Name: 利用多西环素诱导型ASCL1/DLX2在AAVS1位点的表达由人诱导性多能干细胞生成GABA能神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 了解利用多西环素诱导型ASCL1/DLX2在AAVS1位点表达，由人诱导性多能干细胞高效生成功能性GABA能神经元的标准化实验方案。该方法通过CRISPR/Cas9介导的基因敲入实现稳定可控的神经分化，为神经系统疾病体外建模提供可靠工具。

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本研究得到了加拿大干细胞网络青年研究员启动计划（Canadian Stem Cell Network Jump Start ECR Program）以及蒙特利尔大学基金会儿童癫痫想象研究所-圣心医院合作项目基金（Fonds UdeM pour le partenariat CHU Sainte-Justine -Institut Imagine en épilepsie de l’enfant）的支持。Théo Rabin 得到了 Odisé 网络的支持。

警告：人类hiPSC培养物应按照机构生物安全规程，作为潜在的生物危害材料进行处理。所有人类hiPSC培养操作均须在经认证的II级生物安全柜中，采用无菌技术进行。含有人类细胞的废弃物、接触过人类细胞的培养基以及CRISPR/Cas9质粒材料，在丢弃前应根据当地生物安全指南进行去污处理。多西环素、嘌呤霉素、DMSO及其他化学试剂应佩戴手套，并采取适当的眼部和皮肤防护措施进行操作，废弃物应根据机构的化学废弃物处理规程进行处置。基底膜提取物（BME）应采用无菌技术操作，并在使用前置于冰上保存，以防止提前聚合。液氮储存和冻存管操作时应佩戴适当的低温手套，采取面部防护，并谨慎操作，避免在解冻过程中发生冻伤或冻存管爆炸。
注意：在进行 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑和神经元分化之前，人诱导多能干细胞（hiPSC）培养物应满足预定义的质量控制标准。细胞必须经确认无支原体污染，具有正常核型或可接受的基因组完整性特征，并持续稳定表达多能性标志物，包括 OCT4、SOX2、NANOG、TRA-1-60 和/或 SSEA4。培养物应呈现典型致密的 hiPSC 克隆形态，具有较高的核质比、清晰的克隆边界以及极少的自发分化现象。应仅使用处于推荐传代范围内的活跃增殖培养物，且细胞传代次数不得超过实验室规定的最大传代数（通常低于第 40 代），除非另有验证。凡出现异常形态、过度自发分化、生长不良、确认污染或基因组不稳定性迹象的培养物，均不应用于基因编辑和分化实验。本实验方案所需全部材料（包括培养基配方）均列于材料表中。
1. 试剂与培养板的准备
<ol>
	<li>在50 mL锥形管中，将40 mL敲除血清替代物（KOSR）与10 mL二甲基亚砜（DMSO）混合，配制冻存液。</li>
	<li>用移液器反复吹打10次，使冻存液充分混匀。溶液可在4 °C保存最多1个月。</li>
	<li>用杜氏改良伊格尔培养基/F12（DMEM/F12）将基底膜提取物（BME）稀释至终浓度为80 µg/mL。 
	注意：稀释前，请通过供应商网站输入批号，核实所收到BME溶液的浓度。</li>
	<li>向6孔板的每个孔中加入1 mL稀释后的BME。立即将未使用的BME原液放回4 °C保存，可保存最多1个月。</li>
	<li>倾斜培养板，使溶液均匀覆盖各孔的整个表面，确保无未包被区域。</li>
	<li>使用前，在37 °C孵育至少30分钟。 
	注意：无最长孵育时间限制。若孵育超过1天，需确保DMEM/F-12不发生蒸发。用于一个孔的BME溶液仅可重复使用一次以包被第二个孔。由于BME在室温下会迅速聚合，因此在室温操作时应尽量迅速。</li>
</ol>
2. 人诱导多能干细胞的维持与传代
注意：在本方案中，hiPSC 维持培养基指 mTeSR plus。mTeSR plus 是用于常规维持、传代、核转染后恢复以及嘌呤霉素筛选的推荐培养基。
<ol>
	<li>当细胞达到约60%融合度时，每4–6天进行一次hiPSC传代。</li>
	<li>使用吸管将培养孔中的培养基吸除。</li>
	<li>向孔中加入1 mL ReLeSR试剂，在室温下孵育30秒。</li>
	<li>吸除消化试剂，将培养板在37 °C条件下孵育8分钟。</li>
	<li>使用5 mL移液器轻柔加入1 mL hiPSC维持培养基。将细胞悬液收集至50 mL离心管中。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝在微量离心管中混合。取10 µL混合液加入细胞计数板，测定活细胞浓度。</li>
	<li>吸除预先包被好的孔中的基底膜提取物（BME）涂层，加入2 mL添加了Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632；终浓度10 μM）的hiPSC维持培养基。</li>
	<li>将100,000个hiPSC接种至该孔中，确保细胞活力&#62;90%。以“8”字形轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>24小时后，更换为2 mL不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR Plus培养基。 
	注意：在ROCK抑制剂存在时，细胞形态可能出现短暂变化（细胞伸长）。需确认去除抑制剂后细胞恢复其典型形态。</li>
</ol>
3. hiPSC 的核转染
<ol>
	<li>当细胞融合度达到约60%时进行传代。 
	注意： 在本方案中，约60%的融合度对应于活跃生长的人诱导多能干细胞（hiPSC）集落，覆盖了孔底表面略超过一半的区域，集落之间有可见间隙，且自发分化极少。在进行核转染时，集落不应过度生长、广泛融合，或出现致密的多层中心结构。</li>
	<li>确保核转染仪已开启，并将核转染补充剂加入核转染溶液P3中。准备一个冰桶。</li>
	<li>将110 µL核转染溶液P3加入置于冰上的微量离心管中。</li>
	<li>向管中加入1 µg CRISPR/Cas9质粒和1 µg含有强力霉素诱导型ASCL1-P2A-DLX2表达盒、荧光报告基因及嘌呤霉素抗性表达盒的供体质粒。轻轻混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>通过吸除两个包被孔中的BME制备目的板。向每孔加入2 mL含ROCK抑制剂的hiPSC维持培养基，并将培养板置于37 °C孵育。</li>
	<li>按照步骤2.2至2.5所述方法，从6孔板的一个孔中消化60%融合度的hiPSC。将细胞悬液转移至无菌离心管中，在室温下以500 x g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含质粒的110 µL核转染溶液P3中。轻柔吹打混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>将100 µL细胞悬液转移至置于冰上的核转染杯中。</li>
	<li>将核转染杯插入核转染仪，运行适用于hiPSC的CB-150程序。</li>
	<li>立即使用塑料巴斯德吸管回收细胞，将等体积的细胞悬液分别转移至先前准备好的两个孔中。</li>
	<li>采用“8”字形动作均匀分布细胞，置于37 °C孵育。</li>
	<li>24小时后，更换为不含ROCK抑制剂的mTeSR plus培养基。如适用，通过观察荧光信号验证核转染效率。</li>
</ol>
4. 抗生素筛选
警告：嘌呤霉素具有毒性。操作时应使用适当的个人防护装备，并根据机构指南妥善处理废弃物。
注意：在筛选经编辑的hiPSCs之前，需确定每种hiPSC细胞系的最佳嘌呤霉素浓度。将未经编辑的hiPSCs以每孔10万个细胞的密度接种于BME包被的6孔板中，使用添加ROCK抑制剂的hiPSC维持培养基进行培养。24小时后，更换为新鲜的含嘌呤霉素的hiPSC维持培养基，嘌呤霉素浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.5 µg/mL。每天更换含嘌呤霉素的培养基，并通过明场显微镜观察细胞形态和存活情况，持续5天。所选浓度应能在3–5天内完全清除所有未经编辑的hiPSCs，同时将过度毒性降至最低。在本实验方案中，通常最佳的嘌呤霉素浓度为0.4–0.6 µg/mL。
<ol>
	<li>转染后等待3代，通常约1–2周，具体时间取决于细胞恢复和生长速度，以确保在开始筛选前非整合型质粒已丢失。</li>
	<li>进行一次细胞传代，每孔接种100,000个细胞。</li>
	<li>24小时后，加入根据杀灭曲线确定浓度的嘌呤霉素，通常为0.4–0.6 µg/mL。&#160;</li>
	<li>维持嘌呤霉素筛选至预定时间，一般约为5天。</li>
	<li>通过荧光显微镜或流式细胞术验证筛选后的细胞群体，以评估报告基因阳性细胞的比例。 
	注意：仅使用报告基因表达广泛均一的混合细胞群体进行后续实验，理想情况下报告基因阳性细胞比例应&#62;80–90%。若报告基因表达仍呈嵌合状态，应延长筛选时间、重复富集步骤，或在诱导分化前考虑进行单克隆分离。</li>
	<li>在启动神经元分化前，通过连接区PCR确认AAVS1.位点的正确靶向。</li>
	<li>当需要严格验证时，应通过Sanger测序验证PCR产物，并采用qPCR、ddPCR或其他合适的拷贝数检测方法评估转基因拷贝数。</li>
	<li>根据下游应用需求，使用基于PCR的方法检测质粒骨架序列的随机整合，或进行更广泛的全基因组整合分析。</li>
	<li>确认筛选获得的hiPSC细胞群体仍为支原体阴性，保持典型的hiPSC克隆形态，并在嘌呤霉素筛选后维持良好的增殖能力。</li>
	<li>通过核型分析、SNP芯片或其他经验证的检测方法重新评估基因组完整性，特别是在编辑后的细胞将用于疾病建模、功能分析或长期研究时。</li>
	<li>通过靶向测序预测的脱靶位点，或在必要时采用更广泛的基因组方法，评估CRISPR/Cas9可能产生的脱靶效应。 
	注意：若细胞出现异常形态、筛选后恢复不良、报告基因表达持续呈嵌合状态、存在已确认的基因组异常或AAVS1整合失败，则不应将其用于分化实验。在本方案中，筛选后的工程化hiPSC以混合群体形式使用，可在多西环素诱导前冻存，前提是报告基因表达、AAVS1.靶向、形态学特征和生长状态均已验证。在多西环素诱导后或神经元成熟过程中进行冻存不属于标准操作流程，若需实施应先进行经验性验证。</li>
</ol>
5. 分化为GABA能神经元
<ol>
	<li>准备所需数量的BME包被孔板。注意，第0天接种的一个孔将产生一个孔的GABA能神经元。</li>
	<li>每孔准备6.9 mL神经诱导培养基，并添加强力霉素（1 µg/mL）。额外增加15%体积以补偿蒸发或移液误差。 
	注意：强力霉素自第0天起以终浓度1 µg/mL使用，并在整个分化和成熟过程中持续维持。每次更换培养基时均需配制含新鲜强力霉素的培养基，以确保转基因稳定诱导。该剂量的选择基于我们在实验中观察到较强的报告基因表达和高效的神经元转化效果。本方案未进行正式的强力霉素剂量-反应实验；因此，若转基因诱导效果不理想，各实验室可经验性地测试0.1–2 µg/mL范围内的强力霉素浓度。</li>
	<li>第0天，将基因工程改造的人诱导多能干细胞（hiPSCs）解离后，接种200,000个细胞至已准备好的BME包被孔中。在37 °C条件下培养。</li>
	<li>第1、2、3天，吸除培养基，每孔加入2 mL含强力霉素的新鲜神经诱导培养基。 
	注意：至第3天，细胞增殖应显著减缓，可能出现树突样结构。若需实验验证细胞周期退出，可在第3–4天进行Ki-67免疫染色或EdU/BrdU掺入检测。</li>
	<li>第4天，配制含脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）和神经营养因子-3（NT-3）的神经成熟培养基，上述因子终浓度均为10 ng/mL，同时加入1 µg/mL强力霉素和20 µM PluriSln。</li>
	<li>吸除神经诱导培养基。沿孔壁逐滴小心加入2 mL神经成熟培养基，避免扰动新形成的神经元。</li>
	<li>第7天，吸除培养基，轻柔加入2 mL含神经营养因子和强力霉素的神经成熟培养基，但不再添加多能性细胞存活抑制剂。</li>
	<li>长期维持时，每3至4天完全更换一次神经成熟培养基，可根据细胞密度调整更换频率。 
	注意：第21天是评估GABA能神经元身份的标准终点。至第21天，细胞应表现出GABA能神经元特征，包括DLX1的表达，并持续完善其轴突网络。接种密度200,000个细胞/孔是经经验优化确定的，可在避免过度拥挤和成熟相关细胞死亡的同时获得分布良好的克隆。150,000–300,000个细胞/孔的密度范围均可兼容，较低密度适用于形态学研究，较高密度适用于材料收获。为减少细胞脱落，建议使用1,000 µL移液器以低流速进行更频繁的半量换液，操作时勿倾斜培养板。如有需要，可在3天强力霉素诱导后、添加成熟培养基前，使用增强型包被材料（如聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白或层粘连蛋白-521）将细胞重新接种一次。开始成熟后应避免进一步传代。</li>
	<li>若神经网络保持附着、存活且无增殖性hiPSC样克隆出现，培养物可维持超过第21天以实现进一步成熟。第21天后，每3–4天进行一次半量换液，使用含强力霉素和神经营养因子的新鲜神经成熟培养基。 
	注意：当神经元形态和神经突网络稳定、脱落极少且无可辨识的未分化克隆时，可用于下游检测。在我们实验条件下，通常在第21天至第35天之间使用这些培养物。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

GABA能神经元的成功生成在很大程度上依赖于本方案中的多个关键步骤。维持高质量且未分化的hiPSCs至关重要；在核转染之前若发生自发分化，将显著降低基因整合效率以及后续神经元的纯度8。此外，准确确定嘌呤霉素杀灭曲线对于彻底清除未整合的细胞、同时避免对正确编辑的克隆造成过度损伤至关重要。在分化阶段，需对培养物进行细致而轻柔的操作，特别是将培养基沿孔壁逐滴加入，以防止脆弱的神经网络脱落。
研究人员可能会遇到多种挑战，需要有针对性地进行故障排除。如果核转染后细胞存活率异常偏低，可缩短细胞在核转染溶液中的暴露时间，并严格在冰上控制温度，从而显著提高细胞存活率。如果在成熟过程中仍存在未分化的干细胞，可在早期成熟阶段加入多能干细胞存活抑制剂（如步骤5.5所述），以有效选择性清除污染性的未分化干细胞。故障排除应基于明确的阈值和特定步骤的纠正措施。核转染后存活率低（定义为24小时时活细胞比例低于30–40%）通常由过度解离应激或核转染毒性引起。可通过缩短细胞在P3缓冲液中的停留时间、核转染前将细胞保持在冰上、使用健康且近期传代的人诱导多能干细胞（hi...

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）为在体外模拟人类神经系统疾病以及研究驱动发育与退变的复杂分子机制提供了独特的平台。in vitro。该技术能够生成患者特异性的细胞模型，用于研究多种疾病，范围从综合征型纤毛病中的早期神经发育异常2到散发性阿尔茨海默病中观察到的细微表观基因组改变3。因此，hiPSCs的定向分化已成为现代分子神经科学的核心技术之一1。
为了有效捕捉人类神经系统过程的细微特征，生成高度特异且纯度高的神经元亚型至关重要。例如，需要明确的神经元群体来阐明蛋白质（如MECP2）在人类神经元中的特定转录作用4，或评估外周感觉神经元对病毒感染（如SARS-CoV-2）的特异性易损性5。此外，构建复杂且具有生理相关性的微环境（例如将功能性小胶质细胞整合到三维脑类器官中），从根本上依赖于不同神经和胶质谱系的稳定且可预测的生成6。在这些亚型中，GABA能神经元因其在中枢神经系统中的关键抑制性作用以及与多种神经和精神疾病的相关性而备受关注7。本方法的总体目标是提供一种可靠、高效且可重复的方案，用于将人诱导性多能干细胞（hiPSCs）定向分化为表达GABA能谱系标志物的诱导神经元。传统的GABA能神经元定向分化方案依赖于外源性信号分子，往往耗时较长、变异程度高，并产生异质性的细胞群体8。
为了克服这些局限性，转录因子介导的正向编程已成为一种强大的替代方法9。本方案采用多西环素诱导型表达系统，驱动神经前体转录因子 ASCL1 和 DLX210 的表达。通过利用 CRISPR/Cas9 将这些转基因靶向整合至腺相关病毒整合位点 1（AAVS1.）这一安全港位点，该方法避免了随机慢病毒整合所常见的转基因沉默问题10。供体质粒包含一个荧光报告基因（如 mCherry），用于在筛选后监测转基因阳性细胞。该策略旨在实现比随机整合方法更均一的转基因表达，但每条工程化细胞系的表达稳定性与分化可重复性仍需验证。该标准化方法可在约 21 天内生成富集的诱导神经元群体，这些神经元表达 GABA 能谱系标志物，所需时间短于传统的基于小分子的方法8,10。本方案非常适用于需要可扩展且一致的神经元群体以进行后续应用（如高内涵显微成像、单细胞转录组学或功能性生理学检测）的研究人员。

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&amp;trade; 核心单元</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td>用于 hiPSC 的电穿孔/核转染。</td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920300</td><td>用于hiPSC维持与分化的组织培养处理板</td></tr><tr><td>BDNF（脑源性神经营养因子）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>重组人源神经元成熟蛋白；按制造商说明书配制，使用终浓度为10 ng/mL。</td></tr><tr><td>细胞计数仪（Countess）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10283</td><td>用于细胞计数。</td></tr><tr><td>离心</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>用于细胞沉淀。</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Heracell VIOS 160i 或同等型号</td><td>维持37℃的细胞培养箱 &amp;deg;C，加湿环境，5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5000-0020</td><td>用于冻存hiPSC的无菌冻存管；等效外螺纹1.8&amp;ndash;可使用 2.0 mL 冻存管。</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix 低生长因子基底膜提取物</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>本方案中使用的标准BME包被基质。根据Bio-Techne分析证书中的批号特异性原液浓度，用DMEM/F-12稀释至80 &amp;micro;g/mL 工作浓度</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>用于稀释BME的基礎培養基。</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>用于冷冻培养基制备的冷冻保护剂。</td></tr><tr><td>供体质粒：可诱导型 ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 靶向表达盒</td><td>定制质粒</td><td>Addgene 登记号待定</td><td>定制AAVS1供体质粒，包含多西环素诱导型ASCL1-P2A-DLX2表达盒及筛选/报告元件。质粒图谱和完整序列作为补充文件提供或应要求提供。</td></tr><tr><td>盐酸多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>用于诱导 ASCL1-P2A-DLX2 表达。制备无菌储存液，分装，避光保存于冷冻条件，使用时稀释至 1 &amp;micro;g/mL 终浓度</td></tr><tr><td>乙醇（70%）</td><td>Commercial Alcohols / Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>在生物安全柜内进行消毒时，使用机构批准的70%乙醇或等效试剂。</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>用于观察报告基因表达和神经元形态的相差及荧光成像的显微镜。</td></tr><tr><td>GDNF（胶质细胞源性神经营养因子）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>重组人源神经元成熟蛋白；按制造商说明书配制，使用终浓度为10 ng/mL。</td></tr><tr><td>hiPSC 细胞系 PGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1 人诱导多能干细胞系</td><td>本方案中使用的商业化开放知情同意的人类iPSC细胞系；在进行基因编辑和分化前，需记录传代次数和质量控制状态。</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>开源；应报告所使用的版本</td><td>用于荧光定量和代表性图像处理。</td></tr><tr><td>敲除&amp;trade; 血清替代物（KOSR）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10828028</td><td>用于冷冻保存液的配制。</td></tr><tr><td>层粘连蛋白-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>可选的故障排除试剂。不属于标准包被方案的一部分；若神经元持续脱落，可作为替代包被基质或二次包被基质使用。</td></tr><tr><td>液氮杜瓦瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Locator 6 Plus 或同等产品</td><td>根据机构的低温安全规程，将冷冻的hiPSCs长期储存在液氮气相或液氮中。</td></tr><tr><td>弗罗斯特先生&amp;trade; 冻存容器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5100-0001</td><td>用于细胞在 -80 ℃ 条件下的程序降温冻存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>mTeSR&amp;trade; 加</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>无饲养层维持培养基（用于hiPSCs）</td></tr><tr><td>神经诱导培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>08582</td><td>用于早期神经元诱导的商用神经诱导培养基。</td></tr><tr><td>神经元成熟基础培养基（BrainPhys&amp;trade; 神经元培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>用于神经元成熟的基礎培養基；根據方案描述，添加 BDNF、GDNF、NT-3、doxycycline 和 PluriSln-1。</td></tr><tr><td>NT-3（神经营养因子3）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78074</td><td>重组人蛋白，用于神经元成熟；按制造商说明书配制，使用终浓度为10 ng/mL。</td></tr><tr><td>P3 原代细胞 4D-电转染仪&amp;trade; X试剂盒</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>包含Solution P3溶液和小电穿孔杯的hiPSC核转染试剂盒</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>可选抗生素，用于降低细菌污染风险。</td></tr><tr><td>Plasmocin&amp;trade; 预防性的</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpp</td><td>可选抗生素，用于预防支原体污染。</td></tr><tr><td>PluriSIn-1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72822</td><td>多能细胞存活抑制剂，用于清除未分化的hiPSCs；按照生产商说明书配制储存液，并以20倍稀释使用 &amp;micro;M 终浓度</td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1113803</td><td>用于筛选的抗生素；制备无菌储存液，分装，冻存，并通过杀灭曲线确定最终工作浓度，通常为 0.4&amp;ndash;0.6 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>pX330-U6-嵌合型_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA 质粒</td><td>Addgene</td><td>85802</td><td>用于AAVS1位点靶向的CRISPR/Cas9质粒；应在质粒图谱或补充信息中包含AAVS1 gRNA序列。</td></tr><tr><td>qPCR分析软件</td><td>应用生物系统公司 / 赛默飞世尔科技</td><td>QuantStudio 设计 &amp;amp; 分析软件或同等产品</td><td>用于 Ct 值提取和 RT-qPCR 分析；报告所用软件版本。</td></tr><tr><td>qPCR预混液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PowerUp SYBR Green Master Mix, A25742</td><td>用于神经元和GABA能标志物的RT-qPCR定量分析。</td></tr><tr><td>qPCR 引物：DLX1</td><td>定制寡核苷酸</td><td>评论中提供的序列</td><td>上游引物：5' ATGCACTGTTTACACTCGGC 3'；下游引物：5' GACTGCACCGAACTGATGTAG 3'。用于评估第21天GABA能谱系诱导情况。</td></tr><tr><td>qPCR 引物：GAD2</td><td>定制寡核苷酸</td><td>评论中提供的序列</td><td>正向：5' TGGCGTTTCTGCAAGATGTTA 3'；反向：5' TTGGTCTGCCAATTCCCAATTAT 3'。GABA能神经元标记物。</td></tr><tr><td>qPCR 引物：GAD67</td><td>定制寡核苷酸</td><td>评论中提供的序列</td><td>上游引物：5' GCTTCCGGCTAAGAACGGT 3'；下游引物：5' TTGCGGACATAGTTGAGGAGT 3'。GABA能神经元标记物。</td></tr><tr><td>qPCR 引物：RPLP0</td><td>定制寡核苷酸</td><td>待提供序列</td><td>参考基因引物用于 &amp;Delta;&amp;Delta;Ct 值归一化。引物序列应列于表格或补充信息中。上游：5' AGCCCAGAACACTGGTCTC 3'；下游：5' ACTCAGGATTTCAATGGTGCC 3'。</td></tr><tr><td>qPCR 引物：SLC17A6</td><td>定制寡核苷酸</td><td>评论中提供的序列</td><td>正向：5' GGGAGACAATCGAGCTGACG 3'；反向：5' TGCAGCGGATACCGAAGGA 3'。谷氨酸能神经元标记物。</td></tr><tr><td>qPCR 引物：SLC17A7</td><td>定制寡核苷酸</td><td>评论中提供的序列</td><td>正向：5' CAGAGTTTTCGGCTTTGCTATTG 3'；反向：5' GCGACTCCGTTCTAAGGGTG 3'。谷氨酸能神经元标记物。</td></tr><tr><td>ReLeSR&amp;trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0484</td><td>无需酶的试剂，用于hiPSC的解离与传代</td></tr><tr><td>逆转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SuperScript IV VILO Master Mix，11756050</td><td>用于RT-qPCR前的cDNA合成。</td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>RNeasy 试剂盒 (74104)</td><td>用于RT-qPCR前总RNA提取的试剂盒。在最终的材料表中记录所用RNeasy试剂盒的具体型号和货号。</td></tr><tr><td>统计软件</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism，版本 11</td><td>用于RT-qPCR数据的绘图与统计分析。</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td>用于细胞计数过程中评估细胞活力的活体染料。</td></tr><tr><td>Y-27632（ROCK抑制剂）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>使用浓度为10 &amp;micro;M终浓度，以在传代和核转染过程中提高细胞存活率。</td></tr></tbody></table>

利用多西环素诱导型ascl1/dlx2在aavs1位点的表达由人诱导性多能干细胞生成gaba能神经元

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）为建立人类神经系统疾病模型提供了前所未有的机遇 体外 可靠地生成特定的神经元群体（例如γ-氨基丁酸能（GABA能）神经元）对于这些研究至关重要。本方案详细描述了一种利用多西环素诱导系统将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为GABA能神经元的稳健方法。该方法依赖于将编码转录因子的转基因稳定整合到基因组中 ASCL1 和 DLX2 安全港腺相关病毒整合位点1（AAVS1通过CRISPR/Cas9介导的敲入技术将目的序列靶向整合至AAVS1位点。这种靶向整合可避免随机慢病毒整合常导致的转基因沉默现象。本方案涵盖hiPSCs的培养、核转染介导的转基因整合、嘌呤霉素筛选以富集成功编辑的细胞，以及逐步分化操作的具体流程。在诱导表达多西环素后，经基因工程改造的hiPSCs可在21天内快速退出细胞周期，呈现神经元形态，并表达GABA能谱系标志物。关键步骤包括利用特定生长因子进行神经诱导及后续成熟阶段，以及在成熟过程中增强细胞黏附的潜在优化策略。该标准化方法可获得富集的表达GABA能谱系标志物的诱导神经元，为神经科学研究和细胞模型构建提供了有力工具。

该方案成功实施后，可获得具有GABA能分子特征的诱导神经元富集群体。该策略基于多西环素可诱导的靶向插入 ASCL1-P2A-DLX2 将盒式结构插入 AAVS1 位点（图1A）。在筛选出经基因改造的hiPSCs后，按照所示时间线，使用多西环素诱导以促进GABA能神经元的分化，如图所示 图1B转染后经嘌呤霉素筛选，研究人员应观察到整合型荧光报告基因近乎均一的表达例如， mCherry）在hiPSC集落中广泛表达，表明基因编辑细胞已成功富集。在分化阶段，添加多西环素可诱导hiPSCs发生快速的形态学转变（图1C）。阳性结果的特征是在第3天细胞分裂停止，随后出现神经突起的生长（图1C。到第20天，通过相差显微镜可清晰观察到广泛的轴突网络，从而确认分化成功（图1D，以及中间神经元...

本方案描述了一种通过将多西环素诱导型转基因整合到AAVS1安全港位点，从而由人诱导性多能干细胞生成GABA能神经元的方法。这种稳定且均一的转基因表达可高效地实现向GABA能神经元的直接分化，同时减少转基因沉默现象，而转基因沉默是慢病毒方法中常见的问题。

利用多西环素诱导型ASCL1/DLX2在AAVS1位点的表达由人诱导性多能干细胞生成GABA能神经元

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）为在体外建立人类神经系统疾病模型提供了前所未有的机遇。稳定地生成……

我们的研究致力于从人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化获得高纯度的GABA能神经元群体，以模拟人类神经元的多样性及相关疾病。现有的实验方案需要在每次分化过程中重复进行病毒转导。本方案通过使用AAVS1细胞系克服了这一局限性。首先，通过在50毫升锥形管中加入40毫升敲除血清替代物（knock-out serum replacement，KOSR）和10毫升二甲基亚砜（DMSO）来配制冻存液。用移液器吹打10次使冻存液混匀，并将溶液置于4摄氏度保存。接着，用DMEM/F12培养基稀释基底膜提取物（basement membrane extract，BME），使其终浓度为80微克/毫升。向六孔板的每孔中加入1毫升稀释后的BME溶液。倾斜培养板，使溶液均匀覆盖整个孔表面，确保无未包被区域，并在37摄氏度下孵育至少30分钟。使用移液枪吸取含有人诱导性多能干细胞（hiPSCs）孔中的培养基。向孔中加入1毫升ReLeSR试剂，在室温下孵育30秒。吸除消化试剂后，将培养板在37摄氏度条件下孵育8分钟。使用5毫升移液枪，轻柔地向孔中加入1毫升hiPSC维持培养基。将细胞悬液收集至50毫升离心管中。取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝在微量离心管中混合。取10微升混合液加入细胞计数板，测定活细胞浓度。吸除预先准备好的孔中的基底膜提取物（BME）包被液后，加入2毫升添加了Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK抑制剂）的hiPSC维持培养基。将10万个hiPSC接种至孔中，目标活率高于90%。以“8”字形方式轻晃培养板，确保细胞均匀分布，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。24小时后，更换为2毫升不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR plus培养基。当细胞融合度达到约60%时进行传代。开启核转染仪后，将核转染添加剂加入核转染溶液P3中。取110微升核转染溶液P3加入置于冰上的微量离心管中。接着，向管中加入1微克CRISPR/Cas9质粒和1微克供体质粒，轻轻混匀，避免产生气泡。吸除两个包被孔中的BME。向每个孔中加入2毫升含有ROCK抑制剂的hiPSC维持培养基，并将培养板置于37°C孵育。按照先前所示方法，将一个孔中60%融合度的hiPSC消化解离后，将细胞悬液转移至无菌离心管中。在室温下以500 × g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于110微升含有质粒的核转染溶液P3中，轻轻吹打混匀，避免形成气泡。将100微升细胞悬液转移至电转杯中，插入核转染仪，运行针对hiPSC的CB-150程序。电转完成后，取出细胞悬液，用“8”字形操作将其转移并均匀分配至先前准备好的两个孔中。随后在37°C孵育。24小时后，更换为不含ROCK抑制剂的mTeSR plus培养基，并通过观察荧光来验证核转染效率。核转染后三代，每孔接种100,000个细胞。24小时后加入嘌呤霉素，终浓度为0.4至

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利用多西环素诱导的ASCL1/DLX2表达在AAVS1上，从人类诱导多能干细胞生成GABA能神经元

Stemgent Dox 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。本文演示了使用 DOX 诱导表达小鼠重编程转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的实验方案，以生成表达常见小鼠胚胎干细胞多能性标志物的 iPS...

利用四转录因子、多西环素诱导型慢病毒转导系统重编程小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

本视频演示了将拟胚体（EBs）分化为神经外胚层聚集体，并进一步将其分离为神经元和胶质细胞的过程。该方法可高效生成神经元和胶质细胞。...

从人诱导性多能干细胞衍生的拟胚体生成神经元和胶质细胞

本视频展示了通过转染携带受四环素反应元件调控的神经发生转录因子基因的工程化慢病毒，诱导人多能干细胞分化为神经元，并随后用四环素衍生物和成熟培养基处理的过程。...

利用基因工程慢病毒实现人多能干细胞向神经元的分化

该实验通过模拟人类发育过程中所经历的类似检查点，获得端脑神经元。细胞首先被允许自发分化，随后暴露于促使其向神经谱系分化的因子中，再经过分离后接种至盖玻片上，以促进其终末分化与成熟。...

从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

该方法展示了如何在发育中的小鼠前脑中靶向中间神经元 在子宫内...

皮层中间神经元亚型选择性电穿孔

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。...

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

模拟人类大脑发育一直受到神经上皮组织前所未有的复杂性的阻碍。本文介绍一种高效生成脑类器官的方法，用于解析人类大脑发育早期事件，并建立小头畸形模型。 体外 如上所述。...

生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外...

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

由于缺乏足够的工具和方法，神经退行性疾病中神经元与胶质细胞之间的相互作用尚未被充分理解。在此，我们描述了从人多能干细胞获得诱导神经元、少突胶质前体细胞以及少突胶质细胞的优化方案，并举例说明这些方法在理解阿尔茨海默病中细胞类型特异性贡献方面的应用价值。...

由多能干细胞生成人神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用

多能干细胞, 神经元, 少突胶质细胞, 细胞分化, 神经发育, 共培养, 神经退行性疾病, 人源细胞模型, 髓鞘形成, 神经胶质生物学

通过神经元编程方法获得的人多能干细胞来源的GABA能神经元移植，可能成为治疗神经发育障碍的一种潜在治疗策略。本方案描述了将人干细胞来源的GABA能神经前体细胞生成并移植至新生小鼠脑内的方法，可用于对移植物神经元进行长期研究，并评估其治疗潜力。...

将人干细胞来源的GABA能神经元移植至出生后早期小鼠海马以缓解神经发育障碍

了解利用多西环素诱导型ASCL1/DLX2在AAVS1位点表达，由人诱导性多能干细胞高效生成功能性GABA能神经元的标准化实验方案。该方法通过CRISPR/Cas9介导的基因敲入实现稳定可控的神经分化，为神经系统疾病体外建模提供可靠工具。

利用多西环素诱导型ASCL1/DLX2在AAVS1位点的表达由人诱导性多能干细胞生成GABA能神经元

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