Name: 利用六甲基二硅氧烷促进扩散结合离子选择性电极法测定小鼠模型血清、骨骼和牙齿中氟化物含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学习使用六甲基二硅氧烷促进扩散结合离子选择性电极法测定小鼠血清、骨骼和牙齿中的氟化物含量。该方法灵敏度高，适用于微量样本，可检测年龄和剂量依赖性差异。

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本研究的资助来自日本促进科学协会；JSPS海外研究奖学金202560528（S.Y.），圣保罗研究基金会（FAPESP）；2024/07452-9（J.S.T.），以及美国国立卫生研究院牙科与颅面研究所；R01DE027648（M.S.）和K02DE029531（M.S.）。

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作者声明无利益冲突。

使用掺杂氟化镧（LaF₃）的氟离子选择性电极（ISE）进行氟化物浓度测定。&#8323;晶体膜38,39该膜可形成高度稳定的La–F键，从而对氟离子的选择性显著高于其他卤素离子。根据已建立的电化学文献及制造商的技术参数，LaF&#8323; 膜对氯离子的选择性系数极低，表明在本方案所用条件下，氯离子不会产生可测量的干扰。尽管氯离子天然存在于牙齿和骨骼中，其活度不会影响电极电位，所记录的信号特异性地反映氟离子的活度。0.02 ppm 的检测下限对应于 Orion 氟离子选择性电极经制造商验证的最低可定量浓度。该限值反映了电极仍能保持稳定的能斯特响应并与校准曲线呈线性关系的最低氟离子浓度。由于检测下限由电极膜的特性决定并已由制造商验证，本方案无需额外进行实验测定；然而，关于检测上限，作者观察到当氟的质量超过约 38,000&#160;ng 在 50&#160;&#181;L NaOH捕获导致电极响应呈非线性，表明在氟化物负荷极高时，校准曲线已不再可靠。这种非线性很可能是由于在给定实验条件下超出了电极的最佳离子强度和活度范围，而非反映了离子选择性电极（ISE）本身固有的上限。 对于预计氟化物含量高于该阈值的样品，建议增加氢氧化钠捕集液的体积，以确保测量值处于电极的线性动态范围内。
当将本方案应用于氟含量异常高的样品时，应考虑这一因素。由于扩散步骤会消耗全部样品体积，因此无法对生物样品进行重复测量或加标回收实验。为确保分析的准确性和精密度，每次测量系列中均包含已知氟浓度的质量控制（QC）标准品。这些QC标准品的处理和测定方式与实验样品完全相同。在所有运行中，QC标准品测得的氟浓度始终在其预期值的5%范围内。 对于每批10–20个待测样品，均平行制备两组独立的5–6个校准样品，并在校准样品与待测样品处理完成后、每次测量前记录校准曲线。每次运行的校准范围均根据待测样品预期的氟质量进行调整，该预期值取决于样品类型、加入扩散皿中的材料质量以及动物的处理组别和年龄。对于血清测定，校准标准品对应的样品中氟浓度约为0.06–1.20 ppm；对于骨和牙齿测定，校准标准品对应的样品中氟浓度约为19–7,600 ppm。
本方案提供了一种灵敏且可重复的方法，用于定量血清、骨骼和牙齿中氟离子质量，其通过六甲基二硅氧烷促进扩散并结合离子选择性电极（ISE）分析实现。该方法可稳定捕获从多种生物基质中释放的氟离子，从而在受控暴露条件下实现对氟蓄积的定量评估。来自青少年期与成年小鼠的代表性结果表明，不同组织中的氟沉积存在明显的年龄依赖性和剂量依赖性差异，凸显了该方法在研究氟代谢及毒物动力学方面的实用性。

关键词：氟离子定量，血清，骨骼，牙齿，六甲基二硅氧烷，扩散法，离子选择性电极，氟代谢，毒物动力学，生物基质，氟蓄积，年龄依赖性，剂量依赖性 体内.
本方案的一个关键优势在于使用了扩散皿，可将释放氟离子的反应与捕获氟离子的环境在物理上分隔开来。石蜡油密封的设计最大限度地减少了与大气的交换，确保盖内氢氧化钠液滴能够高效捕获释放出的氟离子。六甲基二硅氮烷（HMDS）饱和的硫酸为从矿化组织（包括骨和牙齿等高度钙化的结构）中释放氟离子提供了强大且稳定的驱动力。随后通过离子选择性电极（ISE）进行检测，并采用与扩散条件匹配的标准品进行校准，可在较宽的动态范围内实现准确的定量。该方法的另一优势在于能够对极微量的生物样品中的氟进行定量。小鼠的矿化组织，特别是下颌门齿，每颗牙齿仅能产生3–5 mg的灰分。传统的分析方法通常需要更大的样品量或更高的氟含量才能实现可靠的检测。相比之下，基于扩散的设计可将整个样品中释放出的全部氟离子富集到一个微小且固定的体积中，从而即使在绝对氟含量极低的微小样品中也能实现精确的定量。这一特性对于涉及小型动物、组织样本有限或经显微解剖获得的矿化结构的研究尤为重要。
该方法的一个主要局限性在于本研究中所用离子选择性电极（ISE）的检测限（0.02 ppm）。无氟对照组动物的血清样本中氟浓度常低于此阈值，导致极低浓度的氟无法被定量。当测量接近或低于检测限的痕量氟浓度时，若条件允许，可增加加入扩散皿的样本质量或体积，或需采用其他分析技术。此外，该方法需要过夜扩散，并需谨慎操作腐蚀性试剂，这可能限制高通量研究中的样本处理能力。尽管ISE能够对总体氟含量进行高灵敏度定量，但无法评估氟在组织内的空间分布。可结合使用其他补充性方法，如扫描电子显微镜联用能谱仪（SEM-EDX）或质子激发伽马射线发射分析（PIGE），以在微米至宏观尺度上可视化并绘制氟的分布图谱。这些基于成像的技术可评估氟在矿化组织或软组织中的局部蓄积情况，从而与ISE测定结果相互补充，更全面地评估组织中氟的含量。
在本实验方案中，多个反复出现的技术因素可能影响氟化物扩散与测定的准确性和可靠性。我们的观察表明，校准液的配制、扩散皿的密封、pH 控制、电极性能以及样品处理共同决定了数据质量。校准曲线非线性（R2 ＜ 0.99）或组织样品读数超出预期范围的可能原因，包括向扩散皿中加入的 NaF 储备液体积计算错误，或在配制校准标准品时发生移液误差。建议措施：每次运行至少制备两套独立的校准样品，以便在某条校准曲线超出预期范围时可使用备用校准组。扩散皿密封不完全也可能导致扩散过程中氟化物损失，从而产生人为偏低的读数。这种情况通常发生在扩散皿盖边缘涂抹的凡士林不足时。建议措施：在扩散皿盖边缘均匀涂抹足量凡士林软膏，并用力压紧以确保完全密封。向 NaOH 捕获液中添加乙酸溶液时若发生移液误差，可能导致样品 pH 偏离最佳范围（pH 5.0），从而影响氟化物回收的准确性。建议措施：使用 pH 试纸检测每个样品的 pH，并弃用任何 pH 超出 5.0 范围的样品。校准样品的浓度也可能超出氟离子选择性电极的有效检测范围。浓度低于 0.02 ppm 的样品低于电极的检测限。建议措施：不得使用含氟浓度低于 0.02 ppm 的校准样品。相反，氟浓度过高的校准样品可能改变溶液的离子强度，导致电极响应非线性。建议措施：在项目开始时，配制覆盖较宽氟浓度范围的校准溶液，以确定所用电极的线性工作范围。若组织样品超出该线性范围，应减少组织质量或增加 NaOH 捕获液体积，并相应调整乙酸的加入量，以维持 pH 为 5.0。在 0.02–1 ppm 范围内难以获得线性校准曲线的常见原因是电极老化。较旧的氟离子选择性电极在极低氟浓度下灵敏度下降。建议措施：更换氟离子选择性电极。电位计读数不稳定（信号漂移或跳动）通常发生在电极感应表面未完全浸入样品溶液中时。建议措施：将电极下移，确保其感应表面完全被液体样品覆盖。
总体而言，本方案提供了一种基于校准的可靠方法，用于定量多种生物基质中的氟化物，非常适合用于研究小鼠模型中氟化物的暴露、组织沉积及毒理学效应。

氟化物是一种天然存在的阴离子，适量的氟能有效预防龋齿1,2,3,4,5。在美国，以0.7 ppm的浓度实施社区饮水加氟，作为降低龋齿发病率和促进口腔健康的公共卫生策略6。然而，长期摄入过量氟化物会对多种组织产生不利影响。高氟暴露会破坏釉质形成7,8,9，改变骨形成过程10，并损害骨骼完整性11。
在细胞水平上，氟化物暴露会引起多种代谢紊乱，包括氧化应激12、内质网应激13、改变基因表达的表观遗传学修饰14，以及成釉细胞的凋亡15,16,17,18。全球范围内，地下水中氟化物浓度升高（>1.5 ppm）构成了重要的健康问题。最近一项预测性建模研究估计，全球约有1.8亿人可能受到过量氟化物暴露的影响，其中以亚洲和非洲的负担最重1。除饮用水外，氟化物暴露还可通过食物（如海产品；约1.9 ppm）、饮料（如茶；0.5–6 ppm19）以及牙科产品（如牙膏20，1,000–1,500 ppm）发生。
因此，了解氟化物的暴露、代谢及其在组织中的沉积，对于评估其治疗益处和潜在毒理学后果至关重要。准确量化生物样本（包括尿液、血清、骨骼和牙齿）中的氟化物是此项工作的关键组成部分。然而，由于氟化物的化学性质及其对富含钙基质的强亲和力，其检测在分析上具有挑战性。人体内约99%的氟化物存在于骨和牙等矿化组织中21。为应对这些挑战，已开发出多种分析技术，包括离子选择性电极（ISE）电位法、离子色谱法、比色测定法、滴定法以及基于核反应或活化的方法22。其中，六甲基二硅氧烷（HMDS）辅助扩散技术结合氟离子选择性电极检测，因其高灵敏度、良好重现性以及适用于多种样品类型，已成为生物基质分析中最可靠且应用最广泛的方法之一23,24,25,26,27,28,29。
尽管存在多种分析方法，但每种方法均有其局限性，可能限制其在实验或临床研究中的应用。离子色谱法具有高灵敏度和高选择性，但需要专用仪器和复杂的样品前处理30,31。比色法（如SPADNS法，即2-(对磺基苯基偶氮)-1,8-二羟基萘-3,6-二磺酸钠法）操作简单且成本低廉，但易受浊度和内源性发色团的干扰，从而限制了其在复杂生物样品中的可靠性22,32,33。滴定法经济且操作简便，但在大多数生物样本中，其灵敏度不足以检测痕量氟离子34。基于核反应或活化的方法虽具有极高的灵敏度，但需要核反应堆或基于加速器的中子源，因此难以在常规实验室中推广应用35。相比之下，HMDS辅助扩散结合离子选择电极（ISE）测定法在灵敏度、成本和可及性之间实现了良好的平衡，同时可确保从软组织和矿化组织中完全释放氟离子。该方法在小动物研究中尤为有利，因为在这些研究中组织样本量有限，而小鼠门齿等矿化结构每颗牙齿仅能提供3–5 mg的灰化物。
扩散-ISE法能够将所有释放的氟化物富集到一个微小且明确的体积中，从而实现对极微量样品的准确定量。这使得该方法非常适用于毒代动力学研究、剂量-反应实验以及跨发育阶段的氟化物代谢研究。小型啮齿类动物，尤其是C57BL/6J小鼠，已被广泛用作研究氟化物效应的动物模型7,9,12,29,36。
在本实验方案中，作者采用HMDS促进扩散法结合氟离子选择性电极测定法，定量分析经高浓度氟（125 ppm）暴露的小鼠血清、骨骼和牙齿中的氟含量，并与未经处理的对照组进行比较。作者进一步比较了青春期（处理开始时为6周龄）与成年期（处理开始时为18周龄）小鼠中氟的蓄积情况，以评估氟代谢及组织沉积的年龄依赖性差异。下颌切牙被选为代表性的牙体组织，因为啮齿类动物的切牙会持续萌出，并在约7周龄时达到萌出与咬合磨损之间的稳态平衡。这种持续生长的特性提供了稳定且易于观察的釉质发育梯度，使得小鼠切牙成为研究釉质形成及氟斑牙的广泛应用且经过充分验证的模型。

<table><tbody><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco, GR ACS</td><td>AX0073-6</td></tr><tr><td>氧化铝坩埚</td><td>Advalue Technology</td><td>12 mm 外径 &amp;times; 25 mm 高，AL-6212</td><td>AL-6212</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>VWR</td><td>VWR 124B2，d = 0.1 mg</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>珠磨机</td><td>Benchmark</td><td>BeadBug 6</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>钝头注射器针头</td><td>Amazon</td><td>工业用钝头针，14 G &amp;times; 0.5 英寸</td><td>X001TT8KX1</td></tr><tr><td>二氧化碳</td><td>AirGas</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>化学通风橱</td><td>Mott Manufacturing</td><td>型号 7421040</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>D(+)-蔗糖</td><td>Thermo Scientific</td><td>生化级，纯度 99.7%</td><td>177142500</td></tr><tr><td>电极填充液</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus 填充液</td><td>900061</td></tr><tr><td>乙醇溶液</td><td>Koptec</td><td>140 证明度</td><td>2401</td></tr><tr><td>冷冻柜，&amp;minus;80 &amp;deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco RDE 系列</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>耐热手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Clavies 生物危害高压灭菌手套</td><td>H13201</td></tr><tr><td>六甲基二硅氧烷（HMDS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>TCI H0091，>98%</td><td>H0091</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>VWR</td><td>J.T. Baker，30%</td><td>2204-01</td></tr><tr><td>离子选择性电极</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion 氟离子选择性电极，双通道</td><td>9609BNWP</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>360 搅拌器</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>微型刮勺</td><td>Amazon</td><td>蜡雕刮勺 #7A，不锈钢</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>5404000131</td></tr><tr><td>马弗炉</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermolyne 小型台式马弗炉，1.3 L，FB1315M</td><td>FB1315M</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Boekel Scientific</td><td>Boekel RapidFISH</td><td>240200</td></tr><tr><td>PBS 中的多聚甲醛溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>4% 多聚甲醛 PBS 溶液</td><td>J19943-K2</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>60 &amp;times; 15 mm，未处理</td><td>25384-092</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Thermo Scientific</td><td>白色纯净凡士林</td><td>417090010</td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>pH-Fix 4.5&amp;ndash;10.0</td><td>92120.3</td></tr><tr><td>瓷皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand 坩埚，5 mL，20 mm 高，高型</td><td>FB-965-B</td></tr><tr><td>电位计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Dual Star pH/ISE 测量仪</td><td>2115102</td></tr><tr><td>带夹铁架台</td><td>VWR</td><td>环形夹，15 cm</td><td>470104-526</td></tr><tr><td>啮齿类动物饲料</td><td>Bio-Serv</td><td>F1515，AIN-76A，&amp;frac12; 颗粒</td><td>F1515</td></tr><tr><td>剪式千斤顶</td><td>Amazon</td><td>实验室用剪式千斤顶</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>分液漏斗</td><td>Fisher Scientific</td><td>Eisco，硼硅酸盐玻璃，2 L</td><td>S89285</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS 认证，结晶状</td><td>S271-1</td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS 认证，粉末状</td><td>S299-100</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>白色颗粒</td><td>BP359-500</td></tr><tr><td>不锈钢珠</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific Industries，5 mm，100 个</td><td>SI-CS05</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS 级</td><td>A300-500</td></tr><tr><td>TISAB II</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus 应用溶液</td><td>940909</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Space Saver 真空干燥器，10 英寸</td><td>F42010-0000</td></tr><tr><td>真空滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>Flow 瓶顶滤器，PES，90 mm，0.2 &amp;micro;m</td><td>597-4520</td></tr><tr><td>可调摇床</td><td>MidSci</td><td>LabDoctor / Benchmark Scientific</td><td>&amp;mdash;</td></tr></tbody></table>

利用六甲基二硅氧烷促进扩散结合离子选择性电极法测定小鼠模型血清、骨骼和牙齿中氟化物含量

Quantification of Fluoride in Serum, Bone, and Teeth in a Murine Model Using Hexamethyldisiloxane-Facilitated Diffusion and Ion-Selective Electrode Measurements

定量检测生物组织中的氟化物水平对于理解氟暴露、代谢及毒性至关重要。本方案描述了一种灵敏且可重复的方法，用于测定血清、骨骼和牙齿中氟离子质量，该方法基于六甲基二硅氧烷（HMDS）促进的扩散技术，随后采用离子选择性电极（ISE）进行分析。从接受可控氟处理的小鼠体内采集生物样本，包括血清、股骨和下颌切牙。骨和牙齿样本经灰化、研磨和水合处理，而血清则直接处理。将每份样本转移至含有超纯水的扩散皿中，并用涂有凡士林的盖子密封，盖子内表面附有氢氧化钠液滴，作为氟捕获陷阱。注入HMDS饱和的硫酸以启动氟的释放与扩散，使释放出的氟离子被定量捕获于陷阱中。经过一夜扩散后，收集所有氟陷阱液滴合并为单一样品，调节至所需pH范围，并定容至特定体积用于ISE测定。通过已知氟质量制备的校准扩散皿建立标准曲线以实现定量，同时使用质量控制样本来验证电极稳定性。来自暴露于0或125 ppm氟的青春期和成年小鼠的代表性结果表明，该方法能够检测血清、骨骼和牙齿中氟含量随年龄和剂量变化的差异。本方案提供了一种基于校准的可靠方法，适用于多种生物基质中氟的定量，特别适合在小鼠模型中开展氟暴露、组织沉积及毒理学效应的研究。该方法的一个关键优势在于其能够准确测定极微量样本中的氟含量，例如单个小鼠切牙灰化后仅得3–5 mg灰分，由于扩散过程可将所有释放的氟富集至小于100&#160;µL的可测样液体积中，仍可实现精确测量。

为了展示本方案在测定生物材料中氟离子（F-）浓度方面的应用，实验样本来源于接受可控氟处理的小鼠的血清、骨骼和下颌切牙标本。雄性C57BL/6J小鼠分为两个年龄组：青春期（6周龄）和成年期（18周龄），每组分别给予无氟去离子水（0 ppm F⁻）或含氟化钠的饮用水（125 ppm F⁻），持续暴露6周。每个年龄组和处理条件下均包含5只动物。在暴露期结束后，采集血清、股骨和下颌切牙，按照本方案制备并分析样本。下文总结了在血清、骨骼和牙齿中测得的代表性氟浓度。
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig4.jpg" /> 
图4：血清、股骨和下颌切牙中测得的氟化物浓度。 雄性C57BL/6J小鼠分为两个年龄组：青春期（6周龄，空心柱）和成年期（18周龄，实心柱），分别给予无氟去离子水（0 ppm F⁻）或含氟化钠的饮用水（125 ppm F⁻），暴露期为6周。在暴露期结束时，测定同一处理组中（A）血清、（B）股骨和（C）下颌切牙中的氟含量。低于检测限的血清值（&#60;0.02 ppm）为便于可视化而绘制，但未纳入统计分析。数据以均值±标准差表示。青春期组与成年组之间的比较采用Mann–Whitney U检验，并对多重比较进行Bonferroni–Dunn校正。 *p &#60; 0.05，**p &#60; 0.01（N = 5/组）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
血清中的氟化物浓度 
在给予0 ppm氟化物处理的青少年组和成年组中，血清氟化物浓度均低于离子选择电极的检测限（&#60;0.02 ppm）。在125 ppm处理组中，青少年组的血清氟化物浓度升高至0.3 ± 0.2 ppm，成年组则升高至0.7 ± 0.2 ppm（p = 0.06）。采用Mann–Whitney U检验对125 ppm处理的青少年组与成年组进行比较，并通过Bonferroni–Dunn校正进行多重比较校正。 *p &#60; 0.05，**p &#60; 0.01（N = 5/组）。0 ppm处理组未纳入统计分析。（图4A、表1）。
股骨中氟化物浓度 
在0 ppm处理组中，青少年动物的股骨氟化物浓度（292 ± 39 ppm）显著低于成年动物（896 ± 55 ppm）（p &#60; 0.01）。相反，在125 ppm处理组中，青少年动物的氟化物浓度（4,108 ± 482 ppm）显著高于成年动物（2,966 ± 612 ppm）（p = 0.04）。青少年组与成年组之间的比较采用Mann–Whitney U检验，并对多重比较进行Bonferroni–Dunn校正。 *p &#60; 0.05，**p &#60; 0.01（N = 5/组）。(图4B，表1)。图5A显示了每个年龄组在0 ppm与125 ppm处理之间股骨氟化物的倍数变化。在125 ppm剂量下，青少年动物的氟化物水平增加了14倍，而成年小鼠仅增加了3倍。
下颌切牙中的氟化物浓度 
在0 ppm组中，青少年动物的下颌切牙氟化物浓度（35 ± 4 ppm）显著低于成年动物（123 ± 23 ppm）（p = 0.03）。在125 ppm处理组中，青少年动物切牙氟化物浓度升高至5641 ± 955 ppm，成年动物则为4392 ± 1694 ppm。青少年组与成年组之间的比较采用Mann–Whitney U检验，并对多重比较进行Bonferroni–Dunn校正。 *p &#60; 0.05，**p &#60; 0.01（N = 5/组）。（图4C、表1）。尽管在125 ppm条件下，不同年龄组之间的绝对氟化物浓度差异无统计学意义，但从0 ppm到125 ppm的倍数变化在青少年小鼠中（增加161倍）显著高于成年小鼠（增加36倍）（图5B）。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig5.jpg" /> 
图5：与成年小鼠相比，青春期小鼠的骨和门齿氟蓄积倍数增加更为显著。 青春期（空心柱）和成年（实心柱）小鼠在0 ppm与125 ppm氟处理下氟浓度的倍数变化。（A）股骨骨组织；（B）同一处理组的下颌门齿。数据以均值±标准差表示。青春期组与成年组之间的比较采用非配对t检验。* p &#60; 0.05（N = 5/组）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样本</td>
			<td colspan="4">血清</td>
			<td colspan="4">股骨</td>
			<td colspan="4">下颌切牙</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>年龄组</td>
			<td colspan="2">青春期</td>
			<td colspan="2">成熟期</td>
			<td colspan="2">青春期</td>
			<td colspan="2">成熟期</td>
			<td colspan="2">青春期</td>
			<td colspan="2">成熟期</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>处理组</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>324</td>
			<td>4576</td>
			<td>933</td>
			<td>3081</td>
			<td>37</td>
			<td>4824</td>
			<td>161</td>
			<td>3229</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.1</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>229</td>
			<td>3778</td>
			<td>924</td>
			<td>3326</td>
			<td>39</td>
			<td>5451</td>
			<td>127</td>
			<td>2654</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300</td>
			<td>4683</td>
			<td>877</td>
			<td>3713</td>
			<td>31</td>
			<td>5544</td>
			<td>112</td>
			<td>6997</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.4</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>323</td>
			<td>3832</td>
			<td>807</td>
			<td>2519</td>
			<td>35</td>
			<td>5114</td>
			<td>103</td>
			<td>4169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>283</td>
			<td>3669</td>
			<td>937</td>
			<td>2192</td>
			<td>N/A</td>
			<td>7271</td>
			<td>111</td>
			<td>4909</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>均值</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>292</td>
			<td>4108</td>
			<td>896</td>
			<td>2966</td>
			<td>35</td>
			<td>5641</td>
			<td>123</td>
			<td>4392</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标准差</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2</td>
			<td>39</td>
			<td>482</td>
			<td>55</td>
			<td>612</td>
			<td>3</td>
			<td>955</td>
			<td>23</td>
			<td>1694</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：血清、股骨和下颌门齿中氟化物的个体测量值。 表1列出了在暴露于0 ppm或125 ppm氟化物的青少年期和成年期小鼠中，血清、股骨及下颌门齿样本中测得的个体氟浓度（ppm F⁻）。对于每种组织类型，数据按四组处理组分别以列呈现：青少年期0 ppm组、青少年期125 ppm组、成年期0 ppm组和成年期125 ppm组。每列包含五个独立记录的数值（N = 5），随后为计算所得的均值和标准差（SD）。在青少年期0 ppm血清组中，所有记录值均低于离子选择电极的检测限（&#60;0.02 ppm）。该表提供了图4中所示汇总值及统计比较所依据的原始数值数据。

本实验方案描述了六甲基二硅氧烷（HMDS）促进扩散皿的制备，随后采用离子选择性电极法测定小鼠血清、骨骼和牙齿中氟离子质量。该方法提供了一种基于校准的高灵敏度检测手段，用于评估氟在生物样本中的蓄积情况。

量化生物组织中的氟化物水平对于理解氟化物的暴露、代谢及毒性至关重要。本方案描述了一种……

本研究旨在定量分析经氟化物处理的小鼠血清、骨骼和牙齿中的氟离子浓度。现有方法通常需要较大样本量或使用昂贵的仪器。本方案可对微升级或毫克级样本中的氟化物进行测定。首先，从饮用含氟化钠水或无氟水的青春期及成年C57BL/6J小鼠体内切除腿骨。干燥后，将骨组织转移至氧化铝坩埚中，然后在马弗炉中以每小时150摄氏度的升温速率升至600摄氏度，灼烧6小时。将一个 60 × 15 毫米的未处理培养皿置于洁净的表面上。使用加热的 18 号注射器针头，在培养皿盖上熔出一个小孔。接着，用装有钝头 14 号针头的 10 毫升注射器，将凡士林连续涂抹在培养皿盖的内缘，形成密封圈。使用微型刮勺，在 1.5 毫升微量离心管内将煅烧后的骨骼研磨成细粉，并立即对骨灰粉末进行后续处理。将被骨灰污染的一次性耗材丢弃至机构指定的化学废弃物处理系统中。将研磨后的骨灰转移至小型瓷皿中，以尽量减少静电并防止粉末飞散。随后，将培养皿的空底部置于可读性至少为 0.1 毫克的分析天平上。使用微型刮勺加入约 5 毫克骨灰，并记录精确重量。立即用 3 毫升超纯水覆盖已称重的骨灰。加入 50 微升 0.05 当量的氢氧化钠，分三滴加至培养皿盖内表面靠近边缘但远离边缘的位置，以形成氟化物捕获阱。将培养皿盖翻转，注意不要扰动氢氧化钠液滴。用凡士林将皿盖与培养皿底部紧密密封。通过将等体积的 6 当量 HMDS 饱和硫酸与超纯水混合，配制 3 当量 HMDS 饱和硫酸溶液。立即取 3 毫升 freshly 制备的溶液装入带有 20 号针头的 10 毫升注射器中。通过皿盖上的孔将溶液注入扩散皿底部的水中。拔出针头时需小心，避免酸液溅到皿盖内表面。迅速用凡士林完全封住注射孔。将扩散皿置于可调速摇床，设置为低速，室温孵育过夜。开始测量前，将装有填充液的离子选择性电极安装在电极架上，并连接至电位计。将一个未处理的培养皿置于剪式升降台上方，位于电极感应面正下方，确保感应面与培养皿底部平行。升高剪式升降台的台面，直至培养皿几乎接触到电极。孵育结束后，从摇床上取出扩散皿。小心揭开盖子，破坏凡士林密封。然后将盖子倒置放在平坦表面上，注意不要扰动其中的三个氟离子捕获液滴。接着使用P20移液器向其中一个氟离子捕获液滴中加入15至20微升0.2 N乙酸，并在不更换移液器吸头的情况下将三个液滴合并为一个液滴。将合并后的样品保留在倒置的盖子上。将P100移液器调至75微升。完全吸取氟离子捕获液，避免引入气泡，并使用超纯水将样品体积精确调整至75微升。立即进行测量。将样品滴加在氟离子选择性电极的感应面与培养皿之间，确保整个感应面浸没在液体中，且不接触培养皿。待读数稳定后，从电位计显示屏上记录电极电位（单位为毫伏）。在饮用无氟水的小鼠中，青少年小鼠的股骨氟浓度显著低于成年小鼠。相反，在暴露于125 ppm氟后，该模式发生逆转，青少年小鼠的股骨氟浓度显著高于成年小鼠。氟暴露后，青少年小鼠的股骨氟浓度升高了14倍，而成年小鼠仅升高了3倍。本方案可准确测定极小体积样本中血清和矿化组织的氟化物浓度。必须确保精确称重的灰化样品完全转移至扩散皿中，任何损失均会影响结果。我们希望未来的研究能够采用此方法，揭示氟化物蓄积对组织健康、疾病风险及衰老的影响。

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科研

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