ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢张强峰（清华大学）和楚辞（霍华德·张实验室）在原始 ChIRP 方案方面提供的有益讨论。K.Z. 受到国家自然科学基金（32170858）和上海市东方学者计划优秀学术带头人项目（BJKJ2025057）的支持。L.Y. 受到国家自然科学基金（82571836、32070843 和 82371617）的支持。

所有溶液均使用无核酸酶、无蛋白酶的超纯水和试剂配制。所有试剂和设备均列于材料表中。
所有动物实验均经南京医科大学动物伦理委员会批准（批准号：IACUC-1812003-4），并依照 实验动物护理和使用的指南 （美国国家研究委员会，第8版）。将4周龄雄性C57BL/6小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由摄食和饮水。遵循经批准的机构实验方案，采用二氧化碳吸入法实施安乐死后行颈椎脱位，尽量减少动物痛苦，并使用达到统计学显著性所需的最少动物数量。&#160;
1. 准备缓冲液
<ol>
	<li>制备细胞裂解缓冲液
	<ol>
		<li>制备含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)、10 mM EDTA 和 1% SDS 的细胞裂解缓冲液。</li>
		<li>使用前立即加入 1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物和特异性 RNase 抑制剂。 
		注意：SDS 对皮肤和眼睛具有刺激性，避免吸入其粉尘或气溶胶。PMSF 高度有毒，为胆碱酯酶抑制剂，在水溶液中不稳定，需在使用前新鲜配制。操作这些试剂时应佩戴手套和护目镜，并在通风橱中操作 PMSF。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备杂交缓冲液
	<ol>
		<li>制备含有 750 mM NaCl、1% SDS、50 mM Tris-HCl (pH 7.0)、1 mM EDTA 和 15% 甲酰胺的杂交缓冲液。</li>
		<li>使用前立即加入 1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物和特异性 RNase 抑制剂。 
		注意：&#160;甲酰胺应于 4 °C 避光保存。 
		注意：甲酰胺为致畸剂，具有生殖毒性。操作甲酰胺时应在通风橱中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜，避免吸入和皮肤接触。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备洗涤缓冲液
	<ol>
		<li>制备含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)、1 M NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40、0.1% SDS 和 0.5% 脱氧胆酸钠的洗涤缓冲液。</li>
		<li>储存期间应避免光照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备蛋白酶 K (PK) 缓冲液
	<ol>
		<li>制备含有 100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.0)、1 mM EDTA 和 0.5% SDS 的 PK 缓冲液。</li>
		<li>使用前立即加入蛋白酶 K，使其终浓度为 5%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 设计并制备探针
<ol>
	<li>设计反义探针
	<ol>
		<li>使用 singlemoleculefish.com 提供的在线探针设计工具设计反义寡核苷酸探针18。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取生物素标记的探针
	<ol>
		<li>订购带有 3'-BiotinTEG 修饰的反义 DNA 探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备探针混合液
	<ol>
		<li>将每种探针单独稀释至 100 µM。</li>
		<li>取等体积的所有探针混合，制备探针混合液。保持最终寡核苷酸总浓度为 100 µM。</li>
		<li>将探针混合液储存于 -20 °C。 
		注意：推荐的探针设计参数如下：(i) 每 100 bp 目标 RNA 设计一个探针，(ii) 目标 GC 含量为 45%，(iii) 探针长度为 20 nt，(iv) 探针间间隔为 60–80 nt。 
		注意：若 RNA 长度超过探针设计工具允许的上限，应在设计前将序列分割为较小片段。排除重复区域以及具有广泛序列同源性的区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 进行细胞收获、组织解离和紫外交联
<ol>
	<li>准备无紫外照射对照
	<ol>
		<li>与实验样本平行制备对照样本。</li>
		<li>对照样本省略紫外交联步骤。</li>
		<li>对两组样本进行相同的所有后续操作，包括超声处理、RNA-蛋白质下拉、RNA提取和蛋白质提取。 
		注意：使用无紫外照射对照以区分依赖紫外照射的RNA-蛋白质相互作用与非特异性背景结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集细胞并进行紫外交联
	<ol>
		<li>洗涤培养细胞
		<ol>
			<li>用PBS洗涤细胞三次，以去除残留的培养基。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>交联细胞
		<ol>
			<li>将3 mL PBS均匀铺加到15 cm培养皿上。</li>
			<li>在254 nm紫外交联仪中以4000 mJ/cm2剂量照射细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>收集交联后的细胞
		<ol>
			<li>交联后用PBS收集细胞。</li>
			<li>离心悬浮液并弃去上清液。</li>
			<li>称量沉淀物，确认每个样本的沉淀质量至少为500 mg。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解离睾丸组织并进行紫外交联
	<ol>
		<li>准备睾丸
		<ol>
			<li>剥离睾丸包膜。</li>
			<li>用DMEM洗涤组织两次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行胶原酶消化
		<ol>
			<li>将组织在含有1 mg/mL IV型胶原酶的DMEM中于37 °C孵育5–15分钟。</li>
			<li>继续消化直至曲细精管释放。 
			注意：消化时间不得超过15分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>洗涤曲细精管
		<ol>
			<li>在4 °C下以1000 × g离心悬浮液1分钟。</li>
			<li>移除上清液。</li>
			<li>用5–10 mL DMEM洗涤沉淀。</li>
			<li>在相同条件下再次离心。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行胰蛋白酶消化
		<ol>
			<li>将沉淀重悬于含1 mg/mL DNase I的0.25%胰蛋白酶溶液中。</li>
			<li>在37 °C孵育5–15分钟。 
			注意：消化时间不得超过15分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>终止酶消化反应
		<ol>
			<li>加入等体积的含10% FBS的DMEM。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备单细胞悬液
		<ol>
			<li>将悬液通过70 µm细胞筛过滤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>洗涤细胞
		<ol>
			<li>在4 °C下以2000 × g离心细胞5分钟。</li>
			<li>弃去上清液。</li>
			<li>用5–10 mL PBS洗涤沉淀。</li>
			<li>在相同条件下再次离心。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对睾丸细胞进行紫外交联
		<ol>
			<li>将单细胞悬液重悬于PBS中。</li>
			<li>将悬液均匀铺加到15 cm培养皿上。</li>
			<li>在254 nm紫外交联仪中以4000 mJ/cm2剂量照射细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>收集交联后的细胞
		<ol>
			<li>对于无紫外照射对照，省略照射步骤。</li>
			<li>用PBS收集细胞。</li>
			<li>离心悬浮液并弃去上清液。</li>
			<li>称量沉淀物，确认每个样本的沉淀质量至少为500 mg。 
			注意：获得约500 mg细胞沉淀所需的实验小鼠数量取决于小鼠年龄和组织产量。本研究中使用了约10–12只四周龄小鼠。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 进行超声处理
<ol>
	<li>制备裂解液
	<ol>
		<li>按照每100 mg细胞沉淀加入1 mL裂解缓冲液的比例，将细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中。</li>
		<li>充分混匀，获得均一的悬浮液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声处理样品
	<ol>
		<li>使用水浴超声仪或聚焦超声仪对裂解液进行超声处理。</li>
		<li>持续超声处理直至裂解液在视觉上变得澄清。 
		注意：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化情况。继续超声处理，直至大部分DNA片段大小在1 kb至2 kb之间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 进行 RNA-蛋白质下拉实验
<ol>
	<li>收集输入样品
	<ol>
		<li>取出部分裂解液作为输入对照。</li>
		<li>保留约 10 µL 用于 RNA 分析，另取 10 µL 用于蛋白质分析。</li>
		<li>在杂交和洗涤过程中，将输入样品维持在 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预清除裂解液
	<ol>
		<li>向每个样品中加入 30 µL 预先洗涤的磁珠。</li>
		<li>在杂交炉中于 37 °C 轻柔混匀孵育 30 分钟。 
		注意：使用前需洗涤磁珠。将磁珠分装后置于磁力架上 1 分钟或直至溶液澄清，彻底移除保存液。用 500 µL 细胞裂解缓冲液洗涤磁珠两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除预清除磁珠
	<ol>
		<li>将样品置于磁力架上。</li>
		<li>将上清液转移至新管中。</li>
		<li>重复转移一次，以确保完全去除残留磁珠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交探针
	<ol>
		<li>向每个样品中加入两倍体积的杂交缓冲液。</li>
		<li>按每 1 mL 裂解液加入 1 µL 100 µM 探针原液的比例加入&#160;探针（补充表 1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育杂交反应
	<ol>
		<li>在杂交炉中于 37 °C 以翻转混匀方式孵育 12–16 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备捕获磁珠
	<ol>
		<li>在杂交结束前立即用细胞裂解缓冲液洗涤 100 µL 磁珠三次。</li>
		<li>最后一次洗涤后彻底去除残余缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>捕获探针结合的复合物
	<ol>
		<li>短暂离心杂交反应液。</li>
		<li>将洗涤后的磁珠重悬于 1 mL 杂交后的样品中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使复合物结合到磁珠
	<ol>
		<li>将磁珠悬液转移回原管。</li>
		<li>在 37 °C 混匀孵育 30–40 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收磁珠
	<ol>
		<li>短暂离心样品。</li>
		<li>将管子置于磁力架上 1–2 分钟或直至溶液澄清。</li>
		<li>弃去上清液。</li>
		<li>用移液器吸头去除残余液体。 
		注意：去除液体时避免扰动磁珠沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤捕获的复合物
	<ol>
		<li>加入 1 mL 洗涤缓冲液。</li>
		<li>在 37 °C 持续混匀洗涤 5 分钟。</li>
		<li>重复洗涤步骤五次。 
		注意：洗涤缓冲液含有 1 M NaCl，可破坏非共价的蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA 相互作用，同时保留共价的紫外线诱导交联。这些严格条件可去除间接相互作用分子和非特异性背景，从而富集直接的蛋白质互作伙伴19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保留材料用于 RNA 分析
	<ol>
		<li>将洗涤后磁珠的 1%–10% 转移至新管中用于 RNA 分析。</li>
		<li>立即使用剩余磁珠进行蛋白质提取，或将其储存于 -80 °C。 
		注意：如需暂停实验，可将磁珠样品储存于 -80 °C，待后续进行蛋白质提取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗脱蛋白质
	<ol>
		<li>向磁珠中加入 SDS 样品缓冲液。</li>
		<li>在 95 °C 煮沸 30 分钟以洗脱蛋白质并逆转交联。</li>
		<li>进行质谱分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 提取 RNA
<ol>
	<li>消化蛋白质
	<ol>
		<li>用 100 µL PK 缓冲液重悬磁珠结合的 RNA 样品。</li>
		<li>使用 PK 缓冲液将 RNA 上样样品调整至终体积为 100 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与蛋白酶 K 孵育
	<ol>
		<li>在 50 °C 下孵育样品 45 分钟，并持续混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灭活蛋白酶 K
	<ol>
		<li>在 95 °C 下加热样品 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 TRIzol 试剂
	<ol>
		<li>向每个样品中加入 500 µL TRIzol 试剂。</li>
		<li>充分涡旋振荡。</li>
		<li>在室温下孵育 5 分钟。 
		注意：TRIzol 试剂含有苯酚和硫氰酸胍。操作时应在化学通风橱中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜。避免吸入和皮肤接触。若发生皮肤接触，应立即用肥皂和水清洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行相分离
	<ol>
		<li>向每个样品中加入 100 µL 氯仿。</li>
		<li>充分涡旋振荡。</li>
		<li>在室温下孵育 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收水相
	<ol>
		<li>在 4 °C 下离心样品 15 分钟。</li>
		<li>将上层水相转移至新管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 RNA 结合至纯化柱
	<ol>
		<li>向水相中加入等体积的 100% 乙醇。</li>
		<li>充分混匀。</li>
		<li>将样品上样至 RNA 纯化柱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化 RNA
	<ol>
		<li>根据制造商说明书进行 RNA 清洁步骤。</li>
		<li>用 30 µL 无核酸酶水洗脱 RNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 qRT-PCR 验证 RNA 富集
	<ol>
		<li>每反应使用 1 µL 洗脱的 RNA 进行定量反转录 PCR（qRT-PCR）。</li>
		<li>评估目标 RNA 相对于对照组的富集程度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析
<ol>
	<li>通过 SDS-PAGE 分离蛋白质
	<ol>
		<li>将 步骤 5.12 中获得的蛋白质与 4× LDS 上样缓冲液混合。</li>
		<li>在 4%–12% Bis-Tris 凝胶上分离蛋白质。</li>
		<li>使用银染试剂盒对凝胶进行染色。</li>
		<li>将整个蛋白质条带作为一个单一的条带切下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切取凝胶小块
	<ol>
		<li>使用洁净的手术刀切下蛋白质条带。</li>
		<li>尽量减少多余的凝胶量。</li>
		<li>将凝胶切成约 1 mm3 的小块。</li>
		<li>将凝胶小块转移至 0.5 mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱色凝胶小块
	<ol>
		<li>加入 100 µL 脱色液。</li>
		<li>涡旋振荡 10 分钟。</li>
		<li>在 14,000 × g 条件下离心 1 分钟。</li>
		<li>移除上清液。</li>
		<li>重复脱色步骤，直至凝胶小块变得透明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>还原蛋白质
	<ol>
		<li>加入 100 µL 还原液。</li>
		<li>在 56 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>将样品冷却至室温。</li>
		<li>短暂离心并移除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>烷基化蛋白质
	<ol>
		<li>加入 100 µL 烷基化液。</li>
		<li>在避光条件下于室温孵育 20 分钟。</li>
		<li>移除上清液。</li>
		<li>用 100 µL 消化缓冲液洗涤凝胶小块 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化蛋白质
	<ol>
		<li>加入足量的胰蛋白酶溶液，完全覆盖凝胶小块。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育 16–18 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取肽段
	<ol>
		<li>加入 30 µL 提取液。</li>
		<li>超声处理 15 分钟或涡旋振荡 30 分钟。</li>
		<li>在 14,000 × g 条件下离心 1 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新的离心管中。</li>
		<li>重复提取步骤两次。</li>
		<li>合并所有提取液。</li>
		<li>在真空浓缩仪中干燥合并的提取液，约 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 StageTip 纯化肽段
	<ol>
		<li>将干燥的肽段重悬于 20 µL 0.1% 甲酸（FA）中。</li>
		<li>将样品加载至 C18 StageTip 上。</li>
		<li>在 1,000 × g 条件下离心 2 分钟。</li>
		<li>用 20 µL 0.1% 甲酸洗涤 StageTip。</li>
		<li>用 20 µL 60% 乙腈/0.1% 甲酸洗脱肽段至 LC-MS 样品瓶中。</li>
		<li>干燥洗脱液。</li>
		<li>将肽段重悬于 10 µL 0.1% 甲酸中。 
		注意：如有需要，可在此暂停实验流程。在进行 LC-MS/MS 分析前，将纯化的肽段储存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取 LC-MS/MS 数据
	<ol>
		<li>将肽段重悬于 0.1% 甲酸中。</li>
		<li>在 75 µm × 250 mm C18 分析柱上，以 300 nL/min 的流速分离肽段。</li>
		<li>采用以下溶剂 B 梯度（乙腈中含 0.1% 甲酸）： 
		0–40 分钟：2%–25% B 
		40–48 分钟：25%–40% B 
		50–57 分钟：40%–99% B 
		保持 99% B 3 分钟</li>
		<li>将质谱仪设置为数据依赖性采集模式。</li>
		<li>在 m/z 350–1200 范围内采集全扫描 MS 谱图，分辨率为 70,000。</li>
		<li>以 17,500 分辨率连续采集 15 次高能碰撞解离（HCD）MS/MS 谱图。</li>
		<li>每次扫描记录一个微扫描。</li>
		<li>设定动态排除时间为 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理质谱数据
	<ol>
		<li>使用 MaxQuant（v2.1.0.0）处理原始数据。</li>
		<li>在从 UniProt 下载的小鼠蛋白质序列数据库中进行谱图搜索。</li>
		<li>指定胰蛋白酶为消化酶。</li>
		<li>允许最多两个漏切位点。</li>
		<li>设定甲硫氨酸氧化为可变修饰。</li>
		<li>设定半胱氨酸的羧甲基化为固定修饰。</li>
		<li>设定前体离子和碎片离子的质量容差分别为 15 ppm 和 20 ppm。</li>
		<li>在肽段和蛋白质水平上均将错误发现率控制在 1%。</li>
		<li>采用基于 iBAQ 的非标记定量方法估计蛋白质丰度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 进行基因本体富集分析
<ol>
	<li>分析功能富集
	<ol>
		<li>使用 clusterProfiler R 软件包（v4.6.0）进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析。</li>
		<li>以 GO 数据库（v2024-09-20）作为参考注释来源。</li>
		<li>采用 Benjamini-Hochberg 方法对多重检验进行校正。</li>
		<li>将统计学显著性定义为经校正的 P 值（FDR）&#60; 0.05。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 进行 eCLIP-seq 验证
<ol>
	<li>制备eCLIP样品
	<ol>
		<li>按照先前所述方法进行增强型交联免疫沉淀（eCLIP）17。</li>
		<li>制备经紫外交联的细胞样品，用于PABPC1和CCT3的免疫沉淀。</li>
		<li>使用eCLIP裂解缓冲液裂解样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫沉淀RNA-蛋白质复合物
	<ol>
		<li>向每个样品中加入10 µg抗体。</li>
		<li>在磁珠上捕获RNA-蛋白质复合物。</li>
		<li>在免疫沉淀前收集输入样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备RNA文库
	<ol>
		<li>去磷酸化与蛋白质结合的RNA。</li>
		<li>将3' RNA接头连接至回收的RNA。</li>
		<li>在严格条件下洗涤免疫沉淀样品和输入样品。</li>
		<li>通过煮沸磁珠洗脱复合物。</li>
		<li>在4%–12% Bis-Tris梯度凝胶上分离样品。</li>
		<li>将分离的复合物转移至硝酸纤维素膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收RNA
	<ol>
		<li>切下大小匹配的膜区域。</li>
		<li>使用尿素和蛋白酶K消化蛋白质。</li>
		<li>从膜上回收RNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建测序文库
	<ol>
		<li>将回收的RNA逆转录为cDNA。</li>
		<li>使用外切酶I和虾碱性磷酸酶混合物纯化cDNA。</li>
		<li>使用T4 RNA连接酶将DNA接头连接至cDNA的3'端。</li>
		<li>使用高保真DNA聚合酶扩增文库。</li>
		<li>在3%低熔点琼脂糖凝胶上分离扩增后的文库。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒纯化经大小筛选的文库。</li>
		<li>在Illumina平台上对文库进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析eCLIP-seq数据
	<ol>
		<li>使用ENCODE eCLIP分析流程分析测序数据20。</li>
		<li>使用cutadapt（v1.14）去除接头序列和3'接头二聚体。</li>
		<li>使用STAR（v2.7.6a）将reads比对至UCSC重复元件。</li>
		<li>去除比对到重复元件的reads。</li>
		<li>将剩余reads比对至mm10参考基因组（GENCODE vM23）。</li>
		<li>去除PCR重复序列。</li>
		<li>使用CLIPPER鉴定富集的结合位点。</li>
		<li>将富集倍数≥8且调整后P值≤0.001的峰定义为显著峰。</li>
		<li>使用不可重复发现率（IDR）阈值为0.01的标准鉴定可重复峰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mattick JS, et al. Long non-coding RNAs: definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(6):430-447.</li>
	<li>Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: past, present, and future. Cell. 2024;187(23):6451-6485.</li>
	<li>Ferr&#232; F, Colantoni A, Helmer-Citterich M. Revealing protein-lncRNA interaction. Brief Bioinform. 2016;17(1):106-116.</li>
	<li>Yi W, Yan J. Decoding RNA-protein interactions: Methodological advances and emerging challenges. Adv Genet (Hoboken). 2025;6(2):2500011.</li>
	<li>Elguindy MM, Mendell JT. NORAD-induced PUMILIO phase separation is required for genome stability. Nature. 2021;595(7866):303-308.</li>
	<li>Gr&#228;we C, Stelloo S, Van Hout FAH, Vermeulen M. RNA-centric methods: Toward the interactome of specific RNA transcripts. Trends Biotechnol. 2021;39(9):890-900.</li>
	<li>Chu C, Chang HY. ChIRP-MS: RNA-directed proteomic discovery. Methods Mol Biol. 2018;1861:37-45.</li>
	<li>Chu C, et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 2015;161(2):404-416.</li>
	<li>Suryo Rahmanto A, et al. K6-linked ubiquitylation marks formaldehyde-induced RNA-protein crosslinks for resolution. Mol Cell. 2023;83(23):4272-4289.e10.</li>
	<li>Sun W, et al. Genetically encoded chemical crosslinking of RNA in vivo. Nat Chem. 2023;15(1):21-32.</li>
	<li>Esteban-Serna S, McCaughan H, Granneman S. Advantages and limitations of UV cross-linking analysis of protein-RNA interactomes in microbes. Mol Microbiol. 2023;120(4):477-489.</li>
	<li>Welp LM, et al. Chemical crosslinking extends and complements UV crosslinking in analysis of RNA/DNA nucleic acid-protein interaction sites by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 2025;53(15).</li>
	<li>McHugh CA, Guttman M. RAP-MS: A method to identify proteins that interact directly with a specific RNA molecule in cells. Methods Mol Biol. 2018;1649:473-488.</li>
	<li>Lewandowski JP, et al. The Tug1 lncRNA locus is essential for male fertility. Genome Biol. 2020;21(1):237.</li>
	<li>Wang S, et al. LncRNA Tug1 maintains blood-testis barrier integrity by modulating ccl2 expression in high-fat diet mice. Cell Mol Life Sci. 2022;79(2):114.</li>
	<li>Li Y, et al. The landscape of RNA binding proteins in mammalian spermatogenesis. Science. 2024;386(6720).</li>
	<li>Xu Q, et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. J Vis Exp. 2019;(147):59681.&#160;</li>
	<li>Raj A, Van Den Bogaard P, Rifkin SA, Van Oudenaarden A, Tyagi S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 2008;5(10):877-879.</li>
	<li>Urdaneta EC, et al. Purification of cross-linked RNA-protein complexes by phenol-toluol extraction. Nat Commun. 2019;10(1):990.</li>
	<li>Van Nostrand EL, et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nat Methods. 2016;13(6):508-514.</li>
	<li>Van Nostrand EL, et al. A large-scale binding and functional map of human RNA-binding proteins. Nature. 2020;583(7818):711-719.</li>
	<li>Dun MD, Aitken RJ, Nixon B. The role of molecular chaperones in spermatogenesis and the post-testicular maturation of mammalian spermatozoa. Hum Reprod Update. 2012;18(4):420-435.</li>
	<li>Urdaneta EC, Beckmann BM. Fast and unbiased purification of RNA-protein complexes after UV cross-linking. Methods. 2020;178:72-82.</li>
	<li>Greenberg JR. Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins. Nucleic Acids Res. 1979;6(2):715-732.</li>
	<li>Rinn JL, et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 2007;129(7):1311-1323.</li>
	<li>Clemson CM, et al. An architectural role for a nuclear noncoding RNA: NEAT1 RNA is essential for the structure of paraspeckles. Mol Cell. 2009;33(6):717-726.</li>
	<li>Chen H, et al. Dissecting mammalian spermatogenesis using spatial transcriptomics. Cell Rep. 2021;37(5):109915.</li>
	<li>Hafner M, et al. CLIP and complementary methods. Nat Rev Methods Primers. 2021;1(1):20.</li>
	<li>Ramanathan M, Porter DF, Khavari PA. Methods to study RNA-protein interactions. Nat Methods. 2019;16(3):225-234.</li>
</ol>

所有作者均声明不存在竞争性财务利益。

cPDiRT 是一种基于 ChIRP 的改进型实验方案，通过使用紫外（UV）交联替代甲醛（PFA）交联，以特异性捕获长链非编码 RNA（lncRNA）与蛋白质之间的直接相互作用。通过将新鲜睾丸组织经酶解离为单细胞后进行紫外交联，该方法将直接相互作用的图谱分析从培养的细胞系拓展至天然组织。在培养细胞中进行的平行实验实现了基于 PFA 与基于 UV 方法的并行比较，且由 UV 获得的相互作用通过 eCLIP-seq 技术得到了独立验证。结果表明，在组织来源样本的 ChIRP 工作流程中，紫外交联可成功整合并保持高特异性。
由于存在组织渗透困难、分子间交联假象以及间接相互作用导致的背景信号升高等问题，很少有研究将基于PFA的RNA中心方法（如ChIRP）应用于组织样本。这些局限性限制了基于组织的lncRNA相互作用组作图的广泛应用，也促使了cPDiRT的开发，作为适用于组织水平研究的更特异的替代方法。
cPDiRT 的一个关键特征是能够在接近生理条件下区分直接相互作用与间接相互作用。传统的基于 PFA 的方法会稳定大型大分子复合物，...

近期的高通量转录组学研究已发现数千种长链非编码RNA（lncRNA），这些RNA参与了从染色质组织到细胞信号传导等多种生物学过程1,2。尽管lncRNA广泛表达且具有重要功能，但大多数lncRNA的分子作用机制仍不清楚。其中一个主要障碍是难以鉴定其直接相互作用的蛋白质伙伴，特别是RNA结合蛋白（RBPs）3,4,5。
目前以RNA为中心的方法主要依赖化学交联技术，该技术可捕获直接和间接的RNA-蛋白质相互作用。因此，这类方法更适合于全局相互作用组的绘制，而非真实直接接触的鉴定6。染色质分离及质谱分析（ChIRP-MS）是一种广泛用于绘制长链非编码RNA与RNA结合蛋白（lncRNA-RBP）相互作用的技术，因其探针设计简单且实验流程高效而被广泛应用7,8。传统的ChIRP-MS采用多聚甲醛（PFA）交联，该方法可捕获直接的RNA-蛋白质接触，以及由中介因子介导的间接关联9,10。
相比之下，254 nm 的紫外交联具有关键优势。它仅在 RNA 与蛋白质处于近乎零距离接触时（通常&#60;1 Å）才能共价连接二者11。该过程将氢键转化为稳定的共价键，并允许使用高盐强度的严格洗脱条件，从而去除非共价结合的间接相互作用分子。因此，基于紫外的方法在检测直接的 RNA-蛋白质相互作用方面比化学交联方法具有更高的特异性12,13。然而，基于紫外的方法在组织来源的长链非编码 RNA 相互作用组研究中仍应用不足，主要原因是人们对交联效率以及紫外光穿透能力有限的担忧。
为了在生理相关背景下研究长链非编码RNA（lncRNA）与蛋白质的直接相互作用，本研究选择lncRNA Tug1 作为模型系统。Tug1 因其显著的基因敲除表型以及在睾丸中的高度富集，是验证适用于组织样本的直接相互作用研究流程的理想基准。Tug1 基因的遗传缺失会导致完全的雄性不育、生精功能受损以及精子形态异常14。此外，Tug1 在高脂饮食小鼠中支持支持细胞（Sertoli细胞）功能和血睾屏障的完整性15。尽管这些表型已被充分证实，但在睾丸这一表达大量RNA结合蛋白（RBP）且这些蛋白近期已被实验性图谱化16的器官中，介导Tug1 功能的直接蛋白质互作伙伴仍不清楚。这一知识空白在很大程度上反映出，目前大多数lncRNA-蛋白质相互作用的检测方法均是为培养细胞体系所开发的。
为解决这一局限性，对 ChIRP 技术框架进行了改进，用紫外线交联替代 PFA 交联，以捕获直接与 Tug1 相互作用的蛋白质。候选相互作用通过增强型交联免疫沉淀联合深度测序（eCLIP-seq）进行独立验证17。该工作流程进一步拓展至组织应用，即在紫外线交联前将新鲜的小鼠睾丸组织解离为单细胞。这一优化后的方法被命名为 cPDiRT（捕获直接与 RNA 靶标相互作用的蛋白质）。
在小鼠睾丸中应用cPDiRT技术对Tug1实现了在天然组织环境下的直接相互作用图谱绘制。在培养细胞中进行的平行实验提供了基于PFA和基于UV的相互作用谱的并行比较。结合独立的eCLIP验证，该方法获得了一组高可信度的分子互作伙伴，可能参与Tug1在精子发生过程中的功能。本文所述方案能够在培养细胞和天然组织中捕获与目标长链非编码RNA直接相互作用的蛋白质。通过界定Tug1在睾丸中的直接互作组，该方法推动了对一种对生育力至关重要的长链非编码RNA的机制研究，并为在生殖组织及其他复杂组织中研究长链非编码RNA-蛋白质相互作用提供了可推广的技术平台。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>用于组织解离和单细胞悬液制备</td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>用于RNA纯化</td></tr><tr><td>亲和素反转录酶（AffinityScript Reverse Transcriptase）</td><td>Agilent</td><td>600107</td><td>用于eCLIP cDNA合成</td></tr><tr><td>抗CCT3抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab225878</td><td>eCLIP实验用抗体</td></tr><tr><td>抗PABPC1抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab312314</td><td>eCLIP实验用抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>用于RNA提取</td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>用于睾丸组织的酶解解离</td></tr><tr><td>去磷酸化试剂（T4 PNK）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td>用于eCLIP RNA去磷酸化</td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>用于细胞培养和组织解离缓冲液</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>用于捕获生物素化探针-RNA-蛋白质复合物</td></tr><tr><td>DynaMag-15磁力架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12301D</td><td>用于磁珠分离</td></tr><tr><td>DynaMag-2磁力架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>用于磁珠分离</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>用于裂解缓冲液和洗涤缓冲液中螯合二价阳离子</td></tr><tr><td>外切核酸酶I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td>用于eCLIP cDNA纯化</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>用于终止胰蛋白酶消化</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9342</td><td>用于杂交缓冲液配制</td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>TUOHE</td><td>LF-I</td><td>用于探针杂交和磁珠洗涤</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>用于eCLIP文库片段大小选择</td></tr><tr><td>MinElute凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>用于eCLIP文库片段大小选择</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>用于RNA纯化</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>用于配制高盐洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>GE Healthcare / Amersham</td><td>10600002</td><td>用于eCLIP Western印迹转膜</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85125</td><td>用作洗涤缓冲液中的去垢剂</td></tr><tr><td>无核酸酶和无蛋白酶水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td>用于配制无核酸酶溶液</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td>用于eCLIP片段大小选择</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris预制胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td>用于SDS-PAGE蛋白质分离</td></tr><tr><td>PBS（pH 7.4）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>用于细胞洗涤和重悬</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>细胞裂解缓冲液中的丝氨酸蛋白酶抑制剂；使用前新鲜添加</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>广谱蛋白酶抑制剂，用于细胞裂解缓冲液；使用前新鲜添加</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850</td><td>用于RNA提取过程中的蛋白质消化</td></tr><tr><td>qRT-PCR预混液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11704044</td><td>用于定量RT-PCR以确认RNA富集</td></tr><tr><td>无RNase/无蛋白酶的DNase I溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td>用于组织解离</td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>用于RNA纯化</td></tr><tr><td>SDS-PAGE上样缓冲液</td><td>Beyotime</td><td>P0286</td><td>用于蛋白质样品制备</td></tr><tr><td>虾碱性磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>用于eCLIP cDNA纯化</td></tr><tr><td>银染试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>P00175</td><td>用于SDS-PAGE凝胶中蛋白质的可视化</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>用作洗涤缓冲液中的去垢剂</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>用于细胞裂解和蛋白质变性</td></tr><tr><td>Superase-in RNase抑制剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td>特异性RNase抑制剂；使用前新鲜添加</td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td>用于eCLIP接头连接</td></tr><tr><td>Tris&amp;ndash;HCl（pH 7.0）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>用于配制裂解、杂交和洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026CN</td><td>用于RNA提取</td></tr><tr><td>超声波细胞破碎仪</td><td>ATPIO</td><td>ATPIO-650D</td><td>用于细胞裂解和DNA片段化</td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP CL-1000</td><td>用于RNA-蛋白质相互作用的紫外交联</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>用于膜上eCLIP蛋白质的降解</td></tr></tbody></table>

一种基于紫外光的 chirp 方法用于可验证地鉴定与长链非编码 rna 直接相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

A UV-Based ChIRP Method For The Verifiable Identification of Proteins That Directly Interact With LncRNA: From Cultured Cells To Mouse Testis

长链非编码RNA（lncRNA）已被证实是调控多种生物学过程的重要分子。然而，大多数lncRNA功能的分子机制仍不清楚。鉴定与其相互作用的蛋白质，特别是RNA结合蛋白（RBPs），是阐明lncRNA功能的关键策略。在现有的多种方法中，结合质谱分析的RNA结合蛋白全面鉴定技术（ChIRP）因其探针设计简单、实验流程清晰而被广泛应用。传统的ChIRP依赖于多聚甲醛（PFA）交联，这种方法既能捕获RNA与蛋白质之间的直接相互作用，也能保留由中介因子介导的间接相互作用。相比之下，紫外光（UV）交联结合严格的洗涤条件更倾向于保留RNA与蛋白质之间的直接相互作用。本研究以lncRNA Tug1 为模型，在培养细胞中比较了ChIRP体系下UV交联与PFA交联的效果，结果表明基于UV的ChIRP能更有效地富集直接的lncRNA-蛋白质相互作用。随后，该基于UV的实验流程被拓展至小鼠睾丸组织，通过在UV交联前将组织解离为单细胞悬液，实现了在天然组织环境中鉴定 Tug1 结合蛋白的目标。与细胞系来源的相互作用组比较发现，既有共有的相互作用蛋白，也存在组织特异性的结合蛋白。其中两个共有的直接相互作用通过增强型交联免疫沉淀（eCLIP）得到了独立验证。这种基于UV的ChIRP方法被命名为cPDiRT（capturing proteins directly interacting with an RNA target，即捕获与RNA靶标直接相互作用的蛋白质）。综上所述，cPDiRT能够在培养细胞和天然组织中实现lncRNA结合蛋白的鉴定。组织解离与UV交联的结合为在多种器官系统中研究直接的lncRNA-蛋白质相互作用提供了一种广泛适用的策略。

为了鉴定与 Tug1 结合的蛋白质，在 ChIRP 实验流程中引入了紫外交联步骤，建立了一种名为 cPDiRT 的新方法（图 1）。首先在 GC2 细胞中进行常规 ChIRP 实验，以富集与 Tug1 相互作用的蛋白质（图 2A、B）。质谱分析结果显示，相较于阴性对照，有超过 190 种蛋白质显著富集（图 2C；补充表 2）。相比之下，在优化的紫外剂量（4000 mJ/cm2）下进行的 cPDiRT-MS 鉴定出一组更具选择性的蛋白质（图 2C；补充表 2），其中超过三分之二的蛋白质与常规 ChIRP-MS 检测到的结果重叠（图 2C）。例如，在初步优化实验中，若紫外交联不足，则会导致...

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于鉴定长链非编码 RNA 与蛋白质的直接相互作用。

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于可验证地鉴定与长链非编码 RNA 直接相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

长链非编码RNA（lncRNAs）已被发现是多种生物过程的重要调控因子。然而，其发挥功能的分子机制尚不明确……

本研究开发了cPDiRT方法，这是一种紫外线交联技术，可直接在培养细胞和睾丸等原代组织中绘制RNA与蛋白质的相互作用图谱，从而解析TUG1在精子发生过程中的分子机制。该方案能够直接对RNA-蛋白质相互作用进行定位，适用于从培养细胞到完整原代组织的多种体系。首先，用PBS洗涤GC2细胞三次，以去除残留的培养基。然后，向培养皿中加入三毫升 PBS，均匀分布后进行交联。在254纳米的紫外交联仪中以4,000毫焦每平方厘米的剂量照射细胞。用PBS收集细胞，并将细胞悬液在4摄氏度下以3000G离心5分钟。弃去上清液后，称量沉淀物，并确认每个样品的沉淀物质量至少为500毫克。采集四周龄雄性C57BL6小鼠的睾丸组织。用5至10毫升DMEM将去囊睾丸组织清洗两次。然后，将100毫克组织与10毫升含有1毫克/毫升胶原酶IV的DMEM在37摄氏度下孵育。持续消化5至15分钟，直至曲细精管释放。随后，在4摄氏度下以1000×g离心1分钟，并弃去上清液。用5至10毫升DMEM洗涤沉淀。在4°C下以1000G再次离心悬浮液1分钟。将沉淀重悬于含有1毫克/毫升脱氧核糖核酸酶I的0.25%胰蛋白酶溶液中。在37°C孵育悬浮液5至15分钟。然后，加入等体积的含10%胎牛血清（FBS）的DMEM以终止酶消化反应。将细胞悬液通过70微米细胞筛网过滤。在4摄氏度下以2000×g离心5分钟。弃去上清液，用 5 至 10 毫升 PBS 洗涤沉淀。将悬液在 4°C 条件下以 2000×g 离心 5 分钟。将单细胞悬液重悬于 PBS 中，并均匀分装至直径 15 厘米的培养皿中。按照之前对GC2细胞的操作方法对睾丸细胞进行交联。对照组细胞省略照射步骤。收集交联后的细胞。在4°C条件下，以3000G离心悬浮液5分钟，弃去上清液。通过汇集至少10至12只小鼠的睾丸细胞，确保沉淀物质量不低于500毫克。称重沉淀物后，按每100毫克沉淀物加入1毫升裂解缓冲液的比例，将沉淀物重新悬浮于细胞裂解缓冲液中。涡旋后，使用聚焦式超声波破碎仪或水浴超声仪对样品进行超声处理，直至裂解液在视觉上变得澄清。然后，将约10微升裂解液分装至微量离心管中，用于RNA和蛋白质分析。向裂解液中加入30微升预先洗涤的磁珠。将样品置于杂交炉中，37摄氏度孵育30分钟，期间轻柔混匀。将样品置于磁力架上约1分钟，或直至溶液变澄清。将澄清的裂解液转移至新的离心管中。将新离心管置于磁力架上，然后将裂解液转移至另一管中，以去除任何残留的磁珠。向每个样品中加入两倍体积、预热至37摄氏度的杂交缓冲液。按每1毫升裂解液加入1微升100微摩尔探针原液的比例加入生物素标记的DNA探针。将样品置于杂交炉中，37摄氏度下以翻转旋转方式孵育12至16小时。使用前立即用细胞裂解缓冲液洗涤100微升链霉亲和素磁珠3次。最后一次洗涤后去除残留缓冲液。将杂交反应管短暂离心，然后将杂交后的样品加入洗涤过的磁珠中，轻轻混匀。将珠子悬浮液返回至原始离心管中，在37摄氏度下混匀孵育30至40分钟。孵育结束后，短暂离心样品。将离心管置于磁力架上1至2分钟，或直至溶液变澄清。然后，弃去上清液。为洗涤磁珠，加入一毫升洗涤缓冲液，将离心管置于杂交炉中，在37摄氏度孵育五分钟。经过五次洗涤后，将磁珠的1-10%转移至新的离心管中用于RNA分析。最后，向剩余的珠子中加入40微升1× SDS上样缓冲液。将样品在95摄氏度下煮沸30分钟，以洗脱蛋白质并逆转交联。收集蛋白质用于后续的质谱分析。ChIRP 质谱分析在 GC2 细胞中鉴定出超过 190 种相对于阴性对照富集的蛋白质。在 4,000 毫焦耳/平方厘米的紫外剂量下，cPDiRT-MS 鉴定出一组更具选择性的蛋白质，其中超过三分之二的蛋白质与传统 ChIRP-MS 鉴定出的蛋白质重叠。在GC2细胞和小鼠睾丸的生物学重复样本中，大多数通过至少两个独特肽段鉴定出的蛋白质均被可重复地检测到。对可重复鉴定出的蛋白质进行基因本体分析，揭示了其生物学过程总体上与TUG1的已知功能相符。对GC2细胞和小鼠睾丸数据集的比较鉴定出15种共同富集的蛋白质。增强型交联免疫沉淀测序揭示了PABPC1和CCT3在TUG1转录本上清晰且特异的结合峰。cPDiRT技术使研究人员能够在培养细胞和天然组织中识别并定量与特定交联RNA直接相互作用的蛋白质。最重要的挑战是在确保对RNA与蛋白质直接相互作用具有高特异性的同时，实现高效的紫外交联。本方案将支持未来的研究，将这一方法应用于其他RNA以及组织中，以重新激活直接参与发育和生殖过程的RNA结合蛋白。

a-uv-based-chirp-method-for-verifiable-identification-proteins-that

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

一种基于紫外线的ChIRP方法，用于可验证直接与LncRNA相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

通过RIP-Chip分离和鉴定RNA相关复合物的逐步实验方案。...

从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物中mRNA、microRNA及蛋白质组分的RIP-Chip方法

ChIRP 是一种新颖且快速的技术，用于绘制长链非编码 RNA（lncRNA）的基因组结合位点。该方法利用反义拼接寡核苷酸的特异性，实现对 lncRNA...

RNA纯化法染色质分离（ChIRP）

我们介绍了一种改进的QUICK（定量免疫沉淀结合敲低）方法，该方法此前已被提出，用于区分真实的和虚假的蛋白质-蛋白质相互作用。我们的方法基于15N代谢标记、通过ATP的有无来调节蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力、免疫沉淀以及定量质谱分析。...

一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

本视频演示了增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法，用于鉴定小鼠睾丸中的RNA结合蛋白。eCLIP能够精确定位RNA结合蛋白（RBPs）与其靶RNA相互作用的结合位点。...

一种改进的交联免疫沉淀方法用于高效鉴定小鼠睾丸中与蛋白质结合的RNA

使用SILAC-免疫共沉淀定量蛋白质组学鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用伙伴

3'非翻译区功能元件的发光鉴定法（3'LIFE）是一种用于鉴定miRNA或其他调控因子在3'非翻译区（3'UTR）中功能调控作用的技术。本方案采用高通量方法，如96孔转染和荧光素酶检测，以筛选数百种潜在相互作用中的功能性抑制效应。...

利用3'LIFE检测法高通量检测miRNA靶标

我们已建立一种利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统纯化共调节相互作用蛋白的方法。...

一种用于通过LC-MS/MS分析高通量鉴定与核辅因子相互作用蛋白的蛋白质制备方法

该RNA下拉法可用于鉴定长链非编码RNA（lncRNA）的RNA靶标。该方法基于在适当固定的组织或细胞系中，使用自制的、针对该lncRNA的特异性反义DNA寡核苷酸探针进行杂交，从而高效捕获该lncRNA的所有RNA靶标。...

长链非编码RNA靶标RNA的RNA下拉实验操作流程

本报告描述了一种快速且可靠的细胞miRNA mRNA靶标验证方法。该方法利用合成的生物素标记的锁核酸（Locked Nucleic Acid,...

基于生物素的下拉实验验证细胞miRNA的mRNA靶标

本文介绍了一种eCLIP实验方案，用于鉴定睾丸中RNA结合蛋白候选分子的主要RNA靶标。...

小鼠睾丸中高效鉴定蛋白结合RNA的增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法

Nanjing Medical University.  一种基于紫外线的ChIRP方法用于识别直接的lncRNA-蛋白质相互作用。

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于可验证地鉴定与长链非编码 RNA 直接相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

探索更多视频