Name: 利用行为学分析和高内涵成像对斑马鱼幼鱼中多巴胺能神经变性的活体表型鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解利用化学遗传学消融和高内涵成像技术，在斑马鱼幼鱼中建立高通量多巴胺能神经变性表型分析平台的方法。该流程支持神经保护药物的快速筛选与可重复性研究。

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感谢加州大学旧金山分校的苏果博士提供转基因斑马鱼，感谢加州大学欧文分校的Daeseok Eom博士、Michael Parsons博士和Eddie Hallo提供野生型胚胎以及在斑马鱼饲养和鱼类设施维护方面的指导。同时感谢加州大学欧文分校Robert A. Mah分子创新中心和Falling Leaves创新大楼的工作人员为水生设施提供的基础设施支持。

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作者声明不存在利益冲突。

本方案提供了一种可扩展的体内流程，利用转基因斑马鱼中的NTR–MTZ化学遗传系统，定量多巴胺能神经元的丢失并筛选神经保护化合物。该标准化的基于孔板的操作流程专为本科生研究团队设计，适用于操作人员流动性高且研究人员经验在不同学期间差异较大的情况。流程的每一步均以可重复性和易于培训为优先考虑，确保多名使用者在操作中保持高度一致性且变异最小。本方案通过将治疗前后的成对多巴胺能神经元成像与基于孔板的行为学分析相结合，构建了标准化的工作流程，从而在同一可扩展筛选平台上实现神经元结构损失测量与功能运动结果的比较，推动了现有斑马鱼神经退行性变研究方法的发展。采用此流程，一个96孔板可在4 dpf时包埋并完成基线成像，经24小时处理后，于5 dpf时再次成像。通常，每块板的包埋耗时约1小时，每次成像会话的荧光成像时间约为每板1小时（具体取决于显微镜设置），图像采集完成后，每板的半自动荧光分析约需3小时。
行为检测每孔使用五条幼虫，以提高通量，同时为每次记录保留相对较大的游泳区域。在此模式下，总移动距离可作为比较不同处理条件的可靠群体水平运动终点指标。由于同一孔中存在多条幼虫，可能会出现短暂的路径交...

神经退行性疾病领域的药物发现研究由于传统哺乳动物模型成本高、通量低而面临显著的效率瓶颈1,2，需要周密的实验设计以及大量人力投入。本方法的总体目标是提供一种标准化、高通量的研究方案，利用Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)转基因斑马鱼模型，在该模型中硝基还原酶-mCherry特异性表达于多巴胺能（DA）神经元，以研究DA神经元丢失及运动功能障碍。采用该技术的理论依据在于神经退行性疾病研究迫切需要严谨、可扩展且经济可行的体内模型3,4,5。尽管体外细胞培养可用于快速药物筛选，但缺乏完整的神经环路和整体生物体环境，难以实现转化应用的相关性6。相比之下，啮齿类动物模型虽能提供优良的生理背景，但在神经保护化合物的初期高通量筛选中成本高昂且耗时较长7,8。
斑马鱼具有快速的幼体发育过程以及光学透明性，这使其能够 体内 全脑成像，以及与疾病相关通路（特别是神经退行性变相关通路）的高度遗传保守性9,10,11该方案特别整合了标准化的饲养流程、通过甲硝唑（MTZ）实现的化学遗传学消融，以及高通量成像与功能性行为追踪技术。直接测量运动活动可为多巴胺能神经元丢失提供可靠的行為学相关指标，因为多巴胺神经元的丢失与行为异常密切相关。12,13,14标准化的基于孔板的实验格式可最大限度地减少不同操作者之间的实验差异，而斑马鱼幼体系统的高通量特性支持大样本量，二者结合提供了足够的统计效能以检测神经保护作用。这使得该方案特别适用于需要可扩展且可重复筛选的应用场景，包括研究人员经验水平参差的情况。

<table><tbody><tr><td>成年斑马鱼饲料，0.5 mm 颗粒</td><td>Zeigler</td><td>AH271</td><td>用于常规饲养期间喂养成年斑马鱼</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖（LMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>用于将幼鱼包埋于孔板中，以便成像时稳定定位</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>ULINE</td><td>S-20197</td><td>用于在制备和孵育过程中保护对光敏感的试剂（如 MTZ）</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td>RRID: SCR_007358</td><td>用于可选的自动化荧光图像分析</td></tr><tr><td>锥形管，15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td>用于试剂制备和样品处理</td></tr><tr><td>锥形管，50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>用于试剂制备和溶液储存</td></tr><tr><td>交配缸（1.0 L）</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>用于控制斑马鱼繁殖和胚胎收集</td></tr><tr><td>Danio rerio（AB 野生型）</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>非转基因对照品系，用于验证硝基还原酶依赖性效应的特异性</td></tr><tr><td>Danio rerio（Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)）</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>转基因斑马鱼品系，在多巴胺能神经元中表达硝基还原酶-mCherry，用于靶向化学遗传消融</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO），无水（&amp;ge;99.9%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-500ML</td><td>用作 PTU、MTZ 和筛选化合物的溶剂</td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus</td><td>RRID: SCR_000441</td><td>行为追踪软件，用于量化幼鱼运动</td></tr><tr><td>Fiji（ImageJ）</td><td>NIH</td><td>RRID: SCR_003070</td><td>图像分析软件，用于荧光定量分析</td></tr><tr><td>细尖镊子或 0.25 mm 探针</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI0118</td><td>用于琼脂糖包埋过程中调整幼鱼方向</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>11845460</td><td>通过 mCherry 荧光成像多巴胺能神经元</td></tr><tr><td>Gemma Micro 150 ZF（幼鱼饲料，100&amp;ndash;200 &amp;mu;m）</td><td>Skretting</td><td>10818945</td><td>用于喂养幼年斑马鱼</td></tr><tr><td>Gemma Micro 75 ZF（幼体饲料，50&amp;ndash;100 &amp;mu;m）</td><td>Skretting</td><td>10818935</td><td>用于喂养斑马鱼幼体</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>RRID: SCR_002798</td><td>统计分析软件，用于数据分析和绘图</td></tr><tr><td>加热块（可达到 42&amp;deg;C 和 70&amp;deg;C）</td><td>Thermo Fisher</td><td>88870001</td><td>用于熔化并维持琼脂糖在受控温度下</td></tr><tr><td>高分辨率相机（支持俯视安装）</td><td>Basler</td><td>88-327</td><td>用于记录幼鱼运动活动</td></tr><tr><td>盐酸（HCl），0.1 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA48-500</td><td>用于三卡因溶液制备过程中的 pH 调节</td></tr><tr><td>培养箱（28.5&amp;deg;C，14 小时光照:10 小时黑暗光周期）</td><td>Millipore</td><td>Z763314</td><td>维持斑马鱼发育所需的受控环境条件</td></tr><tr><td>Instant Ocean 海盐</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td>用于制备蓝色养卵水（BEW）</td></tr><tr><td>漫射光片（或等效材料）</td><td>Edmund Optics</td><td>27-103</td><td>用于提供均匀照明，并在行为记录期间最小化反光</td></tr><tr><td>光源板</td><td>Lightcraft</td><td>LC2004LED</td><td>在运动追踪期间提供底部照明</td></tr><tr><td>甲硝唑（MTZ）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761-100G</td><td>用于多巴胺能神经元的化学遗传消融</td></tr><tr><td>亚甲蓝，1% 水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>添加至 BEW 中以防止胚胎微生物生长</td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>用于试剂分装和储存</td></tr><tr><td>移液器，P200</td><td>Gilson</td><td>FP10005S</td><td>用于处理幼鱼和配制溶液</td></tr><tr><td>培养皿，100 mm</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>用于胚胎收集和孵育</td></tr><tr><td>移液器吸头，200 &amp;mu;L</td><td>RAININ</td><td>30389188</td><td>与移液器配合使用，用于液体操作和幼鱼转移</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl），&amp;ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td>用于缓冲液和水溶液的配制</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH），0.1 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS256-500</td><td>用于三卡因溶液制备过程中的 pH 调节</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td>用于包埋过程中幼鱼的操作和定向</td></tr><tr><td>温控加热垫（25&amp;deg;C&amp;ndash;28&amp;deg;C）</td><td>Vivosun</td><td>V-SHMDT</td><td>在行为记录期间维持稳定温度</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（MS-222）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>用作斑马鱼幼体的麻醉剂</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>用于配制缓冲型三卡因溶液</td></tr><tr><td>水纯化系统</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7003T0</td><td>用于生成去离子水以配制溶液</td></tr><tr><td>斑马鱼饲养缸</td><td>Aquaneering</td><td>ZS560</td><td>用于维持成年斑马鱼种群</td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>用于抑制黑色素生成，保持光学透明性</td></tr><tr><td>6 孔板，平底</td><td>Corning</td><td>07-200-83</td><td>用于运动行为检测</td></tr><tr><td>96 孔板，平底</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655096</td><td>用于高通量成像和筛选检测</td></tr></tbody></table>

利用行为学分析和高内涵成像对斑马鱼幼鱼中多巴胺能神经变性的活体表型鉴定

In Vivo Phenotyping of Dopaminergic Neurodegeneration in Zebrafish Larvae Using Behavioral Analysis and High-Content Imaging

神经退行性疾病药物发现研究受到传统哺乳动物模型高成本和低通量的限制。这一瓶颈在帕金森病研究中尤为突出，其中多巴胺能（DA）神经元变性的严格且可扩展的研究仍进展缓慢且耗费大量资源。为弥补这一空白，我们提出一种标准化的高通量表型分析流程，利用在DA神经元中表达硝基还原酶的转基因斑马鱼模型，可在受精后五天内研究DA神经元的丢失。斑马鱼在转化神经科学中具有显著优势，包括幼体发育迅速、光学透明性，从而能够实现 体内 全脑成像、帕金森病相关基因与通路的高度保守性，以及细胞培养模型无法实现的完整神经环路。本实验方案结合化学遗传学消融与高内涵成像技术，以快速生成用于筛选的数据集。多巴胺能神经元通过甲硝唑（MTZ）实现特异性消融，从而产生可调控且特异的神经退行性变。MTZ处理导致运动能力呈剂量依赖性下降，表现出类似运动迟缓的表型，为多巴胺能神经元丢失提供可靠的行為学相关指标。鉴于帕金森病本质上是一种运动障碍疾病，我们结合解剖学测量与功能性行为读数进行分析。运动活动直接在孔板中记录，并通过自动追踪系统进行量化，提取的参数包括总移动距离、游泳爆发频率及启动次数。斑马鱼是一种高效且可扩展的模型系统，可同时对数百个幼体进行检测，操作简便。我们优化了一种高通量、基于孔板的药物筛选流程，旨在减少本科生科研中的实验变异。这种标准化的孔板筛选格式用于评估候选化合物的神经保护或功能挽救效果，确保不同研究人员获得的数据具有统计可比性，有效识别潜在神经保护剂，提升实验可重复性。综上，该方法为神经退行性研究提供了一个稳健且可扩展的技术框架。

MTZ 处理导致剂量依赖性的多巴胺能神经元丢失和运动功能障碍
为了确定MTZ介导的多巴胺能（DA）神经元消融的最佳参数，在24小时处理后，评估了3、4.5和9 mM MTZ浓度下DA神经元存活的替代指标——荧光强度以及运动距离。每个处理组包含n = 10条独立的Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)幼鱼，并设有匹配的溶剂对照组（含1% DMSO的BEW溶液，另加200 µM PTU，n = 10）。所有幼鱼均来自经验证的纯合亲本产生的单次产卵后代。与溶剂处理对照组相比，MTZ处理导致DA神经元荧光强度呈剂量依赖性降低，代表性荧光图像（图2）和荧光定量结果（图4B）均显示了这一趋势。行为学分析表明，MTZ处理后幼鱼的总运动距离也呈剂量依赖性减少（图4A）。线性回归分析进一步显示，各处理组中荧光保留水平与运动输出之间具有良好的一致性（<strong clas...

本方案提供了一种使用标准化、高通量化合物筛选方法 体内 利用斑马鱼量化多巴胺能神经元的丢失及运动行为缺陷，从而实现对神经保护化合物的高效筛选。

神经退行性疾病药物发现研究受到传统哺乳动物模型高昂成本和低通量的限制。这一瓶颈是……

我们的研究探讨帕金森病中多巴胺能神经元的退化，并筛选新型神经保护化合物。本研究方案所解决的研究空白在于，它恰好介于传统的非情境化细胞模型与耗时较长的啮齿类动物模型之间。我们的斑马鱼模型为应对神经退行性疾病（如帕金森病）中这些极具挑战性的药物发现提供了快速且可扩展的方法。首先，将含有纯合转基因斑马鱼胚胎的养殖水通过孔径为400微米的滤网过滤。将胚胎转移至一个含有30毫升蓝色卵水（Blue Egg Water, BEW）的100毫升培养皿中，在28.5°C条件下培养，光照周期为14小时光照、10小时黑暗。在受精后24至36小时，配制含有BEW和60微升1-苯基-2-硫脲（PTU）的混合液，使PTU终浓度为200微摩尔。将胚胎转移至该混合液中，以维持幼鱼的透明性。在受精后第3天，使用固定的显微镜设置，通过mCherry通道对经160微克/毫升三卡因（Tricaine）麻醉的幼鱼进行筛选。若在固定的筛选条件下，于间脑腹侧多巴胺能神经元簇的预期位置观察到清晰的mCherry荧光，则将幼鱼归类为阳性。若该区域无高于背景的信号，或荧光微弱、弥散或异位表达，则弃用该幼鱼。在受精后第4天，将一条麻醉后的幼鱼悬浮于40微升1.2%低熔点琼脂糖中，分配至平底96孔板的每个孔内。按照先前所述方法采集处理前的基线荧光图像。根据孔板图将处理溶液直接加入孔中。对于溶剂对照孔，加入含有与化合物处理孔相同终浓度二甲基亚砜（DMSO）的胚胎培养水（BEW）。对于阴性对照孔，加入不含候选化合物的甲硝唑溶液。在化合物筛选孔中，同时加入甲硝唑和10 µM候选化合物，使幼鱼在相同的24小时处理期内同时暴露于两种物质。将每孔调整至终体积200 µL，并保持所有孔中二甲基亚砜的终浓度一致。将孔板置于28.5 °C条件下，按照14小时光照/10小时黑暗循环孵育24小时。在受精后第五天，使用与基线成像相同的采集参数获取处理后的荧光图像。按照基线成像时相同的顺序对各孔进行成像。随后，计算每个处理组的平均总荧光密度。然后将每组的荧光保留率计算为处理后与处理前平均总荧光密度的比值。将各组的荧光保留率数值归一化至对应孔板中溶剂对照组的平均值。将荧光保留率显著高于仅含甲硝唑对照组的候选化合物判定为具有保护作用的候选化合物。将荧光保留率比值显著高于阴性对照组的化合物判定为命中化合物。采用Welch's t检验比较仅含甲硝唑的对照组与各处理组，随后对命中化合物进行验证、确认及深入研究。受精后第四天，将转基因型与AB野生型幼鱼分为三组处理组，每组至少10尾幼鱼。在28.5摄氏度条件下处理24小时。使用宽口移液管，小心地将五尾幼鱼转移至含有2.5毫升新鲜BEW的6孔板的每个孔中，尽量减少携带液体的体积。将6孔板置于具有均匀漫射照明的白色LED光源板上，所有记录过程中均保持温度在25至28摄氏度。使用漫射光源从下方和上方同时照射

in-vivo-phenotyping-dopaminergic-neurodegeneration-zebrafish-larvae

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

利用行为分析和高内容成像对斑马鱼幼虫多巴胺能神经退行性的体内表型分析

本文通过监测幼鱼的运动行为，描述了斑马鱼对有毒化合物的行为反应。该实验方案进一步探讨了斑马鱼幼体对环境污染物反应的一个示例。...

幼虫运动行为检测：斑马鱼幼虫中化合物神经行为毒性的高通量研究方法

来源：Schramm, P. et al. 通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼体和稚鱼全脑组织的活体成像. J. Vis. Exp.

活体成像斑马鱼幼体大脑以可视化小脑神经元

在此，我们提出一种系统性方法，用于开发具有生理相关性、高灵敏度和高特异性的 体内...

体内 建模：利用Danio rerio模拟人类疾病基因组

本实验室开发了一种新型高通量自动成像系统，可用于检测7日龄斑马鱼幼鱼的多种不同行为。该系统适用于在幼鱼暴露于环境毒物或药物后，检测其行为发生的细微变化。...

斑马鱼幼体的自动化高通量行为分析

本文介绍了一种斑马鱼癫痫模型的建立与表征方案，该模型源于对DEPDC5基因的瞬时抑制。...

癫痫斑马鱼模型中的行为与生理学分析

我们介绍了一种用于评估认知功能的行为实验装置。我们提供的数据显示，斑马鱼在完成任务后8周仍能记住该任务。我们还发现，高血糖斑马鱼的认知表现发生改变，表明该实验范式适用于认知与记忆相关研究。...

利用斑马鱼作为模式系统进行的三室选择行为实验

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。...

通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

本实验方案描述了在腹侧间脑（Dn）区域对成年斑马鱼进行脑室内（ICV）注射神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA），并利用敞口水箱实验评估损毁后游泳行为的损伤及后续恢复情况，同时结合视频追踪软件进行分析。...

6-羟基多巴胺诱导的成年斑马鱼帕金森病模型的运动功能评估

本文介绍了一种实验方案 体内...

体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

本文介绍了一种详细的实验方案，利用共聚焦显微镜检测表达GCaMP钙指示剂的转基因斑马鱼脑区中神经活动的方法。...

体内 共聚焦荧光成像技术用于观察部分固定幼年斑马鱼在感觉刺激下诱导的神经活动

本方案建立了一种在MPTP处理的斑马鱼幼虫中进行行为表型分析的范式，用于评估类似帕金森病的运动和非运动功能缺陷。...

基于行为学实验的MPTP诱导斑马鱼幼鱼帕金森病样行为表型分析

了解利用化学遗传学消融和高内涵成像技术，在斑马鱼幼鱼中建立高通量多巴胺能神经变性表型分析平台的方法。该流程支持神经保护药物的快速筛选与可重复性研究。

利用行为学分析和高内涵成像对斑马鱼幼鱼中多巴胺能神经变性的活体表型鉴定

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