一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于可验证地鉴定与长链非编码 RNA 直接相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

本研究开发了cPDiRT方法，这是一种紫外线交联技术，可直接在培养细胞和睾丸等原代组织中绘制RNA与蛋白质的相互作用图谱，从而解析TUG1在精子发生过程中的分子机制。该方案能够直接对RNA-蛋白质相互作用进行定位，适用于从培养细胞到完整原代组织的多种体系。首先，用PBS洗涤GC2细胞三次，以去除残留的培养基。

然后，向培养皿中加入三毫升 PBS，均匀分布后进行交联。在254纳米的紫外交联仪中以4,000毫焦每平方厘米的剂量照射细胞。用PBS收集细胞，并将细胞悬液在4摄氏度下以3000G离心5分钟。

弃去上清液后，称量沉淀物，并确认每个样品的沉淀物质量至少为500毫克。采集四周龄雄性C57BL6小鼠的睾丸组织。用5至10毫升DMEM将去囊睾丸组织清洗两次。

然后，将100毫克组织与10毫升含有1毫克/毫升胶原酶IV的DMEM在37摄氏度下孵育。持续消化5至15分钟，直至曲细精管释放。随后，在4摄氏度下以1000×g离心1分钟，并弃去上清液。

用5至10毫升DMEM洗涤沉淀。在4°C下以1000G再次离心悬浮液1分钟。将沉淀重悬于含有1毫克/毫升脱氧核糖核酸酶I的0.25%胰蛋白酶溶液中。在37°C孵育悬浮液5至15分钟。

然后，加入等体积的含10%胎牛血清（FBS）的DMEM以终止酶消化反应。将细胞悬液通过70微米细胞筛网过滤。在4摄氏度下以2000×g离心5分钟。

弃去上清液，用 5 至 10 毫升 PBS 洗涤沉淀。将悬液在 4°C 条件下以 2000×g 离心 5 分钟。将单细胞悬液重悬于 PBS 中，并均匀分装至直径 15 厘米的培养皿中。

按照之前对GC2细胞的操作方法对睾丸细胞进行交联。对照组细胞省略照射步骤。收集交联后的细胞。

在4°C条件下，以3000G离心悬浮液5分钟，弃去上清液。通过汇集至少10至12只小鼠的睾丸细胞，确保沉淀物质量不低于500毫克。称重沉淀物后，按每100毫克沉淀物加入1毫升裂解缓冲液的比例，将沉淀物重新悬浮于细胞裂解缓冲液中。

涡旋后，使用聚焦式超声波破碎仪或水浴超声仪对样品进行超声处理，直至裂解液在视觉上变得澄清。然后，将约10微升裂解液分装至微量离心管中，用于RNA和蛋白质分析。向裂解液中加入30微升预先洗涤的磁珠。

将样品置于杂交炉中，37摄氏度孵育30分钟，期间轻柔混匀。将样品置于磁力架上约1分钟，或直至溶液变澄清。将澄清的裂解液转移至新的离心管中。

将新离心管置于磁力架上，然后将裂解液转移至另一管中，以去除任何残留的磁珠。向每个样品中加入两倍体积、预热至37摄氏度的杂交缓冲液。

按每1毫升裂解液加入1微升100微摩尔探针原液的比例加入生物素标记的DNA探针。将样品置于杂交炉中，37摄氏度下以翻转旋转方式孵育12至16小时。使用前立即用细胞裂解缓冲液洗涤100微升链霉亲和素磁珠3次。

最后一次洗涤后去除残留缓冲液。将杂交反应管短暂离心，然后将杂交后的样品加入洗涤过的磁珠中，轻轻混匀。

将珠子悬浮液返回至原始离心管中，在37摄氏度下混匀孵育30至40分钟。孵育结束后，短暂离心样品。将离心管置于磁力架上1至2分钟，或直至溶液变澄清。

然后，弃去上清液。为洗涤磁珠，加入一毫升洗涤缓冲液，将离心管置于杂交炉中，在37摄氏度孵育五分钟。经过五次洗涤后，将磁珠的1-10%转移至新的离心管中用于RNA分析。

最后，向剩余的珠子中加入40微升1× SDS上样缓冲液。将样品在95摄氏度下煮沸30分钟，以洗脱蛋白质并逆转交联。收集蛋白质用于后续的质谱分析。

ChIRP 质谱分析在 GC2 细胞中鉴定出超过 190 种相对于阴性对照富集的蛋白质。在 4,000 毫焦耳/平方厘米的紫外剂量下，cPDiRT-MS 鉴定出一组更具选择性的蛋白质，其中超过三分之二的蛋白质与传统 ChIRP-MS 鉴定出的蛋白质重叠。

在GC2细胞和小鼠睾丸的生物学重复样本中，大多数通过至少两个独特肽段鉴定出的蛋白质均被可重复地检测到。对可重复鉴定出的蛋白质进行基因本体分析，揭示了其生物学过程总体上与TUG1的已知功能相符。对GC2细胞和小鼠睾丸数据集的比较鉴定出15种共同富集的蛋白质。

增强型交联免疫沉淀测序揭示了PABPC1和CCT3在TUG1转录本上清晰且特异的结合峰。cPDiRT技术使研究人员能够在培养细胞和天然组织中识别并定量与特定交联RNA直接相互作用的蛋白质。最重要的挑战是在确保对RNA与蛋白质直接相互作用具有高特异性的同时，实现高效的紫外交联。

本方案将支持未来的研究，将这一方法应用于其他RNA以及组织中，以重新激活直接参与发育和生殖过程的RNA结合蛋白。