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本研究得到了捷克共和国哈维罗夫摩拉维亚-西里西亚医院2024年内部研究基金以及捷克共和国奥洛穆茨帕拉茨基大学内部基金IGA_LF_2026_012的资助。

我们的研究于2025年发表2， 使用了存档材料，并遵循《赫尔辛基宣言》的最新原则进行。患者已签署书面知情同意书，同意进行实验室检查、匿名数据收集与分析以及研究用途，包括发表匿名图像数据。本研究已获得哈维若夫医院伦理委员会（批准号：IGS_2023_HEM_PAT）的批准。
注意：以下报告的是在自动染色后针对外周血（PB）和骨髓（BM）的ADM方案。
1. 使用自动化仪器制备和染色外周血与骨髓涂片
<ol>
	<li>开启仪器前，请执行以下检查：管路状况、网络连接、废液容器状态、试剂是否充足，以及载玻片供应是否充足。 
	注意：试剂容器不得为空，所有试剂均须在有效期内。</li>
	<li>开启仪器。</li>
	<li>主机将自动执行自检程序。</li>
	<li>使用有效的用户名和密码登录软件。</li>
	<li>使用当前版本的软件操作仪器。遵循制造商的建议和用户手册（主屏幕—图1）。</li>
	<li>使用 菜单 选择操作，使用 工作列表 管理载玻片制备和涂片制备请求，使用 浏览器 查看请求中的数据，使用 状态 选项卡检查正在制备的涂片状态。</li>
	<li>从主机下载新的载玻片制备请求，或创建新的请求。 
	注意：使用边缘经过倒角和圆角处理的载玻片，尺寸为 24.7–26.3 mm × 74.7–76.3 mm，厚度为 0.9–1.2 mm，磨砂边缘长度为 15–20 mm。</li>
	<li>根据需要编辑或删除载玻片制备请求。</li>
	<li>制备涂片：
	<ol>
		<li>处理外周血（PB）和骨髓（BM）样本及涂片时，必须始终佩戴乳胶或丁腈手套。</li>
		<li>选择涂片制备模式。</li>
		<li>将样本架放入采样器中。 
		注意：仅可使用染色仪制造商特别批准的样本管。</li>
		<li>检查推片玻璃是否完好无损、完全清洁，并牢固地安装在支架中。</li>
		<li>通过对话窗口启动涂片制备和染色程序。</li>
		<li>检查正在制备的涂片状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>查看载玻片制备请求的详细信息。</li>
	<li>取出样本架。</li>
	<li>取出已制备并染色的载玻片。 
	检查点：目视检查（输出后）涂片质量是否符合既定的可接受标准？必须存在足够长度和细胞密度的单层细胞区域。</li>
	<li>关闭仪器前进行仪器检查和清洁。</li>
	<li>关闭仪器。 
	注意： 
	外周血染色程序— 
	染色1：May–Grünwald 染液；染色2：Giemsa–Romanowski 染液。未稀释染液1（73 mL）2:48 分钟；稀释染液1（73 mL，稀释液为 pH 7.0 磷酸盐缓冲液，稀释比例 1:10）3:36 分钟。稀释染液2（26 mL，稀释液为 pH 7.0 磷酸盐缓冲液，稀释比例 1:10）4:00 分钟。冲洗次数（439 mL，自动化过程） 
	1. 干燥（自动化过程）3:36 分钟。 
	 
	骨髓染色程序— 
	染色1：May–Grünwald 染液；染色2：Giemsa–Romanowski 染液。未稀释染液1（73 mL）3:36 分钟；稀释染液1（73 mL，稀释液为 pH 7.0 磷酸盐缓冲液，稀释比例 1:10）2:48 分钟。稀释染液2（26 mL，稀释液为 pH 7.0 磷酸盐缓冲液，稀释比例 1:10）10:00 分钟。冲洗次数（439 mL，自动化过程） 
	1. 干燥（自动化过程）3:36 分钟。 
	 
	警告：在实验室中处理化学品时，应遵循其官方安全数据表中的说明，包括成分、危险标识、急救措施、意外泄漏和火灾的应急处理程序、操作与储存指南、个人防护装备要求、毒理学和环境信息，以及运输和处置说明。废液、试剂和耗材应按照当地法律法规作为医疗感染性废物和/或工业废物进行处置。如有可能，应使用集中式废物处理系统。</li>
</ol>
2. 外周血的自动化数字细胞形态学
<ol>
	<li>使用该应用程序进行白细胞（WBC）分类计数、红细胞（RBC）形态学评估以及血小板（PLT）数量估计。验证每种细胞类型的建议分类。 
	注意：操作人员应为具有至少五年实践经验的持证实验室技术员或持证实验室科学家。</li>
	<li>启动分析仪。</li>
	<li>使用有效的用户名和密码登录软件。</li>
	<li>使用当前版本的软件操作仪器。遵循制造商的建议和用户手册。</li>
	<li>使用系统控制视图选项卡执行质量控制（QC）程序和处理检测申请。</li>
	<li>每日使用对照玻片（常规外周血涂片，白细胞计数高于 10 × 109/L）进行内部质控。每天至少运行一次细胞检测测试，识别100个细胞。 
	注意：细胞检测测试用于验证涂片制备流程，并确认分析仪检测细胞的能力。涂片必须具备足够质量，以确保分析仪能够检测到分析所需的细胞。质控可接受标准为成功检测出97%的细胞。</li>
	<li>使用由制片和染色仪器制备的外周血涂片。</li>
	<li>将染色后的涂片放入分析仪的加载抽屉中。</li>
	<li>手动输入检测编号或通过条形码扫描仪录入；实验室信息系统中的申请将自动加载。</li>
	<li>关闭分析仪的进样门。</li>
	<li>处理涂片。 
	注意：分析仪会自动将涂片移至显微镜下进行扫描，捕获白细胞图像以及红细胞的单层图像。分析仪对所有检测到的白细胞进行初步分类，并评估红细胞形态。</li>
	<li>审查初步结果，并在必要时进行重新分类，可直接在分析仪上或通过远程审核软件完成。考虑系统提供的三种分类选项及其概率百分比。 
	注意：自动初步分类仅需数秒。对于分类模糊或处于临界状态的细胞，需进行双人复核。若不同观察者分类结果不一致，应达成共识。重新分类的细胞将在图像右上角标有对勾符号。</li>
	<li>在白细胞模式下，审查有核细胞的初步分类。 
	注意：需要进行数字形态学分析并强制由专家复核的质量警示包括：原始细胞、幼稚粒细胞、异型淋巴细胞、反应性淋巴细胞、肿瘤性淋巴细胞、单核细胞计数高于 1.0 × 109/L、淋巴细胞计数高于 4.0 × 109/L，以及不可靠的分类计数。操作员或病理医生所做的任何手动重新分类均需记录用户ID和时间戳。</li>
	<li>若发现分类错误，可通过鼠标拖动图像将该细胞重新分配至正确类别。 
	注意：有关外周血细胞误分类的示例，请参见图2。</li>
	<li>在红细胞模式下，审查红细胞形态学改变的评估结果，并通过选择额外的病理特征（如靶形细胞、裂红细胞、椭圆形红细胞等）修正不准确的判断或补充发现。</li>
	<li>在血小板模式下，审查血小板的评估结果。</li>
	<li>手动添加备注，或从预设文本选项中选择。 
	注意：自动复核规则必须经过正式验证、记录，并至少每年审查一次。</li>
	<li>确认最终结果，结果将自动发送至实验室信息系统。 
	注意：最终结果将以数值形式的分类计数连同附加备注（如有）导出。对于细胞数量较低的样本（白细胞计数低于 2.0 × 109/L），将自动生成两张涂片，分别进行扫描和评估。</li>
	<li>退出登录并关闭分析仪。 
	注意：每个外周血样本均采用100个细胞计数法，遵循国际血液学标准化委员会（ICSH）的建议17。白细胞分类类别（类别）包括原始细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状核中性粒细胞、分叶核中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、变异淋巴细胞和浆细胞。非白细胞分类类别（类别）包括涂抹细胞、人工假象、巨大血小板、血小板聚集和有核红细胞。红细胞形态学分类类别（类别）包括多染性红细胞、低色素性红细胞、大小不均、大红细胞症、小红细胞症和异形红细胞症。Začátek formuláře 
	 
	警告：在实验室中处理化学品时，应遵循其官方安全数据表中的说明，包括成分、危险标识、急救措施、意外泄漏和火灾的应急处理程序、操作与储存指南、个人防护装备要求、毒理学和环境信息，以及运输和处置说明。废弃液体、试剂和耗材应根据当地法律法规作为医疗感染性废物和/或工业废物进行处置。如有可能，应使用集中式废物处理系统。</li>
</ol>
表单结束
3. 骨髓自动数字化细胞形态学
<ol>
	<li>使用该系统进行外周血（PB）和骨髓（BM）细胞的分类计数，验证每种细胞类型的建议分类。 
	注意：本文描述了骨髓分析的使用方法。操作人员应为具有至少五年实践经验的认证实验室技术员，或认证实验室科学家，或认证医师。</li>
	<li>启动分析仪。</li>
	<li>使用有效的用户名和密码登录软件。</li>
	<li>使用当前版本的软件操作仪器，遵循制造商的建议和用户手册。</li>
	<li>使用 Project 模块处理检测申请和玻片管理，使用 Edit 模块配置分类规则和预分类策略，使用 Report 模块设置报告格式并生成报告，使用 Manage 选项卡进行账户设置和签名规则管理。</li>
	<li>使用经染色仪器染色的骨髓涂片。</li>
	<li>手动输入检测编号，或通过条形码（二维码）扫描仪读取；实验室信息系统中的申请将自动加载。</li>
	<li>将染色后的涂片放入分析仪的加载抽屉中。</li>
	<li>关闭分析仪的进样门。</li>
	<li>处理涂片。 
	注意：分析仪会自动将涂片移至显微镜下进行扫描，并捕获有核细胞（包括巨核细胞）的图像。它可在数秒内完成对所有检测到的有核细胞（包括巨核细胞）的初步分类。</li>
	<li>审查初步结果，并在必要时进行重新分类，可直接在分析仪上操作，或使用远程审核软件进行。 
	注意：系统可在400×放大倍数下清晰显示整张玻片（全玻片成像），并展示所有有核细胞和巨核细胞；使用浸油物镜在1000×放大倍数下捕获有核细胞（可能包括巨核细胞）的图像。正常细胞含量涂片的完整扫描平均耗时&#60;10分钟/张。对于细胞含量减少的涂片，扫描时间&#62;20分钟/张。</li>
	<li>如发现分类错误，可通过鼠标拖动细胞图像将其重新分配至正确类别。 
	注意：骨髓细胞分类错误的示例见图3。对于分类模糊或处于临界状态的细胞，需进行双人复核。若不同观察者分类结果不一致，须达成共识。操作员或病理医师所做的任何手动重新分类均须记录用户ID和时间戳。</li>
	<li>手动添加注释和细胞形态学描述，或从预设文本选项中选择。</li>
	<li>完成初步报告。</li>
	<li>确认最终结果，系统将自动发送至实验室信息系统。 
	注意：最终结果将以数值化分类计数（骨髓象）形式导出，并附带附加注释和细胞形态学描述。</li>
	<li>退出登录并关闭分析仪。 
	注意：每个骨髓样本均按照国际血液学标准化委员会（ICSH）建议进行500个细胞计数17。 
	分类类别（分类群）包括原红细胞、早幼红细胞（含巨幼变）、中幼红细胞（含巨幼变）、晚幼红细胞（含巨幼变）、原粒细胞、早幼粒细胞、中性中幼粒细胞、中性晚幼粒细胞、杆状核中性粒细胞、分叶核中性粒细胞、嗜酸性中幼粒细胞、嗜酸性晚幼粒细胞、杆状核嗜酸性粒细胞、分叶核嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原单核细胞、幼单核细胞、单核细胞、原淋巴细胞、幼淋巴细胞、成熟淋巴细胞（含异型和反应性）、原浆细胞、未成熟浆细胞、浆细胞，以及其他类别（涂抹细胞、组织细胞、吞噬细胞、肥大细胞和有丝分裂相）。 
	 
	警告：废液、试剂和耗材应按照当地法律法规作为医疗感染性废物和/或工业废物进行处置。如有可能，应使用中央废物处理系统。</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

高分辨率图像处理、自动数字图像分类以及基于卷积神经网络的人工智能辅助决策等技术的进步，已显著推动了自动细胞形态学分析（ADM）的发展。因此，ADM 已成为标准光学显微镜检查的重要补充。准确识别各个细胞形态学类别可能具有挑战性，尤其是在形态学特征相似、分类关系相近的类别之间2,11,12,14,15,19,20。由于专家判读结果始终存在一定程度的主观性，因此其结论未必可被视为唯一确定或绝对正确的结果——特别是在临界状态或细胞分类不明确的情况下（例如异型增生或高度非典型细胞）2。已有研究报道了外周血（PB）中的此类误分类现象，显示对常见细胞类型的识别性能较强，但对某些具有重要临床意义的细胞亚群（如原始细胞）的分类一致性较差12,15,19,20。这可能对外周血和骨髓（BM）的细胞形态学诊断产生显著影响。
与外周血（PB）相比，目前仅有少数研究关注自动显微镜检测系统（ADM）在骨髓（BM）分析中的分类准确性2,20,21,22,23。一项关于ADM分类的中国研究显示，分类一致性达到99%，大多数骨髓细胞类型与血液病理学专家判断结果具有极高的相关性21。然而，该研究队列中血液系统恶性肿瘤的比例不足30%21。其他评估自动化外周血和骨髓涂片系统与人工分析性能的比较研究已在多中心试验中开展22,23。在最近的一项对比研究中，共分析了795例来自患有肿瘤及其他临床状况患者的骨髓样本，与光学显微镜结果的整体一致率达到91.1%23。
一项针对欧洲血统患者真实世界队列的研究纳入了59%的肿瘤性疾病患者，比较了人工智能驱动的异常检测方法（ADM）与专家光学显微镜在六个诊断组中的表现2。研究发现，对于具有非典型形态的肿瘤细胞，存在关键性的错误分类，可能导致误诊风险2。因此，该研究确定了可用于未来人工智能性能训练与测试的候选细胞类型2。然而，该研究存在若干局限性。首先，研究纳入的患者数量有限，且使用的是存档样本，部分罕见的骨髓疾病未被涵盖，包括儿童样本。其次，某些肿瘤细胞的细胞形态学异常程度较高，即使在经验丰富的专家之间，其分类也难以达成一致。第三，仅分析了欧洲血统的样本。第四，未对相关和无关的错误分类进行外部验证2。
细胞误分类是血液肿瘤学诊断中自动显微镜检测（ADM）的主要局限性2。误分类的原因有多种。除了细胞形态学上的重叠外，可能的促成因素还包括某些疾病类型的罕见性，以及专家之间对细胞类型判断的意见差异。这可能导致标注不一致以及训练数据中的空白。造血系统中发育异常改变的检测并不可靠，巨核细胞细胞形态学的详细评估同样如此2。尽管强制性的专家监督在很大程度上减轻了不良后果，但ADM在白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中的绝对可靠性仍存在局限性2。对用于人工智能训练的细胞进行准确的专家标注，是ADM性能的关键前提。精确的数据标注是构建可靠真实数据集的基础。在细胞形态学中，对于模糊或临界病例，定义真实情况尤为困难，因为即使在经验丰富且广泛认可的专家之间，仍存在一定程度的主观性。当专家意见不一致时，可通过多数共识或两位及以上具有相当专业水平的独立评审者达成一致来确立真实情况，尤其是在将诊断判断分解为多个独立组成部分时2。针对特定候选细胞类型的分类能力优化至关重要，包括对难以识别的细胞类型进行有针对性的再训练、采用分层分类策略，或整合多模态数据以提高形态相似细胞之间的区分能力。在血液淋巴系统肿瘤中，必须建立广泛、多样且标注良好的训练数据集，尤其应充分涵盖非典型形态、罕见病变、临界病例以及诊断上不明确的细胞。
关于关键实验步骤和故障排除：血涂片必须在采集后两小时内制备；骨髓穿刺液必须在首次抽取后立即涂片。需要采用经过验证的、自动化的染色方案，并在不同批次之间严格保持一致。必须获得清晰、无伪影的单层细胞涂片。在白细胞减少的外周血样本和细胞稀疏的骨髓涂片中，需要延长扫描时间。浸油耗尽或涂片过薄会导致自动对焦失败并中止分析。两种系统均未获准用于自主报告，必须由操作者对单个细胞图像图库进行人工检查。在投入使用前必须进行本地临床验证；最终的诊断责任和法律责任由出具报告的形态学分析人员承担。
未来在不同临床环境中开展严格的多中心验证，对于模型的泛化能力与预测性能至关重要。基于人工智能的巨核细胞细胞形态学分析方法，可能进一步优化骨髓增殖性肿瘤和骨髓增生异常肿瘤的整合诊断24,25,26。然而，在开发可靠的、由人工智能支持的谱系特异性发育异常改变识别技术方面，仍存在显著空白2,27。在模型优化方面，超参数调优、正则化、集成学习和数据增强等创新技术可用于提升模型的稳健性与分类可靠性28,29,30。特别是数据增强策略——从几何变换30,31到利用生成式人工智能生成合成训练图像32,33——近年来已成为扩展有限数据集并解决骨髓细胞分类中类别不平衡问题的有前景方法。实验室人员的教育水平和长期经验，对于复杂细胞形态学病例的评估与决策过程至关重要。在持续数字化背景下，培养下一代细胞形态学专业人员面临教育挑战。一方面，辅助诊断模型（ADM）具有巨大的教育潜力；另一方面，也存在经验较少的操作者可能高估其能力的风险。
尽管自动诊断显微系统（ADM）具有良好的诊断潜力，但仍必须认识到若干关键局限性和实施挑战。一个基本问题是训练数据中的偏倚：目前大多数商用ADM平台（包括本研究评估的平台）均主要基于特定地理区域、染色方案和患者人群的数据集开发，这可能限制其在种族和临床特征更多样化的群体中，或在采用不同制备技术的实验室中的普适性。同样重要的是人工智能决策过程的透明度问题。当前的ADM系统在很大程度上以“黑箱”模型运行，这阻碍了临床医生对单个细胞分类结果进行批判性评估。这一问题与临床责任归属直接相关，因为针对人工智能辅助诊断的监管框架仍在持续发展之中。将ADM实际整合到常规诊断工作流程中还面临重大的组织和技术障碍，包括对高质量玻片数字化基础设施的需求、人员培训、与本地参考标准的比对验证，以及建立长期监控系统性能的质量控制规程。因此，通过专家主导的优化和对ADM在全血和骨髓评估中全部潜力的深入探索，将持续提升其作为常规实验室实践中辅助工具的实用性。

对外周血（PB）和骨髓（BM）涂片进行准确的细胞形态学评估，仍是血液肿瘤学多学科诊断中的基石，对关键临床决策具有重要影响1,2,3,4。已有证据表明，人工进行PB和BM涂片分析时存在显著的专家间和专家内变异，进而影响患者的诊断结果2,5,6,7,8,9。近年来，图像分析、机器学习和计算病理学的进步使得PB和BM涂片的自动化评估达到可辅助专家细胞形态学判读的水平1,2,3,4,10,11,12,13,14。基于人工智能（AI）的外周血和骨髓自动化数字细胞形态学（ADM）可辅助耗时且劳动密集型的光学显微镜检查及专家决策过程1,2,3,4,11,12。
ADM 技术的核心要素包括标准化的涂片制备与染色、具备先进成像能力的扫描仪、人工智能技术，以及高效且用户友好的界面。ADM 的精密机械系统以微米级精度高速运行，同时先进的成像解决方案确保了高图像质量14。用户友好的界面使得这一复杂技术能够以直观且高效的方式被便捷使用14。
ADM 长期以来已被用于外周血（PB）评估，在该领域已高度发展，并成为标准实验室工作流程中不可或缺的一部分。然而，在骨髓（BM）评估中，由于细胞形态学模式复杂且精细、细胞类型众多，以及前体细胞之间形态相似，ADM 面临诸多挑战2。人工智能分类能力依赖于包含多达数百万个细胞的大规模、综合性图像数据集进行训练。这些训练数据集中的所有细胞均由专家进行审阅和标注。这种专家输入以及其他因素，直接影响分类的质量。
然而，某些外周血和骨髓细胞对自动数字显微镜分类仍具有较大挑战性，这会显著影响细胞形态学诊断2,12,15。关键的细胞误分类仍是自动数字显微镜的主要局限性，可能导致严重的临床后果，从而削弱该方法的可靠性2。
我们的目标是介绍一种实用的ADM工作流程，包括其具体步骤和专家评审过程。通过使用两个分析平台作为示例，详细报告ADM过程，使用户能够充分挖掘该方法的功能与优势。大量研究已证明ADM在PB分类中具有高准确性12,15,16。因此，在本研究中，我们专注于BM的ADM分析，因为此类方法在BM上的可靠验证数据较为有限。定量验证结果基于BM分析得出。此外，我们强调了该方法的一个关键局限性，即关键性误分类问题。我们还提出了误分类的分类体系，并指出了最常见的关键性误分类类型。

<table><tbody><tr><td>自动化血液学推片机 SP-50</td><td>Sysmex Corporation, Kobe, Japan</td><td>N/A</td><td>自动化推片及染色仪</td></tr><tr><td>Sysmex SP-50 条形码扫描仪</td><td>Datalogic Gryphon</td><td>S/N: G21M20996</td><td>条形码扫描仪</td></tr><tr><td>CellaVision DC-1</td><td>CellaVision AB, Lund, Sweden</td><td>PM-10895-15</td><td>自动化数字形态学分析仪</td></tr><tr><td>CellaVision DM 软件</td><td>CellaVision AB, Lund, Sweden</td><td>版本 7.1.1 构建 8</td><td></td></tr><tr><td>SP 自动化系统用吉姆萨染液</td><td>RAL Diagnostics, Martillac, France</td><td>750305X1000</td><td>外周血和骨髓涂片的全效染色组分</td></tr><tr><td>浸油（CellaVision 浸油 50 mL）</td><td>CellaVision AB, Lund, Sweden</td><td>XU-10319</td><td>浸油</td></tr><tr><td>SP 自动化系统用 May-Gr&amp;uuml;nwald 染液</td><td>RAL Diagnostics, Martillac, France</td><td>750105X2500</td><td>外周血和骨髓涂片的全效染色组分</td></tr><tr><td>Morphogo 骨髓分析仪</td><td>杭州智微信息技术有限公司，中国杭州</td><td>N/A</td><td>自动化数字骨髓形态学分析仪</td></tr><tr><td>Morphogo 审核软件</td><td>杭州智微信息技术有限公司，中国杭州</td><td>版本 1.0.6</td><td>骨髓审核软件</td></tr><tr><td>SP 自动化系统用 pH 7.0 缓冲液</td><td>RAL Diagnostics, Martillac, France</td><td>750505X5000</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>CellaVision DC-1 用二维码扫描仪</td><td>Datalogic Gryphon</td><td>GD 4500</td><td>二维码扫描仪</td></tr><tr><td>RAL 清洗液</td><td>RAL Diagnostics, Martillac, France</td><td>750725X5000</td><td>清洗液</td></tr><tr><td>S-Monovette K3 EDTA 采血管</td><td>Sarstedt</td><td>05.1167.001</td><td>SP-50 专用试管</td></tr><tr><td>SP 冲洗液</td><td>RAL Diagnostics, Martillac, France</td><td>37000305</td><td>冲洗液</td></tr><tr><td>SP 载玻片</td><td>Sysmex Corporation, Kobe, Japan</td><td>ZE 001906</td><td>用于外周血和骨髓涂片的载玻片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SP 载玻片</td><td>Sysmex Corporation, Kobe, Japan</td><td>ZE 001906</td><td>用于质控的载玻片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SP 推片玻璃条</td><td>Sysmex Corporation, Kobe, Japan</td><td>95102918</td><td>用于涂片推片的玻璃条&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sysmex SP-50 试管架</td><td>Sysmex Corporation, Kobe, Japan</td><td>AU330213</td><td>试管架</td></tr></tbody></table>

自动化数字外周血与骨髓细胞形态学工作流程及关键细胞误分类的考量

Workflow for Automated Digital Peripheral Blood and Bone Marrow Cytomorphology, With Consideration of Critical Cellular Misclassifications

越来越多的证据表明，基于人工智能的外周血（PB）和骨髓（BM）自动数字细胞形态学（ADM）能够辅助专家进行决策。本文描述了PB和BM涂片的ADM工作流程。ADM技术的核心组成部分包括精密机械装置、先进成像系统、人工智能（AI）以及用户友好的操作界面。该过程首先采用适用于自动化和数字化的标准化方案进行涂片制备与染色。配备浸油物镜和数字相机的自动化显微镜以多种放大倍数采集样本的高分辨率图像。随后，由AI驱动的软件对有核细胞进行定位、记录并初步分类，必要时包括巨核细胞。接下来必须由专家进行审核，并根据需要进行重新分类。数字图像和报告随后存储于大容量本地服务器中。ADM的主要优势包括提高分析速度、高效的数据管理、教学支持、远程评估与会诊、数字归档以及多模态数据整合。ADM最主要的局限性在于关键性细胞误分类的风险，这可能对临床产生重大影响。无关紧要的误分类在诊断上属于中性，可以接受；而关键性的误分类则不可接受，可能导致严重的诊断和临床后果。对于具有非典型形态的肿瘤性淋巴细胞、小型淋巴母细胞/原粒细胞、颗粒状原单核细胞、发育异常的前单核细胞和单核细胞、浆母细胞以及未成熟浆细胞等细胞类型的误分类，存在误诊风险。要实现可靠的诊断性能，仍需进一步的技术进步。大量高质量的训练数据结合定期验证，对于确保AI作为诊断判断的有效辅助工具至关重要。

验证研究——方法 
在本项验证研究中，我们重现了先前发表于《临床与转化医学》2的研究结果。对328份骨髓涂片进行了常规光学显微镜检查和ADM分析。用于分析的数据包括所有被分析细胞的图像信息及分类结果，涵盖罕见和非典型形态学病例。病例被分为六个诊断组：骨髓增生异常肿瘤（MDN：15%）、多发性骨髓瘤（MM：14%）、成熟B/T细胞肿瘤（B/T淋巴瘤：13%）、急性白血病和慢性粒单核细胞白血病（AL+CMML：9%）、骨髓增殖性肿瘤（MPN：8%）以及反应性造血（反应性：41%）。通过将ADM细胞识别（分类）能力与双人独立共识专家标注结果进行比较，评估其将细胞正确归类至25个类别之一的能力2。
每个病例均由两位专家进行复核，分类（标注）结果一致 &#62;99% 的细胞。专家们经验丰富，定期参与并成功通过外部质量评估。对于分类不同的细胞（&#60;1%），达成观察者间共识。一致性分析的原则是将每种细胞的自动预分类结果与每种细胞的最终专家分类结果进行比较；共识的专家分类被视为真实分类参考标准（金标准）。2.
评估了细胞学与临床分类的一致性，并识别出关键的误分类情况。细胞学分类一致性通过混淆矩阵确定，依据各细胞类型的分类一致性进行判断。采用了标准的统计学方法和可视化数据挖掘技术。针对每种细胞类型计算了马修斯相关系数（MCC），并计算其平均值，结果按常规方式进行解读。MCC值达到或超过0.400被视为满意2,18。
对于每位患者，在排除无法分类的细胞后，临床分类一致性确定为该病例中所有被评估细胞内正确预先分类元素所占的百分比。专家分类被视为真实参考标准（即金标准）2。
当误分类在诊断上无实际意义且不影响最终诊断时，被视为无关紧要。这些情况包括淋巴母细胞、原粒细胞和原单核细胞之间的相互误分类；中性粒细胞系、嗜酸性粒细胞系和嗜碱性粒细胞系的早幼粒细胞/中幼粒细胞之间的误分类；中幼粒细胞/晚幼粒细胞；晚幼粒细胞/杆状核粒细胞；杆状核/分叶核中性粒细胞；原红细胞/早幼红细胞；早幼/中幼及中幼/晚幼红细胞；原单核细胞/单核细胞；副淋巴细胞/淋巴细胞；浆母细胞/未成熟浆细胞；以及未成熟浆细胞/成熟浆细胞之间的误分类。所有其他类型的误分类均被视为相关，因其在诊断上不可接受，可能导致严重的临床后果（图4）2。
总体临床分类一致性计算为仅考虑相关细胞误分类情况下的各个病例值的中位数。当个体临床分类一致性值低于80%时，定义为严重误分类。该任意阈值由专家共识设定，参考了细胞形态学质控轮测中对外部质量评估的最低要求2。
不同平台之间的关键差异包括骨髓（BM）检测的两步工作流程（使用40×和100×物镜），这比外周血（PB）方案增加了额外的复杂性；不同的细胞计数目标（PB为100个细胞，BM为500个细胞）；以及不同的分类类别。影响不同平台和不同样本类型之间可比性的最重要共同因素是涂片制备过程。
所报告的定量性能指标与方法部分描述的验证队列（n = 328 张骨髓涂片）明确相关。在所有已分类细胞中，相关细胞被正确分类的比例（细胞分类一致性）为 95.4%。根据马修斯相关系数（MCC）显示，25 种细胞类型中有 22 种（88.0%）达到满意的相关性值（≥0.400），而 3 种细胞类型（12.0%）的 MCC 值不满意（<0.400），分别为淋巴母细胞、幼淋巴细胞和原单核细胞。总体相关临床一致性为 97.1%（中位数），其中 94.5% 的病例一致性率介于 80% 至 100% 之间。在 5.5% 的患者中观察到关键性误分类，其相关临床一致性值介于 36% 至 79% 之间，原因是未能识别出肿瘤细胞2。
细胞误分类会损害ADM在骨髓分析中的可靠性，是血液肿瘤学诊断中该方法的主要局限性之一（表1）。在存在显著误分类的病例中，我们对正确分类和错误分类的细胞形态进行了观察。正确分类的细胞通常表现出典型的细胞形态学特征。相比之下，误分类最常发生在形态学相似或非典型细胞之间的区分过程中，尤其是非典型淋巴细胞与原始细胞；原粒细胞与淋巴细胞；淋巴母细胞与淋巴细胞；原单核细胞或幼单核细胞与早幼粒细胞；以及未成熟浆细胞与原始细胞之间。误分类的细胞常表现出非典型的细胞形态学特征。在淋巴细胞肿瘤中，被误分类的肿瘤性淋巴细胞（如边缘区淋巴瘤和毛细胞白血病中所见）通常体积中等，胞质丰富，呈嗜碱性或淡染，具有胞质突起，染色质较细，并可见核仁。这些特征与正确分类的肿瘤细胞有所不同。在套细胞淋巴瘤中，非典型淋巴细胞可能呈现母细胞样形态，从而增加误分类的可能性。类似地，在慢性淋巴细胞白血病的多形性变异型中，肿瘤性淋巴细胞可能被误判为原始细胞。我们在图4和图5中展示了具有代表性的定性示例。
在急性白血病和慢性粒单核细胞白血病（CMML）中，被错误分类的淋巴母细胞和髓系母细胞体积较小，核质比高，染色质较粗，且可见核仁。大量颗粒状的单核母细胞可能被误判为早幼粒细胞。在CMML中，错误分类常与发育异常的单核细胞相关。在多发性骨髓瘤中，错误分类发生在浆细胞谱系内，尤其是浆母细胞和未成熟浆细胞。我们在图5中展示了具有代表性的定性示例。
对肿瘤性淋巴细胞、小型淋巴母细胞/原粒细胞、颗粒状原单核细胞、发育异常的前单核细胞和单核细胞、浆母细胞以及未成熟浆细胞等细胞的错误分类具有重要临床意义，这些细胞均可能呈现非典型形态，存在误诊风险。将淋巴瘤误诊为急性白血病，或反之，可能对患者的治疗决策造成严重甚至致命的后果。假阴性结果，例如未能识别急性髓系白血病（尤其是急性早幼粒细胞白血病），或对慢性粒单核细胞白血病（CMML）或多发性骨髓瘤的误诊，可能导致不恰当的治疗决策或治疗延误。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71690/71690fig1.jpg" /> 
图1．自动染色仪，主屏幕图标。 图片由 Sysmex 提供；制造商资料（基本操作手册）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71690/71690fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71690/71690fig2.jpg" /> 
图 2．外周血白细胞的错误分类。 在软件截图中，被错误分类的细胞以红色方框标出。在EBV感染中，反应性淋巴细胞被错误分类为单核细胞（A，红框）；在慢性淋巴细胞白血病中，部分淋巴细胞被错误分类为原始细胞（B，红框）；在慢性粒-单核细胞白血病（CMML）中，发育异常的单核细胞被错误分类为分叶核中性粒细胞（C，红框），一个单核母细胞被错误分类为发育异常的早幼粒细胞（D，红框）。PB，CellaVision DC-1，Review Software，使用Sysmex SP-50染色仪进行May–Grünwald和Giemsa–Romanowski自动化染色，放大倍数1000×，专家：认证技术员。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71690/71690fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71690/71690fig3.jpg" /> 
图3．骨髓中肿瘤性淋巴细胞的误分类。 软件界面截图。骨髓中高级别B细胞淋巴瘤的肿瘤性淋巴细胞被误分类为原粒细胞。黄色箭头标示了系统建议的五种最可能分类（“前五位列表”），并包含相应的概率百分比。对于黄色框中的细胞，标签显示其分别为原粒细胞、原单核细胞、原淋巴细胞、原红细胞和早幼红细胞的概率百分比，但未提供淋巴细胞选项。BM，Morphogo，Review Software，采用Sysmex SP-50染色仪进行May–Grünwald和Giemsa–Romanowski自动化染色，放大倍数1000×，专家：认证科学家，认证医师。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71690/71690fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71690/71690fig4.jpg" /> 
图4．无关和相关细胞分类错误。（A）在专家分类与ADM预分类的比较中，展示了髓系和红系谱系中无关分类错误的示例。（B）在专家分类与ADM预分类的比较中，展示了淋系、浆细胞和单核细胞谱系中相关分类错误的示例。某些成分的分类即使对专家而言也较为困难。细胞图像从软件中提取。BM，Morphogo，Review Software，使用Sysmex SP-50染色仪进行May–Grünwald和Giemsa–Romanowski自动化染色，放大倍数1000×，专家：认证科学家、认证医师。每个细胞均添加了比例尺。比例尺代表10 µm。校准基于ToupCam相机（像素尺寸1.85 µm）与100× Olympus Plan N物镜。 
修改自：Starostka D, Dolezilek R, Kvasnicka HM, Kudelka M, Miczkova P, Kriegova E, 等。自动化人工智能辅助数字细胞形态学在血液肿瘤学诊断中骨髓分析的应用价值。Clin Transl Med. 2025; 15:e70364. https://doi.org/10.1002/ctm2.70364。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71690/71690fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71690/71690fig5.jpg" /> 
图5．血液系统肿瘤患者骨髓细胞最常见误分类的代表性示例。 在边缘区淋巴瘤（MZL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、毛细胞白血病（HCL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性髓系白血病（AML）、急性T淋巴母细胞白血病（T-ALL）和多发性骨髓瘤（MM）的选定病例中，展示了被误分类的肿瘤性淋巴细胞、原幼粒细胞、淋巴母细胞、单核母细胞和浆细胞。对非典型淋巴细胞/母细胞的误分类是最常见的错误。误分类的肿瘤性淋巴细胞主要的细胞形态学特征包括中等大小、染色质较细（红箭头）、可见核仁（蓝箭头）、胞质丰富，呈嗜碱性或淡染，并有突起（绿箭头），以及母细胞样外观（橙色箭头）。被误分类的淋巴母细胞和原幼粒细胞体积较小，核质比高，染色质较粗，伴有核仁（灰色箭头）。浆母细胞和未成熟浆细胞被误分类为淋巴细胞，或未能识别为属于浆细胞谱系（归类为“未特指的母细胞”）。细胞图像提取自软件。BM Morphogo Review Software，使用Sysmex SP-50染色仪进行May–Grünwald和Giemsa–Romanowski自动化染色，放大倍数1000×，专家：认证科学家、认证医师。每张细胞图像均添加了比例尺。比例尺代表10 µm。校准基于ToupCam相机（像素尺寸1.85 µm）与100× Olympus Plan N物镜。 
该图像改编自：Starostka D, Dolezilek R, Kvasnicka HM, Kudelka M, Miczkova P, Kriegova E, 等。自动化人工智能辅助数字细胞形态学在血液肿瘤诊断中骨髓分析的应用价值。Clin Transl Med. 2025; 15:e70364. https://doi.org/10.1002/ctm2.70364。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71690/71690fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>诊断</td>
			<td>病例数</td>
			<td colspan="2">误分类细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>专家分类</td>
			<td>ADM 分类</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成熟 B 细胞肿瘤</td>
			<td>9/43</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>边缘区淋巴瘤</td>
			<td>4/8</td>
			<td>异型淋巴细胞</td>
			<td>原始细胞，NOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>套细胞淋巴瘤</td>
			<td>2/5</td>
			<td>异型淋巴细胞</td>
			<td>原始细胞，NOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>慢性淋巴细胞白血病</td>
			<td>1/14</td>
			<td>异型淋巴细胞</td>
			<td>原始细胞，NOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>毛细胞白血病</td>
			<td>2/2</td>
			<td>异型淋巴细胞</td>
			<td>原始细胞，NOC / 单核细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多发性骨髓瘤</td>
			<td>5/46</td>
			<td>浆细胞</td>
			<td>原始细胞，NOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>急性髓系白血病</td>
			<td>3/16</td>
			<td>原粒细胞 / 原单核细胞</td>
			<td>淋巴细胞 / 早幼粒细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 淋巴母细胞淋巴瘤/白血病</td>
			<td>1/1</td>
			<td>淋巴母细胞</td>
			<td>淋巴细胞</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：&#160;ADM 的关键性误分类。 在 328 名患者中有 18 名（5.5%）观察到关键性误分类。ADM 关键性误分类的临床组包括：43 名成熟 B 细胞肿瘤患者中的 9 名，46 名多发性骨髓瘤（MM）患者中的 5 名，16 名急性髓系白血病（AML）患者中的 3 名，以及 1 名 T 淋巴母细胞白血病（T-ALL）患者中的 1 名。非典型淋巴细胞/原始细胞的误分类最为常见。NOC：未另行分类。 
引自：Starostka D, Dolezilek R, Kvasnicka HM, Kudelka M, Miczkova P, Kriegova E 等。自动化人工智能辅助数字细胞形态学在血液肿瘤诊断中骨髓分析的应用价值。Clin Transl Med. 2025; 15:e70364. https://doi.org/10.1002/ctm2.70364。补充材料。

本文描述了外周血和骨髓自动化数字细胞形态学的工作流程。在完成标准化的涂片制备和染色后，扫描仪采集样本图像。由人工智能驱动的软件对有核细胞进行定位、记录并初步分类，随后由专家进行复核。重点在于可能引起误诊的关键性细胞分类错误。

越来越多的证据表明，基于人工智能的外周血（PB）和骨髓（BM）自动数字细胞形态学（ADM）能够辅助专家……

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