Name: 用于真菌种间相互作用过程中形态计量学研究的无接触共培养实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习无接触共培养实验方法，用于研究真菌种间相互作用过程中的形态计量学变化。该方案采用膜插入孔板法和无细胞上清液法，结合Fiji软件进行定量分析，为微生物群落研究提供可扩展的技术工具。

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本工作由授予RNP的DBT-Wellcome Trust印度联盟中级研究员项目（IA/I/19/1/504294）资助。KBSS获得了艾哈迈达巴德大学特别研究资助（AU/SRG/SAS/20-21/07_KS_03.25）以及SERB核心研究资助（URBSASE23A6/SERB/23-24/KS_02.27）的支持。图1中使用的图标改编自Servier医学艺术（https://smart.servier.com/），根据知识共享署名4.0许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）授权，以及来自美国国立卫生研究院（NIH）下属的美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）BioArt资源库。

C. albicans 和 C. glabrata 均被归类为生物安全二级（BSL-2）的人类机会性病原体。所有实验操作必须在经过认证的生物安全柜内进行，并严格遵守良好的微生物操作规范（GMP）以及机构规定的 containment 程序。全程必须穿戴个人防护装备（PPE），包括实验服、双层手套和护目用具。所有被污染的耗材、塑料制品和液体培养物在最终处理前，必须经过验证的高压灭菌（121 °C，15 psi，20 分钟）或使用新配制的 10% 次氯酸钠溶液进行化学消毒（推荐参考：美国国立卫生研究院（NIH）2022 年废弃物处理指南）。本方法中使用的所有标准试剂、分析纯级化学品和设备均列于材料表中。表 1详细列出了真菌菌株的特性及其背景基因型。本研究中所用培养基及其成分列表见补充文件 1。
1. 细胞游离上清液（CFS）的制备
<ol>
	<li>培养物的建立与孵育
	<ol>
		<li>使用无菌塑料接种环挑取一个孤立的单菌落 C. glabrata CBS138 新鲜培养于&#160;葡萄糖最低培养基（GMM）琼脂平板28将菌落接种至含有10 mL标准酵母胨葡萄糖（YPD）液体培养基（1% w/v 酵母提取物，2% w/v 蛋白胨，2% w/v D-葡萄糖）的无菌玻璃试管中29.</li>
		<li>将试管固定于轨道摇床培养箱中，在恒定温度下培养菌液 37 &#176;C 在200 rpm条件下持续振荡18小时。</li>
		<li>通过检测光密度（OD600）处于12.0至14.0的稳定范围内。在显微镜下观察细胞，确认细胞呈酵母形态且无污染。此发育窗口期对于确保稳定的胞外分泌组分充分积累至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞分离与过滤
	<ol>
		<li>无菌转移18 h C. glabrata 将液体培养物转移至无菌的15 mL锥形聚丙烯离心管中。</li>
		<li>平衡试管，并在5,000 x g 在严格控制的室温下持续 5 分钟 25 &#176;C 将生物质压缩成紧密的颗粒。</li>
		<li>将粗制液体上清液倾析至一个洁净无菌的20 mL塑料注射器中。小心地将注射器连接至无菌 0.22 &#181;m 聚醚砜（PES）低蛋白吸附膜滤器</li>
		<li>对液体施加稳定的机械压力，使其通过聚醚砜（PES）滤膜，收集至无菌的15 mL离心管中，制备工作用无细胞上清液（CFS）。若过滤过程中感到阻力，切勿施加过大的压力，以免导致滤膜破裂；此时应更换新的滤膜进行过滤。 
		注意：不要将 freshly harvested CFS 置于快速冻融循环中，或低于指定温度的储存条件下 4 &#176;C 在建立检测体系之前，由于低温沉淀可能使低丰度蛋白质因子失稳。</li>
		<li>若直接进行配套的膜插件培养板共培养实验（步骤 4），请将目标压缩细胞沉淀保留在初始收集管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备 白色念珠菌 用于菌丝诱导实验的接种物
<ol>
	<li>接种物的制备与维持
	<ol>
		<li>直接从保存于 -80 °C 的长期甘油主培养物中取出目标 C. albicans 菌株（基因型参见 表1），在固体 GMM 平板（0.67% w/v 无氨基酸酵母氮源基础培养基，2% w/v D-葡萄糖，2% w/v 琼脂）上划线接种，以获得工作用菌落。</li>
		<li>对于二倍体菌株（SC5314、RBY1132、RBY1133）：挑取单个菌落接种至 5 mL 液体 GMM 培养基中。在 37 °C、200 rpm 持续振荡条件下培养 12 小时。 
		&#8203;注意：使用最小培养基（GMM）进行二倍体细胞的过夜培养，对于抑制在营养丰富培养基中常见的自发性自丝状化至关重要。</li>
		<li>对于单倍体菌株（GZY896、GZY803）：挑取单个分离菌落接种至 5 mL 添加了 0.1 mg/mL 尿苷的液体 YPD 培养基（YPDU）中。在 37 °C、200 rpm 持续振荡条件下培养 12 小时。</li>
		<li>为保持形态稳定性并确保实验一致性，液体传代次数应限制在连续不超过三次。若起始对照菌群中自丝状化或假菌丝聚集现象超过 2%，则应弃用该菌株，并从主冻存菌种中重新复苏新鲜细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标准化处理
	<ol>
		<li>将过夜培养的液体培养物 1 mL 转移至无菌比色皿中。使用校准的紫外-可见分光光度计，在 600 nm 处精确测定吸光度（OD600），以新鲜 GMM 或 YPDU 培养基作为空白对照。 
		注意：过夜液体培养物的 OD600（细胞密度），尤其是 YPDU 中培养的样品，可能超出分光光度计的检测线性范围。在此情况下，应在测定前对培养物进行适当稀释（10–20 倍）。</li>
		<li>计算生成标准化目标悬液所需的浓菌液体积。在无菌离心管中，用预热至 37 °C 的液体 GMM 稀释菌液，制备 1 mL 工作用接种液，调整其最终绝对 OD600 至 0.1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
基于CFS的菌丝诱导实验（96孔板格式）
<ol>
	<li>实验设置
	<ol>
		<li>取一个无菌、光学透明、平底的96孔聚苯乙烯微孔板。</li>
		<li>检测孔设置：将新近过滤的 C. glabrata CFS（来自步骤1.2.4）45 µL 直接加入指定的检测孔中。再加入45 µL无菌GMM培养基（若检测单倍体目标菌株，则使用YPDU培养基）。</li>
		<li>阴性培养基对照：在对照孔中加入90 µL GMM培养基。另外，在另一个单独的孔中，将45 µL无菌GMM培养基与45 µL未接种的空白YPD培养基混合，以监测基础背景培养基成分。</li>
		<li>阳性诱导对照：在孔中加入80 µL GMM培养基和10 µL胎牛血清（FBS；终浓度为10% v/v）。</li>
		<li>接种：将标准化的 C. albicans 工作接种液（来自步骤2.2.2，OD600 = 0.1）准确吸取10 µL，加入所有实验组和对照组孔中含90 µL适当培养基的溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养与数据采集
	<ol>
		<li>用配套的塑料盖盖好96孔板，以减少蒸发。将板置于37 °C恒温静置培养箱中，精确培养3小时。在此期间避免移动或振荡板，以确保菌丝稳定形成。</li>
		<li>培养结束后，将多孔板垂直放置于配备明场光学系统和集成数字CCD相机模块的倒置光学显微镜载物台上。</li>
		<li>对每个孔至少五个不同的视野，系统性地采集自动或手动图像。</li>
		<li>每种条件需设置明确的技术重复（双份），并在不同日期至少进行三次完全独立的生物学重复实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 膜插件培养板共培养实验
<ol>
	<li>基底侧（下部）区室设置
	<ol>
		<li>取一个无菌的24孔组织培养载体板。</li>
		<li>将经标准化处理、OD600 = 0.1 的 C. albicans 细胞悬液（来自步骤2.2.2）准确加入1.0 mL至下部基底侧区室中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>管腔侧（上部）区室设置
	<ol>
		<li>取出在步骤1.2.5中保留的 C. glabrata 细胞沉淀。将沉淀重悬于1 mL无菌GMM培养基中，以5000 × g 离心3分钟，弃去上清液。重复该洗涤步骤两次，以去除残留的营养成分或旧培养基组分。</li>
		<li>将最终洗涤后的沉淀重悬于新鲜GMM培养基中，并调节其最终光密度至高浓度值OD600 = 5.0。</li>
		<li>使用无菌镊子夹取一个带有核孔径为0.4 µm的聚碳酸酯膜的无菌膜插件，平稳地将其插入已装有液体的24孔板孔中，并将插件上部的凸缘固定在孔板中间的卡槽位置。</li>
		<li>准确向顶部管腔侧插件区室中加入750 µL浓度为OD600 = 5.0 的浓缩 C. glabrata 培养物。 
		&#8203;注意：在整个膜屏障两侧维持约1:50（C. albicans 与 C. glabrata）的初始细胞比例，可在避免局部反馈伪影的同时，确保信号配体的充分积累。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育与成像
	<ol>
		<li>将组装好的带膜插件的24孔板盖好，在37 °C条件下静置孵育&#160;或以30 rpm轻微振荡孵育，精确孵育3小时。</li>
		<li>孵育结束后，使用无菌镊子小心提起并取出每个孔中的上部管腔侧插件，将插件丢弃至生物危害废物容器中。 
		注意：成像前必须完全移除上部插件膜，以消除高分辨率显微镜检测过程中可能出现的折射阴影、光散射模式及背景网格伪影。</li>
		<li>将24孔板置于倒置显微镜载物台上进行形态学评估。本研究中使用的倒置显微镜配备有10x/0.30NA、20x/0.50NA或超长工作距离40x/0.60NA物镜，并配有微分干涉（DIC）滤光片组。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 高分辨率显微镜与数字图像分析
<ol>
	<li>数字图像采集
	<ol>
		<li>使用10倍低倍物镜扫描孔板底部，以验证细胞分布的均匀性，并标记任何局部追踪错误或异常的细胞聚集现象。</li>
		<li>使用校准的20倍物镜至少采集10个不同的视野图像。这些图像构成追踪标准丝状结构数量和种群分布的核心数据集。</li>
		<li>使用40倍超长工作距离物镜配置拍摄显微照片，用于精细的表型分析及细胞边界的详细测量。保存所有原始图像文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量表型分析流程（Fiji）
	<ol>
		<li>启动 Fiji （版本 1.54p 或更高）处理软件。通过导航至目标显微照片以打开该图像 文件 &#62; 打开 或直接将文件拖入 Fiji 控制面板</li>
		<li>菌丝长度追踪（L）：在主界面中右键单击线条选择图标 Fiji 工具栏并选择 分段线工具 从下拉菜单中选择。将光标准确定位在运动的菌丝从母体酵母细胞壁边界伸出的交界处。
		<ol>
			<li>左键连续点击，沿菌丝的中央纵轴进行描迹，通过放置锚点来调整任何弯曲或转折，并将线条终止于其最顶端的尖端处。点击 测量 记录长度，单位为微米（µm）&#181;m）。按压 Ctrl+M （Windows）或 Cmd+M （Mac OS）记录总长度（L），单位为微米（µm）&#181;m结果窗口内</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为避免对同一纤丝重复测量，可使用内置的“画笔工具”标记每个已完成的细胞。</li>
		<li>母体酵母细胞分析：定位与先前追踪的菌丝状菌丝相对应的附着母体酵母细胞体。使用 分段线工具 沿细胞体的最长轴画一条直线，测量其最大长轴（定义为变量‘a’），并执行 测量 命令
		<ol>
			<li>沿细胞体最宽的横向跨度画一条严格垂直于主轴的次级线，以测量其相应的垂直横轴（即短轴，定义为变量‘b’），并执行后续操作 测量 命令</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计算母体酵母细胞的总体积（CV，单位为立方微米， &#181;m3) 通过使用变量“a”和“b”的对数值，并应用长椭球体的标准几何模型计算：CV = 4/3 &#960; ab2.</li>
		<li>菌丝结构厚度（d）：选择 分段线工具测量外壁之间的距离&#160;即垂直于长度轴的直线。沿菌丝长度方向选取三个等距点进行测量，以考虑自然结构变异，并记录每次测量值。 通过 的 测量 命令
		<ol>
			<li>计算这三个不同数据点的算术平均值，以确定准确的平均厚度值（d）。将计算得到的平均直径值除以二，以确定结构变量半径（r = d/2）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计算菌丝细丝的总体积（HV，以 &#181;m3）通过将菌丝视为无分支的规则几何圆柱体进行处理。将追踪得到的菌丝长度（L）和推导出的结构半径（r）应用于以下计算模型：HV = &#960; r2 L.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 统计学设计 
<ol>
	<li>生物学重复
	<ol>
		<li>在至少三次独立的生物学重复实验中，使用新鲜制备的独立起始培养物进行所有单个测试布局。</li>
		<li>每次生物学重复实验中，每种条件至少设置两个相同的重复技术孔，以消除孔边缘效应或加样误差的影响。</li>
		<li>定义实验单位：为确保统计学有效性并避免人为误差，每个实验至少应包含三次技术重复。在同一孔内测量的单个细胞属于技术性子样本；同理，三个这样的孔即对应三次技术重复。同样，建议每个样本进行三次生物学重复（独立实验）（N = 3）。</li>
		<li>在一次生物学实验的每个不同条件下，于多个视野中随机选取50至100个单个细胞进行测量。针对每个生物学重复，计算这些细胞测量值的平均值或中位数。所有后续的比较性统计检验均应使用来自生物学重复的平均值或中位数值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分布分析与假设检验
	<ol>
		<li>在采用参数检验方法（例如均值比较）之前，使用Shapiro-Wilk检验或D’Agostino-Pearson正态性检验对生物学重复数据集进行正态性评估。</li>
		<li>双组比较：当将一个实验组直接与一个对照背景组（例如，野生型）进行比较时 C. albicans 纯培养基中的生长与分离培养中的生长 C. glabrata 慢性疲劳综合征（CFS），采用非配对双尾 t 检验 t检验，前提是数据集符合正态分布。
		<ol>
			<li>如果数据显著偏离正态分布，则应改用非参数检验方法，例如 Mann-Whitney U 检验（Wilcoxon 秩和检验），该方法通过比较排序后数据的中位数进行分析，不依赖于数据的绝对数值。非参数检验还具有对异常值不敏感的优点。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>多组评估：在同时评估三个或更多遗传品系或处理组合时（例如，追踪不同遗传背景下的形态学变异） MATa/a, MAT&#945;/&#945;，以及 MATa/&#945; 菌株），进行标准的单因素方差分析（One-Way ANOVA），随后采用Tukey事后检验进行多组两两比较。若正态性检验不满足，则改用非参数的Kruskal-Wallis检验，并随后进行Dunn's事后多重比较分析。</li>
		<li>图形表示与数据可视化：使用统计与绘图软件完成所有统计分析及图形绘制。 
		注意：可使用功能相当的软件进行统计分析并绘制图形。膜插件培养板和CFS检测的数据可用柱状散点图、抖动小提琴图或抖动箱线图表示，这些图形可展示中位数（中央线）和95%置信区间（本研究所用方法），或中位数（中央线）以及第一和第三四分位数（分别为底部线和顶部线）。</li>
		<li>将正式统计显著性的阈值设定为 α 水平 p &#60; 0.05。所有生成的数据图和表中均应保持常规的符号标注方式。例如：ns： p &#62; 0.05; *: p &#60; 0.05; **: p &#60; 0.01; ***: p &#60; 0.001; ****: p &#60; 0.0001.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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作者声明不存在任何竞争性或冲突性利益。

先前的研究利用膜插件培养板和基于无细胞上清液（CFS）的检测方法表明，C. albicans 会对 C. glabrata 细胞或其无细胞上清液（CFS）产生菌丝。然而，其他酵母菌（如 Saccharomyces cerevisiae 和 Candida dubliniensis）则不会诱导该反应30。此外，这种菌丝形成反应不仅限于 C. albicans SC5314 实验室参考菌株，也在其他基因组背景（包括临床分离株 WUM5A）中出现30。在本实验方案中，基于上述发现建立了一套标准化的工作流程，用于定量三种形态学指标：菌丝长度、菌丝体积和菌丝厚度。此外，利用这些形态学参数评估了倍性变化以及交配型位点状态对 C. albicans 在响应分泌型诱导分子时形态特征的影响。
本文所述的非接触式方法为可视化和分析可溶性跨物种信号因子的形态计量学结果提供了一个简单的实验框架。膜插件培养板允许活性培养物之间双向扩散，而基于无细胞上清液（CFS）的检测方法则具有可扩展性，因为所需的诱导成分可独立于下游靶标培养物进行收集。在膜插件培养板实验体系中，需维持约1:50（C. albicans 与 C. glabrata 的比例）以确保检测的一致性。该浓度梯度可确保可溶性诱导分子在膜屏障间有足够通量，同时避免内源性群体感应抑制剂（如法尼醇）积累超过阈值，后者可能抑制 C. albicans 的菌丝化动力学31,32。类似地，在基于CFS的检测中，一个关键步骤是 C. glabrata 源培养物需经过18小时的孵育，以使其均匀达到后期静止生长期。若 C. glabrata 培养物的孵育时间少于12小时或多于24小时，则所收集的CFS中本研究所关注的特定诱导分子浓度可能未达最佳水平，导致菌丝诱导效果不理想。对于任何新的实验目标和/或新的微生物物种组合，收集CFS的合适生长阶段或培养物比例均需进行标准化。
为最大限度地提高不同实验室条件下检测的可重复性，建议采用以下关键实验步骤优化措施。建议使用葡萄糖最低培养基（Glucose Minimal Medium, GMM）对所有二倍体白色念珠菌（C. albicans）菌株进行过夜培养。使用GMM可抑制在营养丰富的YPD培养基中常观察到的背景性自发菌丝形成。其他研究中也观察到此类自发菌丝化现象，但其潜在机制尚不明确33。此外，建议在图像采集前将聚碳酸酯膜插入物完全物理移除，以消除光散射和光学畸变，避免其对高倍明场显微镜观察造成干扰。
尽管这些无接触式共培养装置有助于区分可溶性信号组分的作用，但其存在特定的实验挑战。例如，无接触式实验可能因操作不当导致膜破裂，从而带来微生物交叉污染的微小风险。因此，在定位移液器吸头时应格外注意，取样过程中应确保吸头接触插入室的腔壁，而非直接接触膜表面。此外，若使用孔径过大（不合适的）的插入膜，也可能导致不同腔室间的物理交叉污染，这一问题可通过选用具有合适膜孔径的插入装置轻松解决。真菌过度生长或大量生物膜沉积可能覆盖多孔膜表面，可通过将初始接种浓度限制在 OD600 = 0.1 并避免培养超过 12 小时来避免。另外，微生物在装置孔内的分布可能不均匀，常聚集或附着在膜附近，这可能导致光密度测量结果出现意外偏差。此外，由于这些系统在物理上分隔了两个菌群，因此无法模拟或评估依赖于细胞间直接物理接触的相互作用，例如多物种生物膜的成熟过程、机械性共聚集，或由细胞壁锚定黏附素介导的信号传导。尽管基于培养板的实验能够有效提供早期菌丝形成动力学的终点快照（在 3 小时时），但其无法捕捉长期的生长动态或空间行为特征。对于需要长时间连续实时监测的研究人员而言，专用的微流控灌注通道或自动化活细胞成像腔室可能是更合适的替代方案。
细胞几何形态与代谢效率密切相关，其中表面积与体积之比（SA/V）是影响营养物质获取和细胞内运输的关键因素。在双相性及丝状真菌中，转变为细长的菌丝形态是一种结构上的适应机制，用以维持优化的SA/V比值。这使得营养物质能够沿延伸的菌丝壁进行分布式吸收，同时维持菌丝顶端定向的代谢过程34,35,36,37。然而，本研究表明，形态计量学上的缩放关系在不同倍性状态和交配型位点构型之间并非呈均匀的正比关系。
生成的形态测量数据集 通过 该追踪方案揭示了与倍性相关的明显结构比例变化趋势，单倍体品系在所有几何参数上的绝对值均持续低于相应的二倍体菌株（图5）。在二倍体背景下，纯合的 MAT&#945;/&#945; 构型表现出比对照组更显著的菌丝化动力学（长度和体积）增强 MATa/a 或 MATa/&#945; 这些条件下的菌株 体外 条件。鉴于菌丝增强通常与穿透能力提高相关，目前尚不清楚为何临床分离株的 C. albicans 主要以杂合二倍体形式分离获得（MATa/&#945;）。在免疫功能健全的宿主中，杂合状态可能为长期共生定植提供更广泛的适应性优势。换句话说，其结构特征 MATa/&#945; 形态型已优化以抵御宿主免疫监视。因此，未来的研究应利用这些标准化的共培养系统，在不同选择压力下系统评估不同交配型纯合子的相对适应性。
已有研究表明，液泡形态、分裂-融合动态以及结构扩张在调控延长中真菌菌丝的内部体积和膨压方面发挥着重要作用。例如，在水稻稻瘟病病原菌Magnaporthe oryzae中，细长的营养菌丝与膨大的侵入性结构之间的显著转变，与液泡组织方式的变化密切相关38,39,40。然而，本实验方案并未直接监测C. albicans菌丝形成过程中的液泡动态，将这些内部细胞器的变化与整体结构体积关联起来，是未来研究中一个具有重要意义的方向。此外，还需进一步研究以明确为何特定真菌来源的分泌组成分会比血清等宿主来源的化学诱导剂引发不同的形态扩展动力学。
本方案中详述的无接触共培养方法可适用于研究物种间及跨生物界相互作用，例如机会性细菌群体与双相真菌之间的信号传导动态。此外，由于该96孔和24孔体系具有可扩展性，这一定量平台可用于化学筛选，例如鉴定小分子抑制剂或新型抗真菌化合物，以选择性阻断分泌组刺激的菌丝化通路，同时不直接影响细胞的基础存活率。

在自然和临床生态系统中，微生物通常存在于结构化的多微生物群落中，其内部和&#160;种间&#160;通信由复杂的网络所调控1。这些微生物群落利用多种化学信号（包括群体感应分子、挥发性有机物以及分泌型肽和蛋白质）来协调群体水平的行为2。解析这些通信动态至关重要，因为协同、竞争或捕食性的生态位相互作用会显著改变微生物的代谢、空间结构和应激适应能力3。在临床层面，相较于单一种群培养，这些多微生物网络（如双物种细菌-真菌或种间真菌-真菌群落）常表现出协同致病性、加速组织定植以及更高的抗微生物耐药性4,5。因此，阐明微生物通信的分子决定因素对于突破传统模型、开发可破坏群落稳定性的新型抗感染策略具有重要意义6。
为了剖析微生物相互作用的不同模式，研究人员采用多种实验体系，这些体系主要源自哺乳动物细胞生物学、免疫学和肿瘤学研究7,8,9。例如，直接接触共培养模型是研究&#160;juxtacrine&#160;信号传导及细胞间物理接触的标准方法10。类似的实验装置经适当改进后，也被用于研究微生物之间的物理相互作用，以理解种间抑制效应或对药物的响应9,11,12。然而，由于接触依赖性信号和可扩散信号均可能参与所观察到的反应，因此很难区分其潜在机制。尽管传统的基于接触的检测方法可提供空间信息，但其实验过程繁琐，且通常需要对菌株进行特异性标记，这对于非模式生物而言尤为耗时。相比之下，Transwell（膜插入式培养板）实验体系主要用于哺乳动物细胞研究，可有效区分接触依赖性信号与可扩散信号的贡献13,14,15,16。当细胞间通讯由分泌分子介导时，该方法尤为有效，能够实时分析细胞群体间的信号动态17。此外，无接触实验具有膜分离的优势，还可与计算模型相结合，动态追踪传统方法难以检测的微生物行为18。该策略偶尔也被用于同时研究不同细菌物种的发育动力学19。
相较于膜插件培养板检测，一种成本更低且通量更高的替代方法是基于无细胞上清液（CFS）或条件培养基的检测。该方法已知可用于再生医学和血管生物学领域，以分离分泌组，从而研究干细胞介导的组织修复和/或肿瘤诱导的血管生成20。类似地，在微生物研究中，CFS体系已被用于解析多微生物间的竞争关系。例如，细菌滤液（如&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;的酰基高丝氨酸内酯或&#160;Lactobacillus&#160;的代谢产物）已被用于调控真菌生物膜的成熟过程21,22。&#160;近年来，微流控平台通过“器官芯片”技术实现了高保真的生理模拟23,24。尽管微流控系统已被用于同时检测微生物群落对其分泌物的响应，但其需要专用仪器和专业技术，可能无法在所有实验条件下广泛应用25,26,27。因此，在大多数情况下，膜插件培养板检测和基于CFS的检测仍是首选方法。选择其中哪一种方法取决于分泌分子的性质：若分泌分子不稳定（即半衰期短）且需要实时测定其活性，则膜插件培养板检测更为合适；反之，若分泌分子稳定且实验规模较大，则基于CFS的检测更具经济性。
本实验方案的主要目标是介绍一种逐步定性和定量追踪方法，用于评估形态学特征，使用膜插件培养板和CFS平台（图1）。本文以Candida albicans与Candida glabrata之间由分泌因子驱动的通讯为例进行了演示。此外，这些工具还可用于量化内在遗传变量（倍性及交配型位点状态）在暴露于分泌信号分子时对&#160;C. albicans&#160;菌丝绝对几何发育（长度、体积和直径）的影响。该已建立的实验方案提供了一个简单且经济的非接触式平台，适用于研究物种间信号动态。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m PES 注射器滤器</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 24孔细胞培养插件载板（0.4 &amp;mu;m）</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Nunc BioLite 96孔多孔培养皿，细胞培养处理，平底</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>酵母氮源基础，含硫酸铵，不含氨基酸</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

用于真菌种间相互作用过程中形态计量学研究的无接触共培养实验

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

微生物群落中，细胞行为和形态通常受到多种细胞内和细胞外因素的影响。目前可用于研究微生物间通讯的方法可能较为繁琐，且/或需要专门的设备与专业技术。&#160;本文介绍了两种互补的非接触共培养方法：膜插件培养板共培养实验和基于无细胞上清液（CFS）的实验方法，二者均以形态学转变作为可测量的响应指标，用于探究特定种间相互作用中各类因素的作用。膜插件培养板系统可在允许细胞外分子扩散的同时，实现物理分离的物种之间的实时相互作用。相比之下，基于CFS的实验方法则为评估对条件培养基的响应提供了一种简化且可扩展的途径。本文提供的实验方案包括培养物制备、条件上清液制备、实验设置、显微观察、图像采集、使用Fiji进行定量形态计量分析以及统计学评估等标准化操作流程。本方案以真菌对内在和外在因素的形态学响应为例进行了验证。本文所述方法为研究微生物群落中新型相互作用提供了易于获取且可灵活调整的替代工具，并可进一步拓展用于探究群落中多物种共存的潜在机制。

用于研究物种间相互作用的非接触共培养实验
可溶性、低丰度的胞外信号分子常在混合微生物共栖过程中介导关键的通讯事件。此类动态过程通过两种无接触的基于细胞的装置进行评估，旨在分析不同微生物之间的相互作用模式 C. albicans 和 C. glabrata，同时防止细胞间直接的物理接触。第一种构型采用了一种集成膜插件培养板系统，其中两个细胞群体由一种惰性的 0.4 &#181;m 多孔聚碳酸酯膜，允许分泌分子在屏障两侧自由双向扩散。第二种装置监测了生长情况 C. albicans 在微孔板中直接培养的酵母细胞，微孔板内含有从静止期培养物中收获的无细胞上清液 C. glabrata 培养物（Cg慢性疲劳综合征（CFS）。
与之前的筛选结果一致30，野生型杂合二倍体白色念珠菌（C. albicans）细胞（SC5314）在受到膜插件屏障分隔的格列贝尔假丝酵母（C. glabrata）细胞或经过滤的CgCFS刺激时，均能迅速形成真正的菌丝。而培养在纯阴性对照培养基（GMM或YPD）中的细胞则主要保持芽殖酵母形态和假菌丝形态（图2A）。比较分析显示两种实验体系的结果具有一致性。在所有结构参数指标上，包括菌丝长度、体积和厚度，两种检测方法获得的数值均具有可比性（图2）。若适当的统计检验所得p值经多重比较的事后检验后达到0.05的标准，则认为形态学参数的差异具有统计学意义。这些观察结果表明，在膜插件板体系中由C. glabrata细胞诱导产生的真正菌丝长度（39.66 µm ± 6.81 µm），与暴露于过滤后的CgCFS所诱导的菌丝长度（37.13 µm ± 6.50 µm；图2B）之间无显著差异。C. albicans细胞在膜插件板系统中诱导产生的菌丝体积（112.10 µm3± 22.59 µm3）与在CgCFS条件培养基中产生的菌丝体积（109.78 µm3± 34.69 µm3；图2C）相比，亦无显著差异。此外，菌丝直径的测量结果进一步证实，两种实验体系之间的平均菌丝厚度保持一致，膜插件板系统的菌丝厚度为1.89 ± 0.10 µm，而CgCFS处理组为1.92 µm ± 0.23 µm（图2D）。
倍性状态和交配型构型的变化 体外 形态学维度
在不同的真菌模式系统中，已确立了倍性水平和交配型位点结构在调控二形性转换中的作用。在此，应用分析追踪流程对一组单倍体（MATa 或 MATα）和二倍体（MATa/a、MATα/α 或 MATa/α）白色念珠菌（C. albicans）菌株的菌丝化指标进行了量化分析，具体包括菌丝长度、结构体积、菌丝粗细以及相应母体酵母细胞的体积。
结构分析显示，与同型二倍体 MATa/a 菌株相比，同型二倍体 alpha 菌株（MATα/α）在暴露于诱导性 CgCFS 分泌组或阳性血清对照后，形成的菌丝具有显著更长的轴长（分别为 45.56 µm ± 9.24 µm 和 46.62 µm ± 9.07 µm）和更大的体积（分别为 125.24 µm3 ± 39.94 µm3 和 119.45 µm3 ± 37.32 µm3）（图 3A,C）。尽管C. albicans的标准临床分离株主要以杂合二倍体形式存在，参考菌株MATa/α在诱导后（尤其是血清诱导）也表现出比MATa/a菌株更长的菌丝和更大的体积。然而，其菌丝长度和体积仍显著低于同型二倍体MATα/α菌株（图 3B,D）。
同时，单倍体菌株表现出相反的模式，其中单倍体 MATa 与单倍体相比，该菌株的菌丝长度显著增加 MAT&#945; 在两种诱导条件下均表现出菌株（Cg慢性疲劳综合征： 22.06 &#181;m &#177; 5.41 &#181;m 与 17.58 &#181;m &#177; 4.12 &#181;m；血清： 23.71 &#181;m &#177; 6.59 &#181;m 与 21.00 &#181;m &#177; 5.29 &#181;m; 图4A）。有趣的是，单倍体背景下菌丝长度的增加也表现为菌丝体积的增加（38.84 &#181;m3 &#177; 19.58 &#181;m3 与 34.25 &#181;m3 &#177; 19.62 &#181;m3仅在响应时 Cg慢性疲劳综合征（CFS）图 4B）。这些初始 体外 测量结果表明，染色体倍性状态与交配型位点构型之间存在复杂的相互作用，提示二者 MATa 和 MAT&#945; 不同位点对菌丝形成动态的贡献可能各不相同。
为了研究这些结构指标在合并数据集中的统计关系，对所有测试的倍性及交配型变异体进行了斯皮尔曼等级相关分析（ρ）和皮尔逊线性回归分析（R2）。在所有分析的配对中均观察到正相关关系：菌丝长度与菌丝体积、菌丝长度与菌丝厚度、菌丝长度与母细胞体积、总菌丝体积与母酵母细胞体积之间的正相关（图5、补充表1和补充表2）。
菌丝长度与计算得到的菌丝体积之间表现出最强的相关性（ρ = 0.91；图 5A）。相反，母体酵母细胞的起始体积与新生菌丝体积之间的相关性最弱（ρ = 0.63；图 5C）。此外，菌丝厚度与菌丝长度的相关性不如菌丝体积与菌丝长度的相关性强（图 5A，D）。母细胞体积、菌丝长度和菌丝厚度在相关性上无统计学显著差异（图 5B，D）。这些几何分布特征表明，较大的初始母体酵母细胞体积未必会导致更长的菌丝或更高的菌丝体积。
综上所述，这些结果表明，膜插件培养板和基于 CFS 的检测方法均能用于在无需任何物理接触的情况下，对 C. albicans 的形态发生变异进行可视化观察和定量分析。本实验方案所产生的数据揭示了不同倍性背景和交配型组合下存在的多种形态学特征。这些非接触式检测系统提供了一种灵活且可扩展的方法，可用于研究多种微生物组合之间的种间信号传导动态。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
图1: 膜插件培养板共培养及基于无细胞上清液的菌丝诱导实验示意图 假丝酵母 物种 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
图2膜插件板与基于CFS的无接触检测方法中观察到的菌丝形态比较 (A代表性明场显微图像，显示细胞形态学反应 C. albicans YPD（对照） C. glabrata 在膜插片培养板装置中，或加入经条件培养基处理的 C. glabrata 无细胞上清液（CFS）。粉色、黑色和白色箭头分别指示酵母形态、假菌丝和真菌丝。比例尺， 10 &#181;m菌丝长度（B），菌丝体积（C）以及菌丝厚度（D) 杂合二倍体 C. albicans 菌株（SC5314）在响应中观察到的 C. glabrata 膜插件培养板中的细胞设置 C. glabrata 慢性疲劳综合征。数据代表中位数 &#177; 95% 置信区间，来自三次独立的生物学实验，n = 50 个细胞。ns，无显著性差异： p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
图3：交配型和杂合性对二倍体 C. albicans 菌丝形态具有显著影响。 图中显示了在指定诱导分子作用下，C. albicans 纯合二倍体之间（A）以及杂合与纯合二倍体之间（B）菌丝长度的比较。同样，在上述诱导分子作用下，纯合二倍体之间（C）以及杂合与纯合二倍体之间（D）菌丝体积的比较也一并展示。对照组：YPD，即非诱导菌丝形成的培养基对照。数据来自三次独立的生物学实验，每组 n = 50 个细胞，表示为中位数 ± 95% 置信区间。图顶部标注的数值为通过 Wilcoxon 秩和检验比较得出的 p 值。**：p &lt; 0.01，***：p &lt; 0.001，****：p &lt; 0.0001，表示统计学显著差异；ns（无显著性）：p &gt; 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
图4单倍体中的菌丝特征 C. albicans 响应不同的分子诱导剂。 图中显示了菌丝长度（A）和菌丝体积（B单倍体中的） C. albicans 菌株在指定诱导剂作用下的反应。对照：YPD，非菌丝诱导培养基对照。数据代表中位数 &#177; 95% 置信区间，来自三次独立的生物学实验，n = 50 个细胞。所示数字表示 p由Wilcoxon秩和检验确定的p值。**： p &#60; 0.01, ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0.0001，具有统计学显著性；ns，无显著性差异： p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
图5：C. albicans 菌丝形态参数与倍性之间的相关性。 图中展示了本研究中所用形态学参数之间的Spearman相关性及线性回归关系，分别为菌丝体积与菌丝长度（A）、细胞体积与菌丝长度（B）、细胞体积与菌丝体积（C），以及菌丝厚度与菌丝长度（D）。ρ：Spearman相关系数；R2：线性回归分析的决定系数；p：p值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>菌株</td>
			<td>物种</td>
			<td>倍性</td>
			<td>基因型</td>
			<td>来源</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBS138</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>单倍体 (1n)</td>
			<td>MATα</td>
			<td>ATCC 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5314</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>二倍体 (2n)</td>
			<td>杂合型 (MATa/α)</td>
			<td>ATCC MYA-2876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1132</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>二倍体 (2n)</td>
			<td>纯合型 (MATa/a)；arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Barrier Activity in Candida albicans Mediates Pheromone Degradation and Promotes Mating. Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007)。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1133</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>二倍体 (2n)</td>
			<td>纯合型 (MATα/α)；arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY896</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>单倍体 (1n)</td>
			<td>纯合型 (MATa)；ura3∆::imm434 his4 gal1∆::ura3∆::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. et al. The ‘obligate diploid’ Candida albicans forms mating-competent haploids. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013)。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY803</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>单倍体 (1n)</td>
			<td>纯合型 (MATα)；his4 ura3Δ::HIS4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：菌株 白色念珠菌 和 白色念珠菌 本研究中使用。 该表格列出了在无接触膜插件培养板共培养及无细胞上清液（CFS）检测中所评估的真菌菌株的名称、明确基因型、倍性状态以及交配型纯合性。
补充表1： 各种统计分析所得到的数据 C. albicans 形态学参数. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充表 2： 本研究中评估的各种 C. albicans 形态学参数的所有生物学重复的原始数值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1： 本研究中所用培养基及其成分列表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>

本文描述了两种无接触共培养方法，用于定性和定量评估真菌在种间相互作用过程中的形态学反应。该实验方案以念珠菌属种间相互作用检测为例，展示了内在因素如何影响菌丝生长。这些方法可轻松适用于研究多种生物之间的微生物种间通讯。

细胞行为和形态通常受到微生物群落中多种细胞内和细胞外因素的影响。不同的研究方法……

我们研究宿主-病原体及真菌种间相互作用中的分子通讯，探讨分泌信号如何调控微生物的形态与行为。现有方法可能繁琐、成本高昂或令人困惑。本方案提供一种简单、灵活且无需接触的检测方法，用于研究新型微生物种间相互作用。该方案支持在多种生物与临床体系中开展种间及跨界相互作用的基础与转化研究。首先将一皿含有 Candida glabrata CBS 138 菌落的葡萄糖最低培养基琼脂平板、一个无菌接种环以及一支含有无菌酵母提取蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基的试管放入生物安全柜中。从平板上挑取一个孤立菌落，接种至 10 毫升 YPD 液体培养基中。于 37 摄氏度、200 转/分钟持续振荡条件下培养 18 小时。取过夜培养物，通过光学显微镜检查酵母形态及是否存在污染。将培养物转移至 15 毫升圆锥形离心管中，在 25 摄氏度下以 5,000 × g 离心 5 分钟。小心弃去上清液，保留菌体沉淀用于膜插片实验。对于目标菌株 Candida albicans，将单个菌落接种至 5 毫升 GMM 液体培养基（二倍体菌株）或 YPD 液体培养基（单倍体菌株）中。将接种后的培养物于 37 摄氏度、200 转/分钟振荡条件下培养 12 小时。测定过夜培养物在 600 纳米处的光密度值。随后，用预热的 GMM 培养基将培养物稀释至终体积 1 毫升，终 OD600 为 0.1。取一个无菌的24孔组织培养板。向选定的每个下层孔（或双室细胞培养板的腹腔室）中加入1毫升浓度为600纳米波长下OD值0.1的白色念珠菌悬液。接着，取出光滑念珠菌菌体沉淀，将其重悬于1毫升GMM液体培养基中，以5,000 × g离心3分钟，弃去上清液，重复洗涤两次。将最终沉淀重悬于新鲜GMM液体培养基中，并将细胞悬液在600纳米波长下的OD值调整至5。然后，使用无菌镊子将带有0.4微米孔径聚碳酸酯膜的无菌膜插件放入每个工作孔中，确保插件牢固固定于孔内，并向每个上层（管腔室）加入750微升制备好的光滑念珠菌悬液。盖好组装完成的培养板，在37摄氏度静置培养3小时。培养结束后，用无菌镊子取出每个上层插件并安全弃去。将24孔板置于配备微分干涉差（DIC）光学系统及10倍、20倍和超长工作距离40倍物镜的倒置显微镜下，进行形态学观察。在完成所需的孵育时间后，使用10倍物镜扫描孔板底部，以验证细胞分布的均匀性，并识别追踪错误或异常聚集现象。使用校准后的20倍物镜至少采集10个独立的视野图像，用于获得核心菌丝计数和群体分布数据集。为进行精细的表型分析及细胞边界测量，使用40倍超长工作距离物镜采集显微图像。随后保存所有原始图像文件。启动最新版本的Fiji软件，依次选择“文件”（File）和“打开”（Open）以载入目标显微图像。为测量菌丝长度，点击“线段选择”图标并选择“分段线”工具。将光标置于菌丝从母体酵母细胞壁延伸出的连接处，沿菌丝的中心纵轴进行追踪，通过添加锚点以跟随曲线和弯曲，直至顶端为止。在Windows系统上使用“Control + M”，或在Mac OS上使用“command + M”运行测量命令，以在结果窗口中记录总长度L（单位为微米）。使用画笔工具标记已测量的细胞，防止重复分析。定位其相连的母体酵母细胞，使用分段线工具沿细胞最长轴方向绘制并测量一条直线，以记录长轴A。然后绘制并测量一条垂直于长轴、跨越最宽横向跨度的直线，以记录短轴B。使用软件内置的长椭球模型，计算母体酵母细胞体积CV（单位为立方微米）。为测量菌丝厚度，使用分段线工具沿垂直于菌丝长度轴的方向，绘制一条从外壁到外壁的直线。在菌丝上等间距选取三个位置测量直径。计算这三个直径的算术平均值，得到平均厚度d，并将其除以2，获得半径r。将未分枝的菌丝视为圆柱体，计算其总菌丝体积HV（单位为立方微米）。针对每个生物学重复样本，计算其细胞测量值的均值或中位数，并使用这些重复样本水平的数值进行后续的统计学比较。在应用参数检验方法之前，需使用 Shapiro-Wilk 或 D'Agostino-Pearson 检验评估生物学重复数据集的正态性。对于两组比较，若数据服从正态分布，则采用非配对双尾学生 t 检验。完成统计分析并绘制图形后，应在所有图示中统一使用一致的统计学标注方式。在两种无接触实验体系中，白色念珠菌细胞均形成了真正的菌丝，无论其暴露于膜分隔的格列贝尔念珠菌细胞，还是经过滤的格列贝尔念珠菌无细胞上清液。相比之下，对照组细胞主要保持酵母形态和假菌丝形态。膜分隔共培养与过滤上清液检测之间未观察到显著差异，两者产生的菌丝长度、菌丝体积和厚度均相当。该方案使研究人员能够通过测量微生物群落内物种间信号传导所引发的形态学响应，来探究多物种共存现象。其中的关键挑战在于确保分子能够通过膜进行交换，这可以通过培养板振荡以及维持足够的静水压力来解决。对细胞器动态的活细胞成像可揭示分子通讯如何从机制上塑造物种间的相互作用。

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