Name: 膜蛋白功能化聚合物及聚合物/脂质杂化大单层和巨单层囊泡的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-07T15:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习利用PDMS-g-PEO接枝共聚物通过去污剂介导重组法制备膜蛋白功能化的大单层囊泡，并通过融合电形成技术将其转化为巨单层囊泡。该方法可构建稳定的功能化囊泡，适用于药物递送、生物传感和人工细胞等生物医学应用。

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本研究在马克斯·普朗克物质转化为生命学院开展，由迪特尔·施瓦茨基金会与马克斯·普朗克学会合作支持。我们感谢克劳迪娅·贝达尔茨（Claudia Bednarz）在细胞色素bo3氧化酶的分离与纯化工作中所做的贡献，同时感谢安妮·克里斯廷·温里希（Anne Christin Weinrich）在囊泡制备和显微镜技术方面的协助。

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作者声明不存在竞争性财务利益。

与传统的脂质体相比，聚合物囊泡（polymersomes）以及聚合物/脂质杂化囊泡具有更高的化学和机械稳定性，因此在药物递送、生物传感、纳米和微米反应器以及人工细胞等应用中极具吸引力。然而，由于其独特的膜结构和生物物理特性，通常难以将针对脂质体优化的实验方案直接应用于基于聚合物的体系15,20,30。本文所述方案针对这些差异进行了优化，提供了一套完整的膜蛋白重构流程，可将膜蛋白重组到基于PDMS-g-PEO的聚合物及杂化大单层囊泡（LUVs）中，并通过融合电致形成法进一步扩增为大单层囊泡（GUVs）。
该实验方案中的一个关键步骤是制备具有窄且可重复尺寸分布的大单层囊泡（LUVs）。与脂质膜类似，PDMS-g-PEO 膜在用水性缓冲液再水化时会自组装形成囊泡。与通常产生单层和多层囊泡混合物的脂质体系不同，PDMS-g-PEO 优先形成单层结构<sup class=...

两亲性嵌段共聚物可在水溶液中自组装形成膜结构，这些膜会自发弯曲并闭合，构成球形的、由膜包封的区室，称为聚合物体（polymer vesicles，简称 polymersomes）。与脂质膜相比，基于聚合物的区室具有更高的化学多样性以及增强的化学1和机械稳定性2，因此在药物递送、纳米和微米反应器以及构建耐用的人工细胞等应用中极具吸引力。我们课题组及其他研究团队已通过插入膜蛋白对聚合物膜进行功能化，以构建人工细胞器和人工细胞1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。含有聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane), PDMS）疏水核心的聚合物尤其适用于膜蛋白的整合，因其具有高度的链段柔韧性，并且可调节膜的疏水层厚度，以更好地匹配蛋白质的跨膜结构域5。尽管本实验室主要聚焦于接枝共聚物聚二甲基硅氧烷-接枝-聚环氧乙烷（PDMS-g-PEO），该共聚物可形成高度动态的膜结构4,16,17，其刚性低于传统脂双层，膜厚约为 5.3 nm1；而其他研究组则成功使用了基于 PDMS 的三嵌段共聚物，如 PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA5,6,7,8,9,10,11 和 PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz12，用于膜蛋白的重构。即使是相对刚性的二嵌段共聚物（如 PBD-b-PEO），特别是在与脂质混合的杂化体系中，也已被成功用于膜蛋白的整合13。这些实例凸显了基于聚合物的膜作为蛋白重构平台的广泛适用性，同时还能为整合的膜蛋白提供增强的化学稳定性1和更长的功能寿命14。尽管聚合物/脂质杂化膜在化学稳定性方面可能无法始终媲美纯聚合物体系1，但它们提供了一种理想的折中方案，即结合了聚合物的机械强度与脂质的生物学相关性。由此形成的膜环境更接近天然生物膜，同时保留了合成材料的关键优势。此类杂化结构还可带来额外优势，包括因纳米尺度重排1和膜内结构域形成15而降低的质子通透性。
已有多种技术可用于将膜蛋白重构至纳米级囊泡（LUVs）中，包括有机溶剂介导的重构法（如反相蒸发法、脂质-蛋白薄膜再水化）、机械法（如超声处理、French压滤法、冻融循环）以及去垢剂介导的重构法（通过去除去垢剂、稀释或直接掺入）。18以及更新的策略，例如直接从苯乙烯-马来酸共聚物纳米盘转移19虽然已有通过直接插入法将孔蛋白成功整合到聚合物大单层囊泡（LUVs）中的报道，例如在水合过程中将蛋白质添加至聚合物膜中8这种方法通常导致较大或更复杂的膜蛋白插入效率较低，并且常常引起蛋白质方向的随机性。因此，去垢剂介导的重建方法仍然是应用最广泛的技术，该方法包括先可控地加入去垢剂，随后将其去除。对于将较大的膜蛋白整合到基于聚合物的大单层囊泡（LUVs）中，特别是对于功能依赖于定向控制的不对称蛋白，该方法也是首选策略。在此方法中，首先用所选的去垢剂使囊泡膜达到饱和（饱和去垢剂浓度记为 R）饱和），部分溶解（囊泡与胶束共存），或完全溶解，即分解为胶束（去垢剂浓度记为 R溶剂随后进行蛋白质添加、孵育及去污剂去除的初始膜处理步骤18后者可通过透析、尺寸排阻色谱或吸附到疏水性聚苯乙烯珠（如 Bio-Beads）上实现。去垢剂的选择、其浓度以及去除方法需针对每种膜类型和蛋白质进行优化，以最大化包埋效率并控制蛋白质取向。20.
虽然大单层囊泡（LUVs）适用于整体活性测量，但单囊泡研究和基于光学显微镜的分析则需要将膜蛋白重建到巨型单层囊泡（GUVs）中。目前有五种主要方法用于将蛋白质整合到GUVs中：在蛋白质和有机溶剂存在下共形成21、在去垢剂存在下共形成22、通过去垢剂稀释将蛋白质插入预先形成的GUVs中23、通过与蛋白脂质体（proteo-LUVs）膜融合插入16,24，以及融合-电形成法25。尽管这些方法已成功应用于脂质GUVs，但将其应用于聚合物或聚合物/脂质杂化GUVs时往往面临挑战。特别是共形成法和去垢剂稀释法在聚合物膜中的插入效率通常较低，或与某些聚合物组成不兼容15。基于融合的策略4,16,24,26,27依赖额外的促融合试剂，也可能存在问题，因为合成的阳离子脂质/聚合物或促融合肽可能破坏膜蛋白的稳定性、改变膜的性质，或降低目标蛋白的整合效率。融合-电形成法克服了上述许多局限性，已被证明是一种将膜蛋白高效、稳健地整合到聚合物及聚合物/脂质杂化GUVs中的有效方法1,5,15。该方法能够在保持膜完整性和蛋白功能的同时实现对蛋白整合的可控性，因此特别适用于制备功能化膜蛋白的聚合物GUVs。
将质子泵重构到基于聚合物的囊泡中对于构建耐用的人工细胞至关重要，因为它能够产生跨膜质子梯度——这是生命系统的基本能量载体。通过在可控的最小膜环境中重现化学渗透能量转换28，这些囊泡可驱动ATP合成、主动运输和代谢反应，从而建立实现自主、类生命功能所需的能量基础。在这些系统中使用的一种代表性质子泵是来自大肠杆菌（E. coli）的细胞色素bo3 氧化酶，这是一种末端呼吸酶，可将氧气还原与跨膜质子转运相偶联。由于电子传递与质子泵送过程紧密偶联，其在合成囊泡中的活性可通过氧气消耗量1,20或通过监测质子梯度的形成1进行定量检测。
在本方案中，我们介绍了一种基于PDMS-g-PEO的大单层囊泡（LUVs）的详细制备流程，包括纯聚合物膜及聚合物/脂质杂化膜的制备、膜蛋白的功能化修饰、扩增为大单层囊泡（GUVs），以及通过整体耗氧检测和单囊泡质子泵活性测量，对重组的质子泵细胞色素bo3氧化酶进行活性测定。

<table><tbody><tr><td>&amp;Auml;KTA pure&amp;trade; 色谱系统</td><td>Cytiva</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>18:1 Liss Rhod PE</td><td>Avanti Research</td><td>810150</td><td></td></tr><tr><td>8孔腔室盖玻片</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFC5030</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 643 NHS 酯</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 643-31</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>胆酸钠盐（胆酸钠）</td><td>Serva</td><td>361-09-1</td><td></td></tr><tr><td>辅酶 Q1</td><td>TargetMol</td><td>TGM-T19594</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 STELLARIS 5</td><td>Leica Microsystems</td><td>603810</td><td></td></tr><tr><td>DTT（二硫苏糖醇）</td><td>Merck</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>细尖超微量移液管</td><td>Pastette</td><td>LW4243</td><td></td></tr><tr><td>HPTS（吡喃荧光素，8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6358-69-6</td><td></td></tr><tr><td>ITO涂层玻璃载片（25&amp;times;75&amp;times;1.1 mm，&amp;le;20 Ohm/方）</td><td>pgo</td><td>CEC020S</td><td></td></tr><tr><td>LAS X 软件</td><td>Leica</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td><td></td></tr><tr><td>迷你离心机 MCF-2360</td><td>LMS</td><td>24572</td><td></td></tr><tr><td>微型挤出器</td><td>Avanti Research</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm+P 系统</td><td>Hansatech Instruments</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪（台式）</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜，0.1 &amp;mu;m</td><td>Avanti Research</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>按压密封硅胶隔离器（圆形，直径 20 mm，深度 1 mm）</td><td>Grace Bio-Labs&amp;nbsp;</td><td>41161502</td><td></td></tr><tr><td>硅胶垫片（圆形，外径 24.2 mm，内径 14.3 mm，深度 1.8 mm）</td><td></td><td></td><td>实验室自制，由硅胶片切割而成</td></tr><tr><td>大豆 PC（95%）</td><td>Avanti Research</td><td>441601</td><td></td></tr><tr><td>Specord 50 PLUS 分光光度计</td><td>Analytik Jena</td><td>823-0200P-3</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL 柱（柱长 &amp;times; 内径 30 cm &amp;times; 10 mm）</td><td>Cytiva</td><td>28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>试管振荡器（2800 rpm）</td><td>IKA Lab Dancer</td><td>3365000</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort 5355</td><td>Eppendorf</td><td>5355000.011</td><td></td></tr><tr><td>Xiameter OFX-5329（PDMS-g-PEO；分子量 3000）</td><td>Dow Corning</td><td>000000000004109892</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS&amp;nbsp;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr></tbody></table>

膜蛋白功能化聚合物及聚合物/脂质杂化大单层和巨单层囊泡的制备

Preparation of Membrane Protein&#8211;Functionalized Polymer and Polymer/Lipid Hybrid Large and Giant Unilamellar Vesicles

由两亲性嵌段共聚物单独形成或与磷脂混合形成的囊泡，相较于传统的脂质囊泡，具有更优异的机械和化学稳定性。这使其成为一种极具吸引力的底盘平台，可进一步开发和拓展以实现特定应用，例如药物递送、诊断型生物传感、人工细胞构建以及仿生微米和纳米反应器。特别是，通过膜蛋白的整合实现功能化，对其中许多应用至关重要。本文介绍了一种通过去垢剂介导的重组方法，制备由接枝共聚物PDMS-g-PEO构成的膜蛋白功能化大单层囊泡（LUVs）的实验方案。此外，我们还描述了如何通过融合-电致形成法将这些大囊泡转化为巨型单层囊泡（GUVs）。该方案涵盖膜蛋白的荧光标记、聚合物及杂化LUVs的制备、膜蛋白的重组、通过动态光散射（DLS）进行粒径分布分析、通过耗氧量测定评估蛋白活性、蛋白功能化GUVs的制备，以及通过共聚焦显微镜分析GUVs中蛋白插入和质子泵送活性。代表性结果表明，成功制备了单分散的蛋白-LUVs，其多分散指数（PDI）低于0.2，并生成了直径范围为5–35 µm的蛋白-GUVs。通过耗氧量测定证实了蛋白活性，在聚合物LUVs中为18.2 nmol/min/mL，在杂化LUVs中为26.9 nmol/min/mL。通过荧光强度定量了蛋白在GUVs中的插入情况，聚合物GUVs为20.6 ± 3.7 a.u.，杂化GUVs为26.2 ± 5.0 a.u.。通过包封的pH敏感性染料监测GUVs中的质子泵送活性，结果表明蛋白功能得以保持，且以内向质子泵送为主。该共聚物的机械柔软性及类脂双层厚度（约5.3 nm）有利于膜蛋白的高效插入并维持其功能活性。

E. coli 细胞色素 bo3 氧化酶由质粒 pETcyo 在 E. coli 菌株 C43 (DE3) ΔcyoABCDE 中表达，并按照先前所述方法进行纯化29。纯化的 bo3 氧化酶可直接用于重组和活性测定，或用荧光染料标记，例如 ATTO 643（本研究）或其他 ATTO 染料1,15。对于像 ATTO 643 这类高度亲水性的染料，使用30 cm的层析柱可有效分离未结合的染料与标记蛋白（图3A）。标记程度（DOL）通过吸收光谱计算，通常为每酶分子1.1–1.3个染料分子，具体数值取决于所用的ATTO染料。对于用ATTO 643标记的bo3氧化酶，DOL为1.16（图3B）。
<p c...

本方案展示了通过去垢剂介导，将膜蛋白——细胞色素bo3泛酚氧化酶——重组到由PDMS-g-PEO制备的大单层囊泡中，并通过融合-电形成法将其转化为巨大囊泡。所获得的功能性聚合物基区室适用于高级生化与生物物理研究。

由两亲性共聚物单独形成或与磷脂混合形成的囊泡，相较于...，具有更优异的机械和化学稳定性

Our research focuses on building artificial cells from the bottom up, combining natural and synthetic materials to form fully functional biomimetic systems. Our protocol for building protein-functionalized polymer vesicles applies to drug delivery, construction of artificial cells, nanoreactors and biosensors.To begin, use positive-displacement pipettes with solvent-resistant tips or gas-tight glass syringes to transfer the polymer, lipid and fluorescent dye solutions dissolved in a 2-to-1 mixture of chloroform and methanol into a clean glass vial. Mix the solution thoroughly by gentle vortexing while holding the glass vial upright to ensure homogeneity. Evaporate the organic solvents under a gentle stream of nitrogen in the fume hood for approximately one hour, until a uniform thin film forms on the glass vial wall. If polymersomes are used for reconstitution, supplement the rehydration buffer with 0.1% sodium cholate, then rehydrate the dried film with 1 milliliter of rehydration buffer to obtain a final amphiphile concentration of 5mg/ml. Vortex the glass vial vigorously until the film is completely detached and suspended, forming multilamellar vesicles. Subject the hybrid multi

preparation-membrane-proteinfunctionalized-polymer-polymerlipid

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科研

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Biochemistry

生物化学

膜蛋白功能化聚合物及聚合物/脂质杂交体大片和巨型单层囊泡的制备

本文介绍了一种用于制备、纯化和使用酶包封外膜囊泡（OMV）的实验方案，该囊泡可提高酶的稳定性，适用于多种不同应用。...

定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

包含高度密集的微米级组分的巨大囊泡是有效的细胞模型。水包油乳液离心法是一种制备包封材料的巨大囊泡的简单而强大的工具。...

通过油包水乳液离心法制备包封微球的巨型囊泡

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

本实验方案的目的是通过碱酶法水解鸡羽毛制备角蛋白水解物，并检测将角蛋白水解物添加至化妆品软膏基质中是否能够改善皮肤屏障功能（提高皮肤水合程度并减少经皮水分流失）。实验在男性和女性志愿者中进行。...

从鸡毛中制备角蛋白水解物及其在化妆品中的应用

本方案描述了一种在固体培养基上大规模培养秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

基于平板的大规模培养 秀丽隐杆线虫糖尿病代谢改变研究的样本制备

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

本文描述了一种从液体样本中无标记固定外泌体和细胞外囊泡，并通过原子力显微镜（AFM）对其进行成像的逐步操作方法。利用AFM图像可估算溶液中外泌体的尺寸，并表征其其他生物物理特性。...

原子力显微镜对外泌体的成像

我们描述了一种方法，用于表征通过在大肠杆菌（E.

通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 E. coli 膜泡的制备与生产

在本实验方案中，我们介绍了一种优化的工作流程，该流程结合了高效且快速的大量样本制备方法。此外，我们还提供了逐步操作指南，以减少分析变异，实现对代谢组全基因组关联研究的高通量评估。...

大规模多组学全基因组关联研究（Mo-GWAS）：样本制备与标准化操作指南

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