Name: 一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学习使用明确水凝胶基质生成三维人乳腺类器官的方法，该方法可重现乳腺形态发生过程并支持上皮可塑性研究。此平台为乳腺癌早期事件研究提供了可扩展的生理学相关模型。

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我们衷心感谢塔夫茨生物医学库的 Karla Murga、Daniela Requena 和 Megan Maloney 在组织样本方面的支持。本研究由 Find The Cause 乳腺癌基金会和塔夫茨临床与转化科学研究所（NIH 临床与转化科学奖，编号 UM1TR0043，G.R.）资助。

本研究获取的原代组织均来自手术后按医疗废弃物处理的废弃组织，采集过程符合缅因医学中心和塔夫茨医学中心机构审查委员会批准的协议及相关法律法规。所有组织在转移前均已匿名化处理，无法追溯至特定患者。因此，麻省理工学院人类受试者使用委员会和塔夫茨大学健康科学学院（IRB #13521）认定本研究符合豁免资格。本研究中所有患者均签署了知情同意书，同意参与研究并同意研究成果的发表。
1. 组织处理与制备
注意：所有涉及人体组织的操作均须遵循机构的生物安全和伦理准则。在开始实验前，请参考图1A和1B所示的工作流程示意图，以直观了解实验步骤及类器官制备的整体流程。
<ol>
	<li>使用乳腺上皮基础培养基配制 MEGM，并添加 52 µg/mL 牛垂体提取物、10 ng/mL 人表皮生长因子、5 µg/mL 胰岛素、500 ng/mL 氢化可的松、1% (v/v) GlutaMAX 和 1% (v/v) 抗生素-抗真菌剂（100X）。</li>
	<li>在乳腺上皮生长培养基（MEGM）中加入 1.5 mg/mL 胶原酶 A（储存于 −20°C）和 100 U/mL 透明质酸酶（储存于 4°C），配制消化液。</li>
	<li>在切除后 24 小时内接收来自预防性乳房切除术和乳房缩小成形术的人乳腺组织，组织未用磷酸盐缓冲液（PBS）固定，并保持在 4°C。使用精密天平称量组织，确定总组织重量。</li>
	<li>将组织置于无菌生物安全柜中。使用无菌手术刀将组织机械切割成 3–5 mm3 的碎片。将约 2–3 g 切碎的组织转移至 15 mL 圆锥形离心管中。每管加入 10 mL 消化液。</li>
	<li>将离心管置于 37°C、8 rpm 的旋转摇床上孵育 12–18 小时，以酶解消化组织。当无大块组织碎片残留，且培养基中可见均匀分散的碎片悬浮液时，视为消化完成。</li>
	<li>静置 5 分钟，使上皮片段通过重力自然沉降。确认培养基中无可见悬浮碎片，并形成明显沉淀。小心倾去上清液并弃去，避免扰动沉淀。 
	注意：上清液含有间质细胞和基质成分，可经洗涤后用于或保存于其他研究。</li>
	<li>将沉淀重悬于 10 mL 洗涤液中，洗涤液由含 5% 胎牛血清（FBS）的 PBS 组成。在室温下，使用摆动转子离心机以 250 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>重复洗涤步骤三次，或直至上清液清澈且无可见残渣。</li>
	<li>将最终沉淀重悬于冷冻保存液中，冷冻液由 10% 二甲基亚砜（DMSO）溶于 MEGM 组成，每克初始组织重量加入 1 mL 冷冻液。 
	注意：DMSO 接触或吸入有害。操作时应佩戴适当的个人防护装备，并根据机构指南在化学安全通风柜中进行。</li>
	<li>将 1 mL 悬液分装至每个冻存管中。将冻存管置于 −80°C 冻存容器中，随后转移至液氮中进行长期保存。 
	注意：此步骤为暂停点。可在转移至长期保存条件前，将样品储存于 −80°C。</li>
</ol>
2. 细胞复苏与可选的细胞制备
<ol>
	<li>解冻与初始复苏
	<ol>
		<li>将冷冻保存的组织从 −80°C 冷冻至少 24 小时后，或从液氮长期保存中取出。立即将冻存管浸入 37°C 水浴中至管盖处，快速解冻约 1 分钟，以最大限度减少细胞死亡。 
		注意：解冻过程中应轻轻晃动冻存管，确保均匀升温。</li>
		<li>完全解冻后，立即将冻存管内容物转移至含有 10 mL MEGM 的 15 mL 圆锥形离心管中。在 250 × g 下离心 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：成纤维细胞去除 
	注意：通过预铺板法去除成纤维细胞是一个可选的富集步骤，用于减少快速贴壁的基质细胞或成纤维细胞群体，以获得更富集上皮细胞的起始细胞群。该步骤并非类器官形成所必需，可根据实验目的进行调整。
	<ol>
		<li>用 10 mL MEGM 重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将重悬的组织转移至 10 cm 细胞培养皿中。在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 90 分钟，使成纤维细胞贴壁。 
		注意：孵育期间请勿扰动培养皿，以确保成纤维细胞有效贴附。</li>
		<li>使用 10 mL 移液管轻轻倾斜培养皿约 45°，收集含有非贴壁细胞的上清液。用 5 mL PBS 轻轻冲洗培养皿，并将冲洗液与收集的上清液合并。</li>
		<li>将合并后的悬液在 250 × g 下离心 5 分钟，以回收富集上皮细胞的材料。 
		注意：贴壁于培养皿上的细胞富含乳腺成纤维细胞，可通过添加含 DMEM + 10% FBS 及抗生素的培养基单独传代培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：解离为单细胞
	<ol>
		<li>用 500 µL 预热至 37°C 的解离酶溶液（含 0.25% 胰蛋白酶）重悬细胞沉淀。其他解离试剂可能需要优化。将悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。使用 P1000 移液器吹打 20 次，促进组织解离。 
		注意：解离用酶试剂可能有害，请佩戴适当的个人防护装备操作，避免接触皮肤或眼睛。</li>
		<li>在 37°C 下孵育 3–5 分钟。孵育结束后立即使用 P1000 移液器吹打 20 次，进行机械解离。</li>
		<li>加入 1 mL 含血清的洗涤培养基以中和酶反应。在 500 × g 下离心 5 分钟。</li>
		<li>用 300 µL dispase 溶液（5 U/mL）和 30 µL DNase 溶液（1 mg/mL）重悬细胞沉淀。在 37°C 下孵育 3–5 分钟。</li>
		<li>通过移液吹打 15–20 次进行机械解离。向悬液中加入 700 µL 含血清的洗涤培养基。</li>
		<li>将细胞悬液通过 40 µm 细胞滤器过滤至洁净离心管中。可使用标准 40 µm 细胞滤器或 Flowmi 枪头式滤器。当细胞数量有限时，Flowmi 滤器可减少样本损失。</li>
		<li>使用台盼蓝排斥法测定活细胞数量。取 10 µL 细胞悬液与台盼蓝按 1:1 比例混合，取 10 µL 混合液加入细胞计数板或计数载玻片中。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞活力。</li>
		<li>在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用 MEGM 将细胞沉淀重悬至适合水凝胶接种的浓度。 
		注意：对于单细胞接种实验，每 200 µL 水凝胶通常接种约 1,000–5,000 个细胞，具体数量取决于实验目的和供体样本特性。活细胞成像和形态发生研究通常采用较低接种密度，以便追踪单个类器官的发育过程；而终点分子分析（如 RNA 和蛋白质收集）则常采用较高密度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 水凝胶制备与类器官接种
<ol>
	<li>储备液制备与体积计算
	<ol>
		<li>使用前将层粘连蛋白溶液（1.18 mg/mL）、透明质酸溶液（1 mg/mL，溶于无菌水）、纤连蛋白溶液（2 mg/mL，溶于无菌水）以及1× PBS 置于冰上。层粘连蛋白和纤连蛋白分装后储存于 −80°C，透明质酸溶液储存于 4°C。使用前在冰上缓慢解冻（0°C–4°C）。</li>
		<li>制备25×细胞外基质补充剂储备液。配制1 mL时，在冰上放置的离心管中加入425 µL 层粘连蛋白、250 µL 透明质酸、250 µL 纤连蛋白和75 µL PBS。轻轻翻转混匀3–4次。溶液可于4°C保存最多1个月。</li>
		<li>制备前确定所需最终水凝胶体积和组成。建议至少多准备20%体积，以补偿移液和转移过程中的损失。 
		注：水凝胶配方包含I型胶原、细胞外基质补充剂（由25×储备液稀释至终浓度1×），以及相对于I型胶原体积12.5%（v/v）的0.1 N 氢氧化钠，用于pH中和与聚合。 
		注：最终水凝胶中各成分浓度为：1.7 mg/mL I型胶原、20 µg/mL 层粘连蛋白、20 µg/mL 纤连蛋白和10 µg/mL 透明质酸。</li>
		<li>使用以下公式计算所需I型胶原体积（Vcollagen）： 
		<img alt="胶原体积计算公式 Vcollagen=Cfinal×Vtotal/Cstock；浓度与稀释公式。" src="/files/ftp_upload/71831/71831eq1.jpg" style="margin:auto;" data-altupdatedat="1790654420000" data-alt="公式 1"> 
		其中，Cfinal  = 1.7 mg/mL，Vtotal 为所需最终水凝胶体积，Cstock为胶原储备液浓度。胶原储备液浓度建议在2–12 mg/mL范围内使用。 
		注：不同批次胶原储备液浓度可能不同。浓度越高，黏度越大，移液时应缓慢操作。</li>
		<li>使用以下公式计算0.1 N 氢氧化钠体积（VNaOH）： 
		VNaOH = 0.125 × Vcollagen 
		通过将1 N 氢氧化钠用无菌水稀释，制备0.1 N 氢氧化钠工作液。</li>
		<li>使用以下公式计算细胞外基质补充剂体积（VES）： 
		<img alt="静电势方程，公式 V_ES=V_total/25，用于教学研究工具。" src="/files/ftp_upload/71831/71831eq2.jpg" style="margin:auto;" data-altupdatedat="1790654420000" data-alt="公式 2"></li>
		<li>使用以下公式计算需用生长培养基补充的剩余体积： 
		V生长培养基 = Vtotal − (Vcollagen + VNaOH + VES + V细胞/组织) 
		注：每次实验需单独确定细胞或组织碎片的体积。通常在允许范围内使用10–100 µL。由于不同制备样品中碎片大小和组成差异较大，不进行精确计数。通过肉眼评估碎片密度与分布情况，以标准化接种量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>水凝胶主混合液的制备
	<ol>
		<li>将I型胶原、细胞外基质补充剂、0.1 N 氢氧化钠和生长培养基置于0°C–4°C冰上。所有组分均需保持低温，以防提前聚合。</li>
		<li>将计算好的I型胶原体积加入预冷的微量离心管中。</li>
		<li>将计算好的预冷生长培养基体积加入胶原溶液中。</li>
		<li>加入计算好的0.1 N 氢氧化钠体积以中和溶液。 
		注：前期优化已证实该条件可达到合适的凝胶pH值，因此无需常规检测水凝胶混合液的pH。 
		注：后续所有步骤应迅速完成，以防胶原提前聚合。</li>
		<li>通过剧烈振荡混匀溶液，频率约为每秒一次，持续至少6次振荡。</li>
		<li>加入计算好的细胞外基质补充剂体积至混合液中。</li>
		<li>使用P1000移液器或宽口吸头，加入计算好的单细胞或组织碎片体积。立即按步骤3.2.5所述方式振荡混匀，并立即进入下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>水凝胶沉积
	<ol>
		<li>将水凝胶混合液按所需体积移液至培养容器中。4孔板每孔使用200 µL，8孔板每孔使用100 µL，96孔板每孔使用20 µL。</li>
		<li>使用腔室载玻片时，将水凝胶铺展成均匀薄层。将移液器吸头置于腔室孔的上边缘中央，边加样边沿表面拖动吸头，形成均匀薄层。使用96孔板时，将吸头置于孔中央并保持与孔底接触，中央加样以维持半球状结构。避免将空气吸入凝胶中，以防产生气泡。</li>
		<li>将培养容器置于37°C、5% CO2的湿润培养箱中孵育60分钟，以完成完全聚合。 
		注：此处描述的聚合条件已针对本研究所用培养格式进行优化。根据培养容器几何形状、水凝胶体积及孵育条件的不同，可能需要对聚合时间进行微调。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养与维护
	<ol>
		<li>向每孔加入预热的MEGM培养基。根据所用培养格式调整体积。</li>
		<li>使用移液器吸头轻轻将水凝胶从培养表面剥离，使其漂浮。将吸头沿凝胶边缘滑动，并轻轻插入聚合后的水凝胶下方，将其从表面抬起。</li>
		<li>每周两次更换新鲜预热的MEGM培养基。将培养物维持在37°C、5% CO₂湿润培养箱中约3–4周，并在水凝胶完全塌陷前终止培养。水凝胶塌陷表现为内部细胞大量迁移生长后形成的致密、不透明、栓塞样结构（参见补充图1中的代表性示例）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

C.K. 是 Naveris 的联合创始人兼顾问。

本文所述方案可在特定水凝胶微环境中可重复地生成三维人乳腺类器官，该环境支持乳腺形态发生的关键特征3。该方法的成功依赖于多个关键步骤。首先，组织处理和酶解离过程必须严格控制，以在保持上皮细胞活性的同时尽量减少过度消化，后者可能降低细胞得率并损害后续的形态发生过程10。特别是，短暂且分步的酶处理结合轻柔的机械解离，对于维持功能性上皮细胞群体至关重要。其次，水凝胶的制备需要精确控制胶原蛋白浓度、pH值和操作时间11。胶原蛋白的中和会启动其聚合反应，因此在加入氢氧化钠后所有操作必须迅速并在冰上进行，以确保凝胶形成的稳定性。聚合不完全或延迟可能导致结构不良或塌陷的水凝胶，无法支持类器官的发育。最后，接种密度需根据每个供体样本进行经验性优化，因为组织或细胞密度过高可导致凝胶快速收缩并丧失结构完整性12。
有几点故障排除建议可提高实验的可重复性。类器官形成效果不佳可能源于细胞活力低下、水凝胶成分次优或沉积过...

要理解人类乳腺腺体的发育过程以及导致组织发生恶性转化的早期事件，需要依赖能够真实重现组织结构、细胞层级和微环境信号的实验体系。尽管二维上皮细胞培养体系已提供了重要的机制性见解，但它们缺乏模拟上皮组织结构和形态发生所必需的结构背景1。现有的三维培养体系（包括基于基底膜提取物的体系）虽然推动了该领域的发展，但仍受限于成分的不稳定性、对细胞外基质组分控制不完全，以及对高阶组织结构支持不一致等问题1。此外，许多基于基底膜提取物的类器官体系受限于无法持续支持类似组织的有序结构形成1。特别是，许多体系依赖外源性间质成分，而非支持微环境的内源性发育，从而限制了其对在组织发育和疾病中起核心作用的上皮-间质相互作用的建模能力。这些局限性制约了对发育过程、上皮可塑性以及环境或分子干扰对组织结构影响的可重复性研究。
为克服这些局限性，我们开发了一种基于明确成分水凝胶的三维人乳腺类器官模型，该模型可支持原代上皮细胞在明确组成的细胞外基质中形成有序结构2,3,4,5,8。该水凝胶包含I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和透明质酸，这些成分的选择基于其在乳腺发育和上皮形态发生中的已知作用。这些细胞外基质分子可与不同的细胞受体结合，包括整合素、盘状结构域受体、CD44和RHAMM，已知可调控乳腺中的上皮极性、分支形态发生、干细胞维持、机械信号转导以及组织结构6,7。先前关于该水凝胶系统的研究表明，与仅含胶原或基于Matrigel的条件相比，加入这些细胞外基质组分显著改善了导管-小叶的形态发生和上皮成熟3,8。此外，该水凝胶配方的物理特性此前已通过原子力显微镜进行表征，结果显示复合细胞外基质水凝胶相较于仅含胶原的凝胶具有更低的刚度和更高的溶胀性（杨氏模量：256.7 ± 20.0 Pa 对比 559.2 ± 204.0 Pa），表明其具有更柔软且更富水的基质环境8。
重要的是，该模型支持类间充质区室的形成，该区室与上皮结构并行出现，提供了内源性的结构和信号支持，更接近天然组织的结构特征3。该水凝胶系统的生理相关性已通过与传统的Matrigel类器官培养体系在形态学和转录组水平上的直接比较得到评估。早期研究表明，与基于Matrigel的培养相比，水凝胶培养支持更有序的导管-小叶组织形成和多谱系分化，同时保留了激素反应性8。最近，整合的单细胞RNA测序分析对水凝胶来源的类器官、Matrigel培养的类器官以及原代人乳腺组织进行了比较，结果表明，水凝胶培养的类器官更能忠实地再现天然人乳腺组织中存在的上皮层级结构、细胞多样性以及上皮-间充质相互作用3。相比之下，Matrigel培养的类器官富集了增殖性混合基底样状态，并缺乏类间质细胞群，这与上皮细胞的自我组装而非定向器官发生过程一致。
本文所述方案提供了一种可重复且可放大的方法，用于从原代人体组织中生成类器官，并包含可选的成纤维细胞去除及单细胞解离步骤。由于该平台兼容活细胞成像、高内涵成像、定量形态计量分析、细胞追踪以及基因扰动研究，因此可与下游方法整合，用于评估类器官数量、大小、结构及生长动态。该平台因而为研究人类乳腺发育、上皮可塑性、上皮-微环境相互作用以及组织水平对发育、分子或环境扰动的响应提供了具有生物学相关性的系统。
工作流程的示意图概述了包括组织处理、水凝胶制备、类器官培养、发育进程及下游分析在内的各个步骤，如图1所示，而该平台生成的代表性类器官形态如图2所示。
<img alt="乳腺组织处理和类器官培养示意图，包括水凝胶制备和分析步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71831/71831fig1.jpg" data-altupdatedat="1790654420000" data-alt="图1"> 
图1．基于水凝胶的类器官生成工作流程概览。（A）流程图总结了本实验方案的工作流程，包括组织采集、组织处理、冷冻保存、复苏及可选的细胞制备、水凝胶制备、类器官培养、类器官发育以及后续分析应用。（B）示意图展示了基于水凝胶的类器官生成方案的主要阶段，包括组织处理与准备、复苏及可选的细胞制备、以及水凝胶制备与类器官接种。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71831/71831fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="乳腺肿瘤与正常乳腺形态学对比显微镜图像；唾液腺、肾细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71831/71831fig2.jpg" data-altupdatedat="1790654420000" data-alt="图 2"> 
图 2。在确定性水凝胶系统中生成的代表性类器官形态。 在确定性水凝胶基质中培养的不同人源组织来源类器官的代表性明场图像。来源于缩乳手术获取的单个上皮细胞的乳腺类器官在培养第21天进行成像。来源于肿瘤组织碎片的患者来源异种移植类器官在培养第16天进行成像。来源于上皮组织碎片的唾液腺类器官在培养第3天进行成像。来源于上皮组织碎片的肾类器官在培养第17天进行成像。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71831/71831fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>用于组织处理和离心的无菌管</td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td>用于制备单细胞悬液的过滤装置</td></tr><tr><td>适用于小体积样品的 40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Bel-Art</td><td>136800040</td><td>用于制备单细胞悬液的过滤装置</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>用于细胞计数和活力测定的设备</td></tr><tr><td>牛垂体提取物</td><td>Thermo Scientific</td><td>13028014</td><td>上皮细胞培养基的添加剂</td></tr><tr><td>细胞计数载玻片</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td>双腔载玻片，用于细胞计数</td></tr><tr><td>离心机</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>台式离心机需具备至少 500 × g 的转速能力，并能容纳 15 mL 和 1.5 mL 离心管。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胶原蛋白 I</td><td>Millipore Sigma</td><td>08-115</td><td>用于水凝胶形成的细胞外基质蛋白</td></tr><tr><td>胶原酶 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088793001</td><td>用于组织解离的酶</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Corning</td><td>976171</td><td>用于样本低温保存的无菌小瓶</td></tr><tr><td>培养容器（例如，腔室载玻片、多孔板）</td><td>Corning</td><td>354104&lt;br/&gt; 354108&lt;br/&gt; 3603</td><td>用于水凝胶沉积和类器官培养的平台。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Millipore Sigma</td><td>317275</td><td>冷冻保存液中的冷冻保护剂</td></tr><tr><td>分散酶 II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>用于二次组织解离的酶</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td>细胞解离过程中使用的酶。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>洗涤液和中和液中使用的血清添加剂</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td>细胞外基质蛋白组分</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>上皮细胞培养基的添加剂</td></tr><tr><td>人表皮生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>上皮细胞培养基的添加剂</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>上皮细胞培养基的添加剂</td></tr><tr><td>透明质酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>385908</td><td>用于水凝胶配制的细胞外基质组分</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>用于组织解离的酶</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>3598</td><td>用于组织培养孵育的设备</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td>上皮细胞培养基的添加剂</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>细胞外基质蛋白组分</td></tr><tr><td>乳腺上皮基础培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>M171500</td><td>上皮细胞的生长培养基</td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Thermo Scientific</td><td>3451</td><td>用于小体积反应的管子</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>400110</td><td>用于酶解过程中组织分散的摇床</td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td>用于混合和转移最大 1,000 &amp;mu;L 体积的设备</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>上皮细胞培养基的抗生素添加剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>用于洗涤和冲洗的缓冲溶液</td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML303E</td><td>用于组织称重的天平</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Nunc</td><td>170356N</td><td>用于收获非贴壁上皮细胞的移液管</td></tr><tr><td>氢氧化钠（1 N）</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS261</td><td>用于胶原蛋白中和的试剂</td></tr><tr><td>无菌手术刀</td><td>Bard-Parker</td><td>372615</td><td>用于机械性组织切碎的工具</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>用于细胞活力评估的染料</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（0.25%）</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>用于细胞解离的酶解试剂</td></tr><tr><td>水浴锅（37 &amp;deg;C）</td><td>VWR</td><td>10LA</td><td>用于样本受控解冻的设备</td></tr></tbody></table>

一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

A Defined Hydrogel-Based Method For Generating Three-Dimensional Human Breast Organoids That Recapitulate Mammary Morphogenesis

开发能够重现组织结构和细胞状态动态变化的、具有生理相关性的人体模型系统，仍是研究乳腺发育及癌变早期事件的主要挑战。传统的二维培养体系以及许多三维培养系统均无法模拟定义人体乳腺组织的结构组织和微环境信号。本文介绍一种可重复的方法，用于从嵌入于特定水凝胶基质中的原代上皮细胞生成三维人乳腺类器官，该基质由I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和透明质酸组成。该体系支持单个细胞在21天的培养周期内经历乳腺形态发生的关键阶段，包括前体细胞扩增、上皮模式形成、终末导管小叶单元样结构的形成，以及类间充质区室的出现。我们提供了一套水凝胶制备、细胞接种和&#160;培养条件的逐步操作方案。该方法适用于高内涵成像以及对类器官数量、大小分布和结构复杂性的定量分析。该平台可用于上皮可塑性及环境扰动的机制研究，为探究与乳腺癌风险相关的早期组织水平变化提供了一个可扩展且具有生物学相关性的系统。

成功执行本方案可形成具有有序上皮形态和组织特异性结构特征的三维类器官结构。类器官在接种后3–7天内开始形成，并在培养期间持续发育。此前对该水凝胶类器官系统的表征研究表明，在多个独立的人类原代供体中，类器官的形成具有可重复性3。在该研究中，研究人员评估了来自12名无疾病史的乳房缩小成形术供体的原代上皮细胞，其中12个供体样本中有11个在所述培养条件下成功生成了类器官。在不同供体之间，每100个接种细胞形成的类器官结构中位数为1.775个（95%置信区间：0.45–4.10）。尽管在类器官形成效率和生长动力学方面观察到显著的供体间差异，但在不同供体中均能可重复地生成复杂的导管-小叶和腺泡样形态。
由单个上皮细胞衍生的乳腺类器官表现出渐进的形态发生，在培养第21天时形成分支结构（图2）。这些结构具有细长的突起和多细胞组织特征。到培养第18天时，类器官的投影面积范围为10,000–90,000 µm2，圆形度值低于0.3，计算公式为4π × (面积/周长<sup...

本方案描述了一种基于明确成分水凝胶的方法，可在可控的三维培养系统中生成模拟乳腺形态发生关键特征的人类乳腺类器官。

构建能够重现组织结构和细胞状态动态且具有生理相关性的人体模型系统，仍是……领域的一大挑战

我们的研究聚焦于人类乳腺发育与泌乳、组织结构、环境暴露以及导致癌症生物学变化的遗传因素。现有模型无法准确模拟人类乳腺组织结构、发育时序及微环境。本方案在人类体系中弥合了二维模型与动物模型之间的差距。获取至少冷冻保存24小时的人体消化乳腺组织。立即将冻存管浸入37摄氏度水浴中至管盖处，快速解冻1分钟，以尽量减少细胞死亡。完全解冻后，将冻存管中的内容物转移至含有10毫升乳腺上皮细胞生长培养基（MEGM）的15毫升锥形管中，在250g条件下离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于500 µL预热至37°C、含0.25%胰蛋白酶的消化酶溶液中。将悬液转移至1.5 mL微量离心管中。使用P1000移液器吹打样品20次，以促进组织解离。将离心管在 37 摄氏度下孵育三至五分钟。使用 P1000 移液器，通过吹打 20 至 30 次对样品进行机械解离。加入一毫升含血清的洗涤培养基以中和酶反应。在500g条件下离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于300 µL分散酶溶液中。加入30 µL DNA溶液，在37°C孵育3至5分钟。通过移液吹打15至20次，机械解离样品。向细胞悬液中加入700微升含血清的洗涤培养基。将细胞悬液经40微米细胞滤网过滤至洁净离心管中。取10微升细胞悬液与等体积的台盼蓝混合。将10微升混合液加入自动细胞计数仪中，测定细胞活力。在室温下以500×g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 MEGM 中，调整至水凝胶接种所需的浓度。使用前，将冷冻保存的层粘连蛋白、透明质酸和纤连蛋白溶液以及 PBS 在 0 至 4 摄氏度的冰上缓慢解冻。配制细胞外基质（ECM）补充剂的储备液。轻轻翻转离心管三至四次以混匀。将溶液在4 °C下保存，最多可保存一个月，避免反复冻融。将胶原蛋白1、细胞外基质补充剂、氢氧化钠和生长培养基置于0至4 °C的冰上，以防止提前聚合。将计算好的胶原蛋白1体积加入预冷的微量离心管中，随后加入预冷的培养基和0.1 N氢氧化钠以中和溶液。通过剧烈振荡试管六次混匀溶液。将计算好的细胞外基质补充剂体积加入该混合物中。使用 P200 移液器或宽口移液器吸头，加入计算体积的单细胞或组织碎片。立即按照先前演示的方法通过振荡充分混匀。将水凝胶混合物按每孔所需体积移入培养容器中。使用腔室载玻片时，将水凝胶均匀铺展成薄层。将移液器吸头置于腔室孔的上缘中央位置，在 dispensing 凝胶的同时沿表面拖动，以形成均匀的凝胶层。对于 96 孔板，将移液器吸头置于孔的中心位置，保持与孔底接触，并在中心区域释放凝胶，以维持其圆顶状结构。将培养容器置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，在37摄氏度下孵育60分钟，以确保完全聚合。向每孔中加入预热的MEGM，并根据所用的培养格式调整体积。使用移液器吸头轻轻将水凝胶从培养表面分离，使凝胶漂浮。将移液器吸头沿凝胶边缘滑动，轻轻从

a-defined-hydrogel-based-method-for-generating-three-dimensional

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

一种定义的基于水凝胶的方法，用于生成三维人体乳腺类器官，以重现乳腺形态发生

我们描述了一种适用于研究激素作用的人类乳腺上皮三维培养模型。...

一种激素响应性的人类乳腺上皮三维培养模型

本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。...

在细胞外基质中构建三维上皮组织

由小鼠乳腺组织开发的类器官经辐射处理后进行表征，以评估上皮特性及其与免疫细胞的相互作用。经辐射的类器官可用于更有效地评估可能引起肿瘤细胞在辐射正常组织中募集的细胞间相互作用。...

乳腺组织类器官的培养及辐照后表征

本文介绍了一种生成人原代子宫内膜类器官的方案，该类器官包含上皮细胞和间质细胞，并保留了天然子宫内膜组织的特性。本方案详细描述了从子宫组织获取到子宫内膜类器官组织学处理的全过程。...

人原代子宫内膜类器官的多细胞生成

乳腺是一种双层结构，由外层的肌上皮细胞和内层的腔面 epithelial...

通过差异性胰蛋白酶消化法生成嵌合型乳腺类器官

本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。...

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

本方案介绍了一种通过差速离心法从原代正常及肿瘤乳腺组织中生成上皮类器官的方法。此外，还包括对包埋类器官进行三维培养以及免疫荧光成像的操作说明。...

无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

在三维纤维蛋白水凝胶中形成功能性人胸腺类器官

迫切需要能够模拟异质细胞间串扰的三维癌症模型来研究癌症转移。本研究展示了在有支架和无支架环境中构建异质多细胞间质-上皮模型的方法，可用于研究细胞侵袭行为及空间分布特征。...

无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

学习使用明确水凝胶基质生成三维人乳腺类器官的方法，该方法可重现乳腺形态发生过程并支持上皮可塑性研究。此平台为乳腺癌早期事件研究提供了可扩展的生理学相关模型。

一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

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