⁺CD206⁻细胞群。右侧：CD11b-FITC与FSC-A的代表性散点图显示，99.8%的设门细胞为CD11b⁺，证实其巨噬细胞特性。左侧：大部分CD11b⁺细胞位于CD80⁺CD206⁻象限（Q1：95.2%），表明在所用刺激条件下成功诱导出预期的促炎表型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
应用该技术时，使用者应考虑若干限制因素。首先，来源于外周血单个核细胞的巨噬细胞存在供体间变异，可能导致吞噬功能结果出现较大差异，因此建议使用多个供体（n ≥ 3），并同时报告单个供体数据与合并结果。其次，二维共培养体系无法完全模拟肿瘤微环境，相关发现应在三维体系或体内模型中验证后，方可进行临床推断。第三，16小时的成像窗口仅能捕获早期吞噬事件，无法反映抗原提呈或继发性免疫激活等长期过程。因此，实时成像与终点定量相结合的方法可提供互补性分析框架，有助于提高抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）测量结果的可解释性与可重复性。

<table><tbody><tr><td>0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）储备液</td><td>Sigma-Aldrich（或同等产品）</td><td>E7889（或同等产品）</td><td>用于配制 PBS 中含 10 mM EDTA 的工作液，以进行细胞解离</td></tr><tr><td>24孔组织培养板（TC处理）</td><td>康宁（或同等品牌）</td><td>3524</td><td>用于巨噬细胞与癌细胞在吞噬作用检测过程中的共培养</td></tr><tr><td>抗人CD206抗体（流式细胞术）</td><td>BioLegend（或同等产品）</td><td>321122（或同等产品）</td><td>替代性巨噬细胞表型标志物</td></tr><tr><td>抗人CD24单克隆抗体</td><td>赛默飞世尔科技公司（或同等产品）</td><td>MA1-91384（或等效产品）</td><td>用于肿瘤细胞的抗体依赖性吞噬作用的调理</td></tr><tr><td>配备环境控制室的自动活细胞成像系统（例如，Lionheart FX）</td><td>安捷伦科技公司（或同等产品）</td><td>BioTek Lionheart FX 自动显微镜</td><td>可在受控温度条件下实现长期延时成像 &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 条件</td></tr><tr><td>用于自动活细胞成像的成像软件（例如 Gen5）</td><td>安捷伦科技公司（或同等产品）</td><td>N/A</td><td>用于延时成像数据的采集与分析</td></tr><tr><td>离心机（摆桶转子）</td><td>赛默飞世尔科技公司（或同等产品）</td><td>Multifuge X4R Pro 配备 TX-1000 转子（或同等型号）</td><td>用于PBMC分离和细胞洗涤步骤</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱（37&amp;deg;C，5% &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>赛默飞世尔科技（或同等产品）</td><td>直接加热法 &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱（或同等设备）</td><td>维持细胞培养的生理条件</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 带调节阀的气体供应</td><td>安捷伦科技公司（或同等产品）</td><td>N/A</td><td>材料与试剂 &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 用于培养箱和成像系统的环境控制</td></tr><tr><td>锥形管（15 mL 和 50 mL）</td><td>Corning（或同等产品）</td><td>352070（或同等型号）</td><td>用于PBMC的分离、洗涤和离心步骤</td></tr><tr><td>EDTA抗凝采血管（真空采血管）</td><td>BD 生物科学公司（或同等产品）</td><td>367863（或同等产品）</td><td>用于采集供体的全血样本</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva（或同等产品）</td><td>17144003（或同等编号）</td><td>用于分离外周血单个核细胞的密度梯度介质</td></tr><tr><td>流式细胞仪（例如 FACSCanto II）</td><td>BD 生物科学（或同等产品）</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>用于巨噬细胞的表型分析</td></tr><tr><td>补偿微珠（流式细胞术）</td><td>Biolegend（或同等产品）</td><td>424602</td><td>用于单色补偿对照</td></tr><tr><td>FITC 抗人 CD11b 抗体（流式细胞术）</td><td>BioLegend（或同等产品）</td><td>101205（或同等产品）</td><td>用于鉴定巨噬细胞的标记物</td></tr><tr><td>PE 抗人 CD80 抗体（流式细胞术）</td><td>BioLegend（或同等产品）</td><td>375410（或同等产品）</td><td>与活化巨噬细胞表型相关的标志物</td></tr><tr><td>表达GFP的乳腺癌细胞系（MDA-MB-468）</td><td>ATCC（或同等机构）</td><td>HTB-132（或等效产品）</td><td>吞噬作用实验中使用的靶细胞；GFP可实现可视化</td></tr><tr><td>ImmunoCult-SF 巨噬细胞培养基</td><td>STEMCELL Technologies（或同等产品）</td><td>10961（或同等产品）</td><td>用于巨噬细胞分化的无血清培养基</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>赛默飞世尔科技（或同等产品）</td><td>12100046</td><td>用于癌细胞的培养和重悬</td></tr><tr><td>同型对照抗体（IgG）</td><td>Bio X Cell（或同等产品）</td><td>BE0297（或同等产品）</td><td>抗体依赖性吞噬作用检测的阴性对照</td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>Sigma-Aldrich（或同等产品）</td><td>L2630（或等效产品）</td><td>用于与IFN联合激活巨噬细胞的刺激物&amp;gamma;</td></tr><tr><td>重组人干扰素γ（IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies（或同等产品）</td><td>78020（或同等产品）</td><td>用于巨噬细胞激活的细胞因子</td></tr><tr><td>重组人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）</td><td>STEMCELL Technologies（或同等产品）</td><td>78057（或等效产品）</td><td>用于巨噬细胞分化的生长因子</td></tr><tr><td>巴斯德吸管或血清移液管</td><td>Jetbiofil（或同等产品）</td><td>GSP010010（或同等产品）</td><td>用于PBMC分离和细胞培养过程中的液体操作</td></tr><tr><td>PBS（Ca²⁺）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;无（free）</td><td>赛默飞世尔科技公司（或同等产品）</td><td>BP399-500（或等效产品）</td><td>用于洗涤细胞和稀释步骤的缓冲液</td></tr><tr><td>培养皿（100 mm，非&amp;ndash;组织培养处理的</td><td>康宁（或同等品牌）</td><td>430591</td><td>通过贴壁筛选法用于巨噬细胞分化</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>BioLegend（或同等产品）</td><td>420301（或同等产品）</td><td>用于在分离外周血单个核细胞时去除红细胞</td></tr><tr><td>Viobility 405/452 可固定染料</td><td>美天旎生物技术（或同等产品）</td><td>130-130-404（或同等产品）</td><td>用于在流式细胞术分析过程中评估细胞活力</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich（或同等产品）</td><td>D9542（或等效产品）</td><td>用于流式细胞术中的死细胞排除</td></tr></tbody></table>

抗体介导的巨噬细胞吞噬绿色荧光蛋白标记的三阴性乳腺癌细胞的延时成像

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

抗体依赖性细胞吞噬作用是巨噬细胞吞噬抗体调理的癌细胞的关键机制。本方案描述了一种延时活细胞成像方法，用于可视化巨噬细胞对表达CD24的绿色荧光蛋白标记三阴性乳腺癌细胞的抗体依赖性吞噬过程。巨噬细胞来源于人外周血单个核细胞，在巨噬细胞集落刺激因子作用下分化，并通过干扰素γ和脂多糖极化，以获得促炎表型。在与巨噬细胞以确定的效应细胞与靶细胞比例共培养之前，癌细胞预先用抗CD24单克隆抗体进行调理。利用配备环境控制系统的自动化显微镜，在16小时期间内连续记录吞噬事件，以维持生理条件。成像过程同时使用明场和荧光通道，以便识别癌细胞并监测其被巨噬细胞内化的过程。代表性延时图像展示了荧光标记癌细胞随时间推移逐步被吞噬的现象。为实现定量评估，在相同共培养条件下平行进行终点检测，成像前去除未被内化的癌细胞，从而准确测量吞噬事件的发生数量。该方法为体外观察抗体驱动的巨噬细胞吞噬作用提供了标准化且可重复的技术流程。重要的是，将延时成像与基于终点的定量分析相结合，可对吞噬作用的动力学特征和程度进行互补性评估。本方案支持在可控的体外环境中评估治疗性抗体及靶向巨噬细胞的癌症免疫疗法。

通过形态学评估和流式细胞术分析，确认了从外周血单个核细胞（PBMCs）成功生成并极化为巨噬细胞（图1）。通过密度梯度离心法分离的PBMCs在添加M-CSF的培养基中培养，至第7天时形成贴壁细胞，具有典型的巨噬细胞形态。经IFN-γ和LPS刺激后，细胞表现出与所施加条件一致的活化表型。流式细胞术分析显示，门控细胞中99.8%为CD11b阳性，证实了向巨噬细胞的高效分化（图1）。在CD11b阳性细胞中，绝大多数位于CD80⁺CD206⁻象限（95.2%），表明在指定刺激条件下实现了成功的极化。这些结果证实，该方案能够可靠地生成具有预期标志物表达谱的巨噬细胞。
延时成像实现了对抗体依赖性细胞吞噬作用的直接可视化（图2）。对所获取的延时数据和终点数据的图像分析流程详见补充图1。将GFP标记的CD24阳性乳腺癌细胞与巨噬细胞共培养，通过随时间推移GFP阳性细胞逐步被巨噬细胞内化的过...

本方案描述了一种延时活细胞成像方法，用于在自动化显微镜下观察由外周血单个核细胞来源的巨噬细胞介导的、针对绿色荧光蛋白标记的三阴性乳腺癌细胞的抗体依赖性吞噬作用。

抗体依赖性细胞吞噬作用是巨噬细胞吞噬抗体包被的癌细胞的关键机制。本方案描述了一种……

time-lapse-imaging-antibody-driven-macrophage-phagocytosis-green

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

本视频展示了一种用于监测巨噬细胞介导的红细胞（RBC）吞噬作用独立事件的实验方法。将经小鼠免疫球蛋白G（IgG）包被的人源红细胞与小鼠巨噬细胞共孵育，并在共聚焦显微镜下观察。红细胞被巨噬细胞吞噬 通过...

实时成像巨噬细胞对IgG调理红细胞的吞噬作用

我们描述了一种用于成像抗肿瘤治疗反应的方法 体内...

小鼠乳腺癌模型中肿瘤微环境对药物反应的活体成像

本文介绍了一种利用荧光测定法定量分析贴壁巨噬细胞系吞噬荧光颗粒的实验方案。该方法可实现对颗粒内化及伴随发生的肌动蛋白聚合的高通量定量分析。...

高通量荧光测定法评估巨噬细胞吞噬作用与肌动蛋白聚合

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内...

延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

本文介绍了研究肺泡巨噬细胞在癌症转移中功能的模型和方法。为了阐明这些细胞在转移过程中的作用，采用了同源性乳腺癌（4T1）模型，并结合使用氯膦酸盐脂质体耗竭肺泡巨噬细胞。...

研究肺泡巨噬细胞在乳腺癌转移中的作用

我们描述了一种实验装置，利用全内反射荧光显微镜，在活体巨噬细胞中以前所未有的高分辨率三维可视化吞噬体的形成与闭合过程。该方法可实时监测吞噬杯底部、延伸的伪足，以及吞噬体断裂的精确位点。...

利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行“吞噬体闭合检测”以三维可视化吞噬体形成过程

本文介绍了利用旋转盘共聚焦显微镜对小鼠腹腔常驻巨噬细胞的单个吞噬事件进行成像的方法。该方案可拓展应用于其他吞噬性细胞。...

小鼠巨噬细胞吞噬作用的延时三维成像

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。...

通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

本研究对巨噬细胞针对癌细胞（特别是4T1小鼠乳腺癌细胞）的吞噬活性进行了成像。通过荧光显微镜与微分干涉差显微镜联用，建立并观察了活细胞共培养模型。利用成像软件对这一评估过程进行成像，生成了多点时间延时视频。...

共培养体系中M1型巨噬细胞与4T1小鼠乳腺癌细胞吞噬活性的延时二维成像

本文介绍了一种利用永久性肺窗对小鼠肺部经减毒且获得生物安全二级（BSL-2）许可的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

衰减营养缺陷型的活体成像 结核分枝杆菌 小鼠肺脏在早期血管内感染期间的变化

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

抗体介导的巨噬细胞吞噬绿色荧光蛋白标记的三阴性乳腺癌细胞的延时成像

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