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作者感谢Claude Desplan提供了Molecular Instruments的HCR-FISH探针以及dpp-GAL4; UAS-Stinger果蝇品系。作者还感谢Molecular Instruments的Aneesh Acharya和Harry Choi在HCR-FISH技术实施方面提供的技术反馈和讨论。本实验方案改编自此前已发表和未发表的HCR-FISH方法，这些方法由Meg Younger22、Hunter Whitbeck、Bogdan Sieriebriennikov、Amanda Araujo Gomes Ferreira、Yen-Chung Chen和Yanqiqi Zeng开发。Bogdan Sieriebriennikov得到了人类前沿科学计划（HFSP，项目编号LT000010/2020-L）的支持。Jennifer Malin得到了美国国立卫生研究院（NIH）R00资助项目EY032269的支持。

Drosophila melanogaster 的所有实验均按照纽约市立学院、哥伦比亚大学和纽约大学关于实验生物护理与使用的指南进行。本实验方案中使用的研究工具列于材料表中。
1. 准备缓冲液
注意：使用滤芯枪头，在无核酸酶的离心管中配制所有试剂。 
注意：整个操作过程中需佩戴手套。实验开始前，用RNase去污染溶液清洁工作台面。 
<ol>
	<li>准备无核酸酶溶液
	<ol>
		<li>通过将20x PBS、Triton X-100和甘氨酸溶于无核酸酶水中，配制1x PBS-T，终浓度为1x PBS、1% (v/v) Triton X-100和1 mM甘氨酸。</li>
		<li>通过将20x SSC和Tween-20溶于无核酸酶水中，配制5x SSCT，终浓度为5x SSC并含0.1% (v/v) Tween-20。</li>
		<li>将20x PBS用无核酸酶水稀释，配制1x PBS。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 设计探针
<ol>
	<li>要设计商业探针，选择&#160;目标物种中感兴趣的目的亚型&#160;使用供应商的网页界面订购与所需扩增子匹配的探针。 
	注意： 商业化的HCR探针化学体系及引发序列均为专有技术&#160;并由 Molecular Instruments 持有专利。
	<ol>
		<li>修改目标区域&#160;如果需要进行转录本特异性或pre-mRNA检测，可使用网络界面。</li>
		<li>为高表达转录本订购约20个探针，对于整体样本中低丰度转录本，可使用多达40个探针。 黑腹果蝇 制备物。 
		注意： 为较短的转录本订购专用的寡核苷酸，以适应较少的探针结合位点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手动设计探针时，需下载目标转录本的FASTA序列。确定是针对单一转录本还是该基因的所有转录本。 
	注意： 优先选择从RNA测序数据集中鉴定出的组成型外显子或高表达的转录本异构体&#160;增强信号
	<ol>
		<li>若设计用于前体mRNA检测的探针，应设计跨越内含子-外显子连接区的探针。探针应跨越剪接位点&#160;检测成熟转录本。使用内含子探针检测细胞核内的新生转录本。 
		注意： 内含子探针可能不会与成熟的细胞质转录本共定位，因此可能需要额外的标记物来识别细胞。</li>
		<li>确定探针集大小。对于短转录本，在无法设计较大探针集的情况下，至少使用约5个探针；标准应用使用20个探针；对于整体样本中实现最佳灵敏度，建议使用约40个探针。18,23.</li>
		<li>若自行设计探针，应使用由2bp间隔区分开的25nt序列，并在每条寡核苷酸的5’端添加分裂的引发序列。 
		注意： 尽管第一代分裂启动子序列已公开，但新一代商业化的启动子序列属于专有技术18.</li>
		<li>若自行设计探针，需验证探针序列，确保每组内各探针具有相似的熔解温度，并确认探针间序列完全一致（100%同源性）。 
		注意： 避免富含G的强二级结构区域，并保持各探针之间的GC含量相近24. 尽量减少重复序列，并使用BLAST评估脱靶结合25.</li>
		<li>在适当情况下使用公开可用的探针设计软件26,27. 
		注意： 开源设计工具可能无法重现商业探针设计流程的优化性能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 解剖、固定并预杂交大脑
<ol>
	<li>将探针杂交缓冲液预热至 37 °C。 
	注意：探针杂交缓冲液含有甲酰胺。操作时须佩戴适当的个人防护装备，并在化学通风橱中进行。</li>
	<li>使用无核酸酶的去离子水将每组探针稀释至终浓度为 1 µM。</li>
	<li>将约 250 µL 无核酸酶的 PBS 溶液分装至解剖皿中。</li>
	<li>用镊子将一只自由爬行的三龄幼虫转移至 PBS 中。用一对镊子夹住腹部，用另一对镊子夹住口钩，将口钩从身体上拉开，以分离出脑和腹神经索（VNC）。</li>
	<li>去除脂肪体和唾液腺，保留腹神经索。将解剖得到的脑组织转移至含有 600 µL 冰上预冷的无核酸酶 PBS 的离心管中。 
	注意：在整个解剖过程中保持视叶浸没在液体中，以防止组织干燥。</li>
	<li>重复解剖操作，直至收集到约六个视叶。解剖过程应在 20 分钟内完成，以尽量减少组织降解。</li>
	<li>加入 200 µL 16% 多聚甲醛（PFA），使终浓度达到 4% PFA。轻轻颠倒混匀离心管，并在室温下孵育 15 分钟。 
	注意：PFA 具有毒性和致突变性。操作时须佩戴手套，并在化学通风橱中进行。</li>
	<li>移除样品中的固定液，并按指定化学废弃物处理。用 600 µL 冷的无核酸酶 PBS 洗涤样品三次，使用&#160;解剖皿收集洗涤液。 
	注意：检查洗涤液中是否有组织丢失，并在解剖显微镜下回收任何移位的脑组织。</li>
	<li>将脑组织转移至含有 100 µL 预热探针杂交缓冲液的 PCR 管中。 
	通过轻弹管壁轻轻混匀，在室温下孵育 10 分钟。 
	注意：确保脑组织保持浸没状态，不附着于管壁。</li>
</ol>
4. 杂交探针
<ol>
	<li>通过将每组探针各0.4 pmol加入探针杂交缓冲液中，配制终体积为100 µL的4 nM探针溶液。 
	注意：若初始染色信号强度较低，可将探针浓度提高至16 nM。</li>
	<li>移除预杂交缓冲液时避免扰动组织，向每个样本中加入稀释后的探针溶液。</li>
	<li>将样本置于37 °C摇床上孵育16–24小时。</li>
</ol>
5. 放大探针信号
<ol>
	<li>将扩增缓冲液置于室温。每份样品准备约 200 µL 扩增缓冲液。</li>
	<li>平衡洗涤缓冲液。将探针洗涤缓冲液在水浴中预热至 37 °C&#160;。 
	注意：探针洗涤缓冲液含有甲酰胺。请在化学通风橱中操作。</li>
	<li>移除探针溶液，并于 -20 °C 保存以供重复使用。 
	注意：探针溶液可重复使用，直至染色强度下降。</li>
	<li>在 37 °C 预热的探针洗涤缓冲液中，对样品进行四次洗涤，每次 10 分钟。在室温的 5x SSCT 中对样品进行两次洗涤，每次 5 分钟。</li>
	<li>加入不含发夹探针的 100 µL 扩增缓冲液。在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>将热循环仪预热至 95 °C。将 2 µL 的每种 3 µM 发夹探针原液分别加入不同的 PCR 管中。每种发夹探针准备一个独立的 PCR 管。 
	注意：若染色产生稀疏的点状信号或信噪比较低，应提高扩增剂浓度。</li>
	<li>在 95 °C 孵育发夹探针 90 秒。避光并在室温下继续孵育至少 30 分钟。</li>
	<li>配制扩增溶液。将发夹探针加入扩增缓冲液中，每份样品终体积为 100 µL。</li>
	<li>从样品中移除扩增缓冲液，加入含发夹探针的扩增缓冲液。 
	在避光条件下（用铝箔包裹），于室温在旋转摇床上孵育过夜&#160;。</li>
	<li>移除扩增溶液。在 150 µL 的 5x SSCT 中洗涤样品两次，每次 5 分钟。在 150 µL 的 5x SSCT 中于旋转摇床上洗涤三次，每次 10 分钟。用无核酸酶 PBS 进行两次快速洗涤，以去除去污剂。</li>
</ol>
6. 为成像制备脑组织切片
<ol>
	<li>将成像间隔贴纸粘附到玻璃载玻片上。轻轻按压以确保贴合。&#160;使用镊子的底端去除滞留的气泡。</li>
	<li>使用镊子沿腹神经索将脑部纵向剖开。</li>
	<li>将脑组织置于隔片孔的中央，侧向定位，使视叶朝上。</li>
	<li>加入足量的抗荧光淬灭封片剂（约 25 µL）&#160;用镊子均匀分布封片剂，以填满孔板并避免引入气泡。</li>
	<li>将盖玻片置于样品上，并用指甲油封固。</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本研究描述了一种用于HCR-FISH的改良方法 黑腹果蝇 幼虫视叶。常规 原位 杂交方法在整体幼虫脑组织中通常效果较差，主要由于探针渗透有限和信号强度低。本文介绍的方案通过优化多个关键步骤，提高了发育中视叶染色的质量。通常用于 果蝇 免疫组织化学方法经过调整，以在保持RNA完整性的同时保护组织形态。提高探针和扩增剂的浓度可增强信号强度和信噪比，尤其对于表达较弱的转录本而言效果显著，例如 突然的此外，较短的探针长度改善了在约100 µm厚的幼虫脑组织中的渗透，包括DAPI染色通常渗透受限的区域图 2D).
成功实施本方案需注意若干技术要点。解剖过程中，视叶必须始终保持浸没在缓冲液中，以防止固定前组织脱水。由于HCR-FISH用于检测RNA转录本，所有步骤均应在无RNase的条件下进行，以最大限度减少RNA降解。正确的发夹探针制备对于实现有效的信号放大也至关重要。发夹探针必须在扩增前分别进行变性与冷却，以防止在探针结合前发生过早的聚合反应。
<p ...

理解大脑如何组装需要鉴定出存在的细胞类型多样性以及每种细胞类型中表达的基因库1。单细胞RNA测序技术的最新进展使研究人员能够以高分辨率回答这些问题2。然而，许多单细胞方法无法保留空间信息，因此需要额外的实验将转录组定义的细胞类型簇映射到发育中大脑内的具体位置。
诸如GAL4-UAS的双元基因表达系统可提供位置信息，但无法实现定量分析3。此外，基因表达与报告基因检测之间的时间延迟可能掩盖早期发育阶段中具有生理相关性的表达模式。免疫染色是确定组织特异性表达模式的另一种常用方法4。然而，分泌蛋白通常分布弥散，难以精确定位。
核苷酸标记方法，例如原位杂交（in situ hybridization, ISH），也被广泛用于获取基因表达的空间信息5。在ISH中，标记的DNA寡核苷酸会与目标RNA序列的反向互补序列结合。早期的ISH方法使用放射性标记的DNA探针6，而后续的实验方案则采用了更安全的标记物，如地高辛、荧光素和罗丹明7,8,9。科学家迅速将ISH技术应用于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）研究，用于表征多线染色体的结构，并在整体胚胎中标记如hunchback等间隔基因的表达模式10,11。
尽管原位杂交技术应用广泛，但其在较厚的整体标本（如幼虫视叶）中的应用仍受到若干技术限制。许多 原位 实验方案依赖可扩散的催化报告分子（如辣根过氧化物酶），常导致信噪比较低12此外，许多方法采用针对单一序列的长探针以提高特异性。尽管这种方法有效，但 果蝇 胚胎和多线染色体中，长片段探针难以充分渗透至幼虫脑组织，常导致标记不均10,11,13.
单分子荧光原位杂交（smFISH）与杂交链式反应荧光技术的发展 原位 杂交链式反应荧光原位杂交（HCR-FISH）解决了其中许多局限性14,15通过使用覆盖单个基因区域的一组短探针，单分子荧光原位杂交（smFISH）将探针的平均长度从约1,000 nt减少到约40 nt16这显著提高了探针的穿透性，同时保持了较强的信号强度。HCR-FISH 通过使用荧光标记的放大探针，进一步提高了信噪比，增强了定位准确性并放大了信号输出。重要的是，该扩增步骤似乎与转录本浓度呈线性关系，从而能够对基因表达水平进行定量测量。17.
HCR-FISH 从与靶序列互补的引发探针开始。这些未标记的 DNA 寡核苷酸包含一个单链引发序列，可与荧光标记的 H1 放大探针的输入区结合。H1 放大探针呈发夹结构，在未与引发序列结合时保持催化失活状态。一旦结合，H1 放大探针打开，并暴露出可与配对探针 H2 结合的序列。该相互作用使 H2 发夹结构打开，从而使其能够结合另一个 H1 探针（图 1）15。H1 与 H2 反复结合的循环过程生成一种稳定的聚合物，在放大荧光信号的同时降低背景噪声。由于每个引发序列均特异性对应一对 H1/H2 探针，因此可在同一样本中同时使用具有不同引发序列和荧光染料的多种探针，以标记多个基因。
<img alt="mRNA靶标检测方法、DNA探针杂交示意图、HCR扩增过程、实验时间线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71681/71681fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1790049645000" data-alt="Figure 1"> 
图1：HCR-FISH工作流程的图示。含有引发序列的DNA探针与靶RNA转录本杂交。带有荧光标记的DNA放大发夹结构与引发序列结合，并依次发生聚合，形成稳定的双链扩增链。直接连接荧光染料可提高信号放大效果和信噪比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71681/71681fig1largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
HCR-FISH 技术的近期改进进一步提升了其应用价值。采用分裂引发子探针设计可提高扩增器的特异性，而将HCR引发子与二抗偶联则可实现免疫组织化学与HCR-FISH的同步检测18。此外，目前可选的荧光染料种类不断扩展，现已能够同时对多达10个基因进行多重成像19,20。
尽管HCR-FISH的初步概念验证实验是在斑马鱼（Danio rerio）中进行的，但该方法已在多种体系中得到广泛应用，特别是在缺乏或难以获得抗体的非模式生物中15。探针合成相比抗体制备也提供了更快的替代方案，后者通常需要数月的开发时间。因此，HCR-FISH为通过单细胞RNA测序数据集鉴定出的候选基因提供了快速验证手段21。即使在已建立的遗传模式生物中，当GAL4报告系统或免疫组织化学无法充分标记特定细胞群体时，HCR-FISH仍是一种用于空间定位新生神经元的有价值方法。
本文介绍了一种针对三龄幼虫优化的HCR-FISH实验方案 果蝇 视叶。该方案借鉴了先前在其他生物中发表的方法，并将其应用于 果蝇 视觉系统22常用的固定条件 果蝇 免疫组织化学方案已针对FISH应用进行了优化。提高了探针和发夹的浓度，以增强信号强度并改善试剂对组织的穿透性。采用PCR管代替点样板，以减少试剂消耗并简化对小型组织样本的操作。此外，洗涤和杂交时间也相应缩短，以适应更小尺寸的样本 果蝇 与其他常用于HCR-FISH的昆虫系统相比，脑组织的相对复杂性。
代表性应用表明，该方法可在发育过程中为特定神经元群体提供位置信息。这些实验表明，与抗体染色或报告基因品系相比，某些转录本（如abrupt）可通过HCR-FISH更早地被检测到。本文还讨论了在研究黑腹果蝇（Drosophila）视觉系统发育过程中应用HCR-FISH可能面临的挑战、故障排除策略及其应用前景。

<table><tbody><tr><td>10% Tween-200</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1662404</td><td>NA</td></tr><tr><td>20x PBS，pH 7.4</td><td>Growcells.com</td><td>MRGF-6396</td><td>2.74 M NaCl，53.7 mM KCl，20.3 mM Na2HPO4，29.4 mM KH2PO4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>高质量生物学</td><td>351-003-131</td><td>3M NaCl，0.3M 柠檬酸钠</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C孵箱</td><td>Fisher Scientific（Isotemp）</td><td>15-015-2633</td><td>NA</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD15D</td><td>NA</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Reynolds Wrap/Fisher Brand</td><td>15-078-291</td><td>NA</td></tr><tr><td>抗体：小鼠抗Abrupt</td><td>DSHB</td><td>突然；RRID: AB_528344&amp;nbsp;</td><td>稀释比例：1:20</td></tr><tr><td>抗体：鸡抗GFP</td><td>Millipore Sigma</td><td>目录号 06-896；RRID: AB-619712</td><td>稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>抗体：兔抗GFP</td><td>Life Technologies</td><td>#11122；RRID：AB_221569</td><td>稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>抗体：兔抗 Dll</td><td>Genscript/Desplan 实验室</td><td>-</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗体：大鼠抗NCadherin</td><td>DSHB</td><td>DN-Ex #8，RRID: AB_528121</td><td>稀释比例：1:50</td></tr><tr><td>抗体：兔抗 SoxN</td><td>Genscript/Desplan 实验室</td><td>-</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗体：豚鼠抗Traffic jam</td><td>D. Godt 惠赠</td><td>-</td><td>稀释比例：1:2,000</td></tr><tr><td>抗体：驴抗大鼠 405</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>货号 # 712-475-150；RRID: AB_2340680</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>抗体：驴抗鸡488</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>货号 #703-545-155；RRID: AB_2340375</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗体：驴抗小鼠488</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>货号 #715-545-151；RRID: AB_2341099</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗体：驴抗兔 488</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>编号 #711-545-152；RRID: AB_2313584</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗体：驴抗兔 A555</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>目录号 #A-31572；RRID: AB_162543</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗体：驴抗大鼠Cy3</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>货号 #712-165-153；RRID: AB_2340667</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗体：驴抗豚鼠 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>货号 #706-605-148；RRID: AB_2340476</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗体：驴抗大鼠647</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>货号 #712-605-153；RRID: AB_2340694</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S36940（SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂）</td><td>其他慢速淬灭剂也可以使用，包括含 DAPI (S36936) 的淬灭剂</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM-880</td><td>NA</td></tr><tr><td>盖玻片（22 × 30）</td><td>VWR</td><td>16004-332</td><td>NA</td></tr><tr><td>果蝇：黑腹果蝇：ab-GFP-FLAG</td><td>BDSC</td><td>38626；RRID：BDSC_38626</td><td>NA</td></tr><tr><td>果蝇：黑腹果蝇：Canton S</td><td>BDSC</td><td>64349；RRID：BDSC_64349</td><td>NA</td></tr><tr><td>果蝇：黑腹果蝇：dpp-Gal4</td><td>BDSC</td><td>1553；RRID：BDSC_1553</td><td>NA</td></tr><tr><td>果蝇：黑腹果蝇：ham-GFP.FPTB</td><td>BDSC</td><td>83660；RRID：BDSC_83660</td><td>NA</td></tr><tr><td>果蝇：D. melanogaster：yw；10xUAS-myr-GFP；</td><td>BDSC</td><td>32198；RRID：BDSC_32198</td><td>NA</td></tr><tr><td>果蝇：黑腹果蝇：UAS-Stinger</td><td>BDSC</td><td>84277；RRID：BDSC_84277</td><td>NA</td></tr><tr><td>果蝇：黑腹果蝇&amp;nbsp; wit-KO-Gal4</td><td>BDSC</td><td>600136；RRID：BDSC_600136</td><td>NA</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>#5 或 #55s</td><td>NA</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>16005-106</td><td>NA</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>G7126-10MG</td><td>NA</td></tr><tr><td>HCR 扩增缓冲液</td><td>分子仪器</td><td>HCR Gold RNA-FISH 试剂盒</td><td>NA</td></tr><tr><td>HCR-Gold 放大器</td><td>分子仪器</td><td>HCR Gold RNA-FISH 试剂盒</td><td>NA</td></tr><tr><td>HCR HiFi 探针</td><td>分子仪器</td><td>HCR Gold RNA-FISH 试剂盒</td><td>NA</td></tr><tr><td>HCR探针杂交缓冲液</td><td>分子仪器</td><td>HCR Gold RNA-FISH 试剂盒</td><td>含有甲酰胺</td></tr><tr><td>HCR探针洗涤缓冲液</td><td>分子工具</td><td>HCR Gold RNA-FISH 试剂盒</td><td>含有甲酰胺</td></tr><tr><td>指甲油（透明）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72180</td><td>NA</td></tr><tr><td>无核酸酶水（非DEPC处理）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9937</td><td>NA</td></tr><tr><td>摆动式混合器</td><td>康宁/费舍尔科学公司</td><td>10-320-100</td><td>NA</td></tr><tr><td>多聚甲醛，16%（w/v）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>PCR仪/热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148（C1000 Touch Thermal Cycler）</td><td>NA</td></tr><tr><td>0.2 mL 带圆顶盖条的 PCR 分离管条&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>#1402-2400</td><td>NA</td></tr><tr><td>培养皿（150 × 15 mm；用于制作解剖用培养皿）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>NA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9780</td><td>NA</td></tr><tr><td>间隔片贴纸</td><td>SUNJin</td><td>IS016（iSpacer贴片（0.2 mm深））</td><td>NA</td></tr><tr><td>Sylgard 弹性体试剂盒（用于制作解剖皿）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>NA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>默克密理博西格玛</td><td>X100</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

杂交链式反应fish在发育过程中的应用 果蝇 视叶

Hybridization Chain Reaction FISH in the Developing Drosophila Optic Lobe

理解神经发育需要精确表征基因表达的时间和位置。诸如 原位 杂交技术长期以来已能够实现发育组织中基因表达的可视化。尽管 原位 杂交技术被广泛应用于 黑腹果蝇 胚胎，其在视觉系统发育研究中的应用受到若干技术挑战的限制。例如，较长的探针通常难以充分渗透至视叶，而依赖可扩散催化报告分子（如辣根过氧化物酶）的方法在整体样本制备中往往产生较低的信噪比。荧光杂交链式反应 原位 杂交链式反应荧光原位杂交（HCR-FISH）克服了上述诸多局限，实现了更稳定的信号检测。与传统FISH相同，DNA探针单体可与组织内的RNA序列杂交。然而，在HCR-FISH中，携带荧光标记的放大探针形成稳定的发夹结构，可触发额外单体的聚合，从而增强信号强度。多重探针组的使用还允许采用更短的寡核苷酸（约45 nt，而传统FISH中可达1,000 nt），提高了探针穿透性，并在整体样本中产生更均匀的染色效果。本文介绍了一种优化的HCR-FISH实验方案，适用于 果蝇 幼虫视叶。本方案通过优化固定条件并提高探针和发夹寡核苷酸的浓度，对现有的HCR-FISH方法进行了改进，以增强信号强度和组织穿透性。文中提供了详细的试剂清单和分步操作流程。此外，还展示了该技术在发育神经生物学中的潜在应用，包括新生神经元的可视化，以及在内源标记蛋白或抗体染色等常规方法无法提供足够信息时，对基因表达模式的表征。

对于研究发育神经生物学的科学家而言，HCR-FISH 提供了一种强大的方法，用于可视化基因表达模式，并确定发育中的神经元在 Drosophila 视叶内的空间位置。
在Drosophila视叶中（图2A），髓质神经毡中的神经元起源于由空间模式化的神经上皮产生的神经干细胞（神经母细胞），该神经上皮称为外增殖中心（Outer Proliferation Center, OPC）（图2B）28。这些神经母细胞按顺序表达转录因子，随时间推移产生多样化的神经元类型。因此，神经元根据出生顺序排列成同心环状结构29,30,31,32...

该方案描述了进行杂交链式反应荧光检测所需的步骤 原位 杂交（HCR-FISH）在 黑腹果蝇 幼虫视叶。本文详细介绍了探针设计、杂交、扩增及组织封片的操作步骤，以促进对发育中视叶的可视化观察。

杂交链式反应FISH在发育过程中的应用 果蝇 视叶

理解神经发育需要精确表征基因表达的时间和空间位置。原位杂交等技术已……

hybridization-chain-reaction-fish-developing-drosophila-optic

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

发育中的 果蝇 光学叶中的杂交链式反应FISH

使用整体封片法 原位 将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术

形态学分析 果蝇 利用遗传镶嵌体研究幼虫外周感觉神经元的树突和轴突

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

斑马鱼是一种小型热带鱼，已成为研究脊椎动物发育和疾病过程中基因功能的常用模型。通过以下方法可确定目标基因的时间和空间表达模式： 原位...

高分辨率整体成像 原位 斑马鱼胚胎杂交技术用于研究基因表达与功能

免疫染色是一种用于可视化组织内特定细胞类型和蛋白质的有效技术。通过利用超声处理，本文所述的方案消除了在对晚期胚胎和幼虫进行免疫染色前解剖黑腹果蝇（Drosophila...

超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色 黑腹果蝇 组织 原位

我们描述了一种多靶点显色整体原位杂交 原位 杂交（MC-WISH）过程在完整样本中 果蝇...

多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交法用于比较基因表达区域 果蝇 胚胎

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

本文提供了一种详细的实验方法，用于制备X染色体臂探针，并通过荧光原位杂交（FISH）技术检测处于前中期和中期 I...

使用荧光原位杂交技术可视化果蝇卵母细胞中染色体臂的黏连缺陷 原位 利用荧光原位杂交（FISH）监测早前期I和中期I染色体臂黏连状态 果蝇 卵母细胞

该文章描述了进行杂交链式反应RNA整体荧光染色所需的方法与试剂 原位 通过杂交链式反应RNA全组织荧光原位杂交（HCR RNA WM-FISH）揭示蚊子触角和下颚须中化学感受器基因的空间与细胞分辨率特征。...

杂交链式反应RNA整体荧光原位杂交检测蚊虫嗅觉附器中化学感受基因

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

New York University.  本方案描述了在果蝇黑胃鸡幼虫视叶中进行杂交链式反应荧光原位杂交（HCR-FISH）所需的步骤。探针设计、杂交、放大和组织安装等程序详细说明，以便于对发育中的视叶进行可视化。

杂交链式反应FISH在发育过程中的应用果蝇视叶

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杂交链式反应FISH在发育过程中的应用 果蝇 视叶

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