Name: 特定地点的重组酶（SSR）技术的原则 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:11:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 了解位点特异性重组酶（SSR）技术的基本原理，特别是Cre/lox系统在条件性基因突变中的应用。该方法为基因功能研究提供了比传统敲除策略更灵活的工具。

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位点特异性重组酶（ssr）技术原理

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

位点特异性重组酶（SSR）技术可用于操控基因结构以研究基因功能，现已成为分子生物学中不可或缺的工具。位点特异性重组酶是一类能够结合特定DNA靶序列的蛋白质。Cre/lox系统最早于20世纪80年代在噬菌体中被发现。Cre重组酶是一种I型拓扑异构酶，可催化两个loxP（P1噬菌体交叉位点）序列之间的DNA位点特异性重组。Cre/lox系统不需要任何辅助因子。loxP序列包含Cre重组酶的特异性结合位点，两侧围绕着一个具有方向性的核心序列，重组与重排即在此核心区域发生。当细胞内存在loxP位点并表达Cre重组酶时，便会触发重组事件。Cre重组酶在两个loxP位点处切割双链DNA，随后进行重排并连接（“剪切与粘贴”）。重组产物的类型取决于loxP序列的相对方向。
SSR 技术常被用作研究基因功能的工具。在此方法中，目的基因的两侧被 Cre 重组酶识别位点 loxP 所包围（“floxed”）。随后将此类动物与另一种表达 Cre 重组酶的动物杂交，后者中 Cre 重组酶的表达受组织特异性启动子的调控。在表达 Cre 重组酶的组织中，该酶会结合靶序列并切除被 loxP 包围的基因。通过可控的基因删除，可对特定组织及特定时间点的基因功能进行研究。利用 SSR 技术进行基因功能分析——即条件性诱变——相较于传统基因敲除具有显著优势，因为在传统敲除中，基因的删除往往导致胚胎致死。

位点特异性重组酶（SSR）技术及Cre/lox系统的出现推动了分子生物学的诸多进展，并已成为在转基因动物中评估基因功能的有力工具。本次访谈探讨了环化重组酶（Cre）介导的位点特异性重组机制，以及该酶的应用如何促进了条件性诱变技术的发展，相较于传统的基因敲除策略，条件性诱变具有显著优势。

位点特异性重组酶（SSR）技术原理

位点特异性重组酶（SSR）技术可实现对基因结构的定向操作，以研究基因功能，现已成为分子生物学研究中不可或缺的工具。

你好，我叫 Frank Buchholz。我是马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所的一名课题组长。我们的工作得以持续开展。我们的工作包含两个方面：一是关于RNA I的筛选，二是关于开发位点特异性重组酶以实现先进的基因组工程。我的学术背景是生物学，具体而言是分子生物学，我在生物学领域接受了系统的训练。随后，我在海德堡的欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratories）获得了博士学位，之后在旧金山加州大学（UCSF）跟随迈克·毕晓普（Mike Bishop）从事博士后研究，研究方向为白血病的动物模型。位于德累斯顿的马克斯·普朗克研究所致力于整合至少两个不同的研究方向，即发育生物学与细胞生物学，其核心主题可以说在于深入探究细胞如何形成组织这一基本问题。这基本上就是 Ston 研究所的整体目标。我们的工作主要集中在两个领域：其中一个领域是进行 RNAi 筛选，旨在发现先前未被表征的基因在生物过程中的新功能。另一个研究方向涉及基因组工程，旨在开发能够利用位点特异性重组酶对基因组进行复杂改造的技术。尽管位点特异性重组酶早在20世纪80年代就已被发现，例如我们所研究的Cre重组酶即于80年代初期被发现，它实际上是一种细菌噬菌体蛋白，最初来源于感染细菌的噬菌体，也就是一种能够感染细菌的病毒。因此，这与目前所使用的技术相距甚远，但人们很快认识到，这些酶能够发挥非常有趣的功能，并可在其他生物体中加以利用。位点特异性重组酶是一类能够结合DNA的蛋白质，它们可特异性地结合到DNA的特定序列上；当其结合到这些靶序列时，能够切断DNA，同时重新排列这些位点，从而基本完成连接过程。通过这种位点特异性的重组，可以像使用剪刀和胶水一样，将DNA序列以原本无法实现的方式重新组合在一起。因此，这些位点特异性重组酶，正如我所说，最初是在细菌或噬菌体中发现的。随后研究人员测试了它们是否在其他生物体中也能发挥作用。有趣的是，它们在其他生物体中同样能够执行其功能。因此，如果你在某种生物体中引入了位点特异性重组酶的靶位点，这些酶就会发挥其功能。这类位点特异性重组酶的一个非常重要的应用，特别是那些不需要任何辅助因子的重组酶，例如我们今天所讨论的研究工作中用作起点的 Flp 重组酶或 Cre 重组酶，它们在无辅助因子的条件下即可发挥作用。如果在动物体内或动物细胞中表达这些酶，它们就能识别该生物体中的特定序列，并在相应位置进行“剪切和粘贴”，从而切除某些特定序列。例如，这种酶已被成功应用于小鼠的条件性诱变研究。假设你有一个已知的有趣基因，想要了解该基因的功能。一个非常著名的实验是构建所谓的基因敲除小鼠。正如你最近所看到的，这项技术实际上在今年获得了诺贝尔奖，其基本原理是在小鼠中实现基因删除。然而，有时你会发现，在动物中敲除某个基因时，该基因是必需的，小鼠会在胚胎发育早期即死亡。现在这表明你的基因非常重要，但并不能真正告诉你其功能是什么。因此，目前一种非常突出的方法是进行所谓的条件性基因敲除。具体做法是，用这些位点特异性重组酶的靶位点来包围你感兴趣的基因。这意味着在这些小鼠中，该基因的表达将与野生型小鼠相同。然而，如果你将这些小鼠与表达CRE重组酶的小鼠进行杂交，例如在组织特异性启动子驱动下表达CRE重组酶，那么你就可以仅在特定细胞中删除目的基因，而这些细胞的类型可根据重组酶的表达位置预先确定。从这些实验中我们还了解到，这类重组在从整个生物体中删除序列时可以非常高效。而这一点正是我们尝试开发一种能够在预先设定的特定位点进行切割的重组酶的前提条件，此前这一直是进一步开发该位点特异性重组酶的主要限制之一。过去，你必须将识别靶位点插入到目标生物体细胞的基因组中。因此，我们思考：能否打破这一障碍？基本上是利用分子进化。目前，据我所知，位点特异性重组酶尚未用于治疗。正如我所说，这主要是因为人体内不存在任何天然存在的重组酶所能识别的靶位点。因此，必须首先对它们进行改造，才能在治疗环境中使用。目前我们才刚刚开始探索这种可能性。未来将证明，我们是否真能将这些酶开发用于治疗用途，以及这种设想是否能够实现。

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特定地点的重组酶（SSR）技术的原则

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